专利名称：acyB1基因中断菌株的构建及其转化泰乐菌素的方法
技术领域：
本发明公开了一种耐热链霉菌基因工程菌，以及用该菌转化泰乐菌素为乙酰泰乐 菌素的方法。根据已报道的基因序列信息设计引物，从耐热链霉菌基因组DNA中将含有 acyBl基因的基因片段克隆下来，得到含有acyBl基因片段的重组载体；通过SOE-PCR技术 构建acyBl基因被破坏了的重组载体；通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移，将这个载体导 入耐热链霉菌中；通过同源重组、抗性筛选、PCR验证和HPLC-MS分析得到acyBl基因被破 坏的耐热链霉菌基因突变株；将这个基因突变株转化大环内酯类抗生素，得到乙酰大环内 酯类抗生素。本研究工作为大环内酯类抗生素进行专一性酰基化改造建立了一个平台。
背景技术：
耐热链霉菌是一种具有非常重要工业价值的链霉菌，其重要性不在于其所产生的 次级代谢产物碳霉素，而在于它生物转化泰乐菌素生产乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)。AIV是 一种重要的泰乐菌素衍生物，主要用于治疗畜禽的支原体感染疾病。已有的研究表明分别 负责乙酰基化和异戊酰基化功能的基因为acyA基因和acyBl基因，以及acyBl的正调节基 因acyB2。acy和aCyBl_B2已经相继在异源宿主中，如在变铅青链霉菌和弗氏链霉菌中表 达。在弗氏链霉菌中，通过质粒游离表达了 aCyA-aCyBl-aCyB2基因，得到了预期的AIVdfi 是产量距离工业化生产还比较远。链霉菌中已经发展了非常成熟的基因克隆和功能分析系统，其中最为常用的是基 于同源重组的基因中断和基因置换技术，其基本原理如图1所示。用作基因置换的质粒上携带有两个长度合适而且与天然方向一致的染色体片段 A、B。片段之间插入有在链霉菌中表达的抗性基因D，同时载体部分也含有在链霉菌中表达 的抗性基因E。相应的，染色体上的同源片段为A、B，C则为A和B之间将要被抗性基因D 置换的目的片段。基因置换是在抗生素的选择压力下，以单拷贝或低拷贝的形式发生的， 因此质粒在受体菌中一般是不复制的。质粒通常采用的形式有几种，如只在大肠杆菌中复 制的单功能载体，温度敏型质粒或复制及稳定功能有缺陷的质粒。当质粒转入受体菌时，可 通过单抗或双抗筛选获得发生单交换的转化子，质粒这时通过与染色体上同源片段之间的 重组而整合到染色体上。将上述转化子在松弛条件下生长一代或几代，可大大提高二次交 换发生的频率，然后通过影印或者点种在两种不同抗生素平板上，挑取只对插入抗性标记D 敏感的转化子即可能为发生基因中断或置换的菌株。若A、B直接相连，最后得到的染色体 结构是抗性标记插入A、B之间而将有关基因打断，称为基因中断；若A、B中间由C片段隔 开，最后得到的染色体结构是抗性标记置换C片段而将基因打断，称为基因置换。
发明内容
本研究的主要目的就是通过基因中断的方法，构建acyBl基因被中断的耐热链霉 菌基因重组菌株，得到只具有乙酰基化功能的耐热链霉菌基因工程重组菌株，为大环内酯 类抗生素酰基化平台的建立提供“核心部件”。该菌现已于2009年7月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物所； 邮编100101)，保藏编号为 CGMCC No. 3193，分类命名为 Sti^ptomyces thermotoIerans0本发明的另一个目的在于，提供一种上述基因工程菌的构建方法，即通过SOE-PCR 技术构建acyBl基因被破坏了的重组载体。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案—方面，本发明所提供的只具有乙酰化泰乐菌素功能的耐热链霉菌基因工程菌， 是通过中断acyBl基因而得到的。已有的研究表明分别负责乙酰基化和异戊酰基化功能的基因为acyA基因和 acyBl基因，将acyBl基因中断后，得到只能乙酰化泰乐菌素的耐热链霉菌。另一方面，本发明提供了构建acyBl基因被破坏了的重组载体的方法，再通过大 肠杆菌-链霉菌属间接合转移，将这个载体导入耐热链霉菌中。acyBl基因被破坏了的重组 载体是通过SOE-PCR技术构建成的，其中包括以下步骤IacyBl基因中断两侧交换臂及acc (3) IV抗性盒PCR扩增根据已公布的acyBl 基因及其两侧基因序列，以耐热链霉菌基因组DNA为模板，设计两对引物分别扩增acyBl 基因被中断序列两侧1. 4kb左右的交换臂，再以质粒PIJ773为模板，设计一对引物扩增含 有安普霉素抗性基因aac (3) IV和接合转移起始位点oriT的抗性基因中断盒。反应条件 950C 45s, 660C 60s, 72°C 90s，30Cycles ；72°C延伸5min。反应完成后，电泳检测到三条约 1. 4kb的DNA片段。2S0E-PCR构建acyBl基因中断结构扩增得到的PCR产物经凝胶电泳纯化回收 定量后进行 S0E-PCR，反应条件:95°C 45s, 72°C 6min, 30Cycles ；72°C 延伸 IOmin0 反应完 成后，电泳检测到一条4. 