专利名称：一种肝癌风险基因测评方法及套组的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肝癌风险基因测评方法及套组，更具体地说是测定人各肝癌易感 基因中的多态性位点基因型，预测受试者患肝癌的风险几率，该方法可用于疾病的预测、辅 助诊断、治疗和新药研发，属于医学生物技术和基因诊断领域。
背景技术：
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，常见于45岁以上的中老年人群。肝癌的发生与肝炎 (尤其是乙肝)、肝硬化等疾病息息相关。全世界人群中肝癌的发病率为6. 6/10万，其中男 性的发病率为10. 2/10万，女性为3. 6/10万。在我国，肝癌的发病率和死亡率虽低于肺癌、 乳腺癌、胃癌等肿瘤，但在在过去20年间显著上升，目前年死亡率高达约20/10万，约占全 世界肝癌死亡率的一半。目前，疾病的遗传易感性检测是国内外科学研究的热点。而在遗传因素易感性的 研究中，采用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)作为基因组标志的 关联分析方法较为有效和常用。SNP是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列 多态性，在人群中的发生频率大于1%。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已 知多态性的90%以上。同微卫星多态性比较而言，SNP遗传稳定性强，易于检测。检测时能 通过简单的“+\_”进行基因分型，是理想的遗传标志。位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、 器官乃至生理活动。在肝癌人群和正常对照人群中进行SNP对比分析，可以确定SNP为点 和(或)邻近变异与肿瘤发病风险的关系，因而可应用于肝癌遗传易感性的研究。本发明 涉及到的肝癌易感基因和位点包括表1肝癌易感基因和位点
权利要求
1.一种肝癌风险基因测评方法及套组，包括步骤(1)提取受检者样本DNA;(2)对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记，所述目的基因 包括 CDC6、CTLA-4、CYPlAl、CYP1A2、DLCl、GRP78、HSPA1B、IL-18、IL-1 β、MDM2、MIR_146A、 MTHFR、MTRR、TGF- β 1、TNF- α 禾口 ΤΡ53 基因；(3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点，得到基因分型结果。(4)根据步骤3)得到的基因分型结果，分析受检者肝癌的风险率。
2.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述步骤O)中 的⑶C6基因的引物是SEQ ID NO 41 42所示序列的引物，CTLA-4基因的引物是SEQ IDNO :43 44所示序列的引物，CYPlAl基因的引物是SEQ ID NO :45 52所示序列的引物， CYP1A2基因的引物是SEQ ID NO :53 M所示序列的引物，DLCl基因的引物是SEQ IDNO 55 56所示序列的引物，GRP78基因的引物是SEQ ID NO 57 58所示序列的引物，HSPAlB 基因的引物是SEQ ID NO :59 60所示序列的引物，IL-18基因的引物是SEQ IDNO :61 62所示序列的引物，IL-I β基因的引物是SEQ ID NO :63 64所示序列的引物，MDM2基因 的引物是SEQ ID Ν0:65 66所示序列的引物，MIR-146A基因的引物是SEQID NO :67 68所示序列的引物，MTHFR基因的引物是SEQ ID NO 69 70所示序列的引物，MTRR基因 的引物是SEQ ID NO :71 72所示序列的引物，TGF-β 1基因的引物是SEQID NO :73 74 所示序列的引物，TNF-α基因的引物是SEQ ID NO :75 78所示序列的引物，ΤΡ53基因的 引物是SEQ ID NO 79 80所示序列的引物。
3.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述步骤⑵中 的片段化是将纯化的PCR产物经浓度测定后，用DNase I进行片段化；所述荧光素标记是将 片段化PCR产物利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记。
4.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述步骤(3)基 因芯片的制备是将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片或 硅片材质的固相载体片基上，其中，探针是SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :40所示序列的DNA 探针。
5.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述步骤(3) 目的基因的SNP为点包括CDC6基因的rs4134994位点，CTLA-4基因的rs23. 1775位 点，CYPlAl 基因的 rs4646421、rs2198843、rs4886605 和 rsl048943 位点，CYP1A2 基因的 rs2069514位点，DLCl基因的rs621554位点，GRP78基因的rs430397位点，HSPAlB基因的 rsl061581位点，IL-18基因的rsl87238位点，IL-1 β基因的rsl 143627位点，MDM2基因的 rs2279744 位点，MIR-146A 基因的 rs2910164 位点，MTHFR 基因的 rsl801131 位点，MTRR 基因 Wrsl80139Ml6，TGF-3 1 基因的 rsl800469 位点，TNF-α 基因的 rsl799724 和 rs361525 位点及TP53基因的rsl042522位点。
6.如权利要求1所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述步骤(4)中 的基因分型结果导入肝癌评估软件进行受检者肝癌风险指数和风险率评估。
7.如权利要求1或6所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述肝癌风 险指数评估标准一个易感基因为+1分；一个保护基因为-1分；无易感基因和保护基因为0分；60岁及以上+3分；肿瘤家族史为+2分；HBV感染+3分；其中，易感基因是指增加个体 肝癌风险性的基因，其比数比大于1 ；保护基因是指降低个体肝癌风险性的基因，其比数比 小于1。
8.如权利要求7所述的肝癌风险基因测评方法及套组，其特征在于所述风险率评估 标准肝癌风险指数1 3分，个体患肝癌的风险为中度；肝癌风险指数4 6分，个体患肝 癌的风险为高度；肝癌风险指数6分以上，患肝癌的风险为极高度。
全文摘要
本发明公开了一种肝癌风险基因测评方法及套组，包括步骤1)提取受检者样本DNA；2)对样本DNA进行目的基因的PCR扩增、纯化、片段化及荧光素标记；3)荧光素标记的PCR产物进行基因芯片杂交，检测目的基因的SNP位点；4)根据步骤3)得到的基因分型结果，分析受检者肝癌的风险率。通过相关基因分型，可以对受检者进行肝癌风险预估，从而制订最科学健康管理计划，降低甚或避免肝癌发生。
文档编号C12Q1/68GK102041301SQ20091019742
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者盛海辉, 郜恒骏, 陈然 申请人:上海芯超生物科技有限公司