2kb的DNA片段，所得到的PCR产物经DNA回收试剂盒回收纯化， BglII酶切后插入pIJ2925的BmaHI位点中。通过安普霉素抗性筛选，得到若干acyBl基因 发生中断的阳性克隆子，命名为PZM2009。3acyBl基因中断载体的构建选用了 SuperCosl作为基因置换载体。将pZM2009 经BglII酶切后回收4. 2kb的片段插入SuperCosl载体中，相应得到acyBl基因中断载体 PZM2010。^cyBl基因中断载体导入耐热链霉菌1)将pZM2010转化大肠杆菌ET12567/ PUZ8002 ；接种Iml耐热链霉菌菌丝体于9ml YEME培养基中，34°C培养18h ；2)用超声波处理耐热链霉菌菌丝体，转接2ml培养物于18ml新鲜TSB培养基中继 续于34°C培养继续培养16h。同时挑取一大肠杆菌转化子于含有安普霉素(Am)、卡那霉素 (Km)、氯霉素(Cml)的LB培养基中37°C培养16h ；3)用超声波处理耐热链霉菌菌丝体，转接Iml培养物于9ml新鲜TSB培养基，于 34°C继续培养3 4h。同时转接大肠杆菌培养物于加了上述三种抗生素的新鲜LB培养基 中培养3 4h ；同时收集链霉菌菌丝体和大肠杆菌培养物，3500rpm离心IOmin去上清，收 集菌体，用新鲜TSB悬浮菌体。3500rpm再离心10分钟去上清，用1/10体积的TSB悬浮菌 体；4)对链霉菌菌丝体进行适度的稀释，选择合适的稀释度，将大肠杆菌和链霉菌菌 丝等体积混合后涂布于YEME培养基，于34°C培养18 20小时；5)从34°C培养箱中取出培养物，用含安普霉素(1000yg/ml)和萘啶酮酸 (500 μ g/ml)的Iml无菌水覆盖。3 5天后平板上长出5 30个数量不等的抗性菌落。4
5筛选acyBl基因中断双交换菌株挑取若干抗性菌落，分别涂布加入了安普霉 素的抗性平板和卡那霉素的抗性平板。不需要通过放松培养，可直接筛选得到了 acyBl基 因中断的双交换菌株，双交换频率> 10%，所得到的突变株命名为ZM7。本发明还提供了一种耐热链霉菌生物转化泰乐菌素的方法，其具体步骤如下1种子培养方法从改良高氏一号培养基上挑取ZM7单菌落，接入一级种子摇瓶 培养基中，种子摇瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，30°C摇床，200RPM培养48hr左右。取 0. 2ml 一级种子培养液转接于二级种子培养基中，30°C摇瓶，200RPM培养Mhr左右。2发酵转化方法取3ml 二级种子培养液接种于发酵摇瓶培养基中，发酵摇瓶培 养基装量为50ml/500ml摇瓶，30°C发酵48hr后，向培养液中加入泰乐菌素底物，继续转化 48hr左右后，下摇床。3液相检测泰乐菌素、乙酰泰乐菌素和异戊酰泰乐菌素取发酵液10ml，加入50% 甲醇10ml，超声波处理30min，0. 45um滤膜过滤发酵液，处理过的样品适量稀释后，进行液 质联机检测，结果如图3所示，表明泰乐菌素中的A组分只能被转化成乙酰泰乐菌素A，未检 测到异戊酰泰乐菌素A及泰乐菌素其它组分的异戊酰基化衍生物。
以下，结合附图来详细说明本发明原理和实施方案，其中图1基因中断或置换原理示意^cyBl基因序列(CDS)(下划线部分)图3泰乐菌素生物转化产物的液相图谱
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。实施例1 :acyBl基因中断菌株的构建IacyBl基因中断两侧交换臂及acc (3) IV抗性盒PCR扩增根据基因BLAST结果(序列详见附图)，我们设计acyBl基因中断引物序列如下Ρ-acyBl-l gaagatctatggctgcgctcctgaagcP-acyBl-2 :ggtcgacggatccccggaattctacatgttcccgccggtgP-acyBl-3 :caccggcgggaacatgtagaattccggggatccgtcgaccP-acyBl-4 :gcccctgccgaaacatcttctgtaggctggagctgcttcP-acyBl-5 :gaagcatctccagcctacagaagatgtttcggcaggggcP-acyBl-6 gaagatcttcagcgggacagggccgg(P-acyBl-l&P-acyBl-6 的下划线部分为 BglII 识别位点，P-acyBl-3&P-acyBl_4 的下划线部分为质粒PIJ773上的引物位点，引物P-acyBl-2和P-acyBl-3序列互补，引物 P-acyBl-4 和 P_acyBl_5 序列互补)根据已公布的acyBl基因及其两侧基因序列，以耐热链霉菌基因组DNA为模板，设 计两对引物分别扩增acyBl基因被中断序列两侧1.41Λ左右的交换臂，再以质粒pIJ773为 模板，设计一对引物扩增含有安普霉素抗性基因aaCC3)IV和接合转移起始位点oriT的抗性基因中断盒。反应条件:95°C 45s, 66°C 60s, 72°C 90s，30Cycles ；72°C延伸5min。反应完 成后，电泳检测到三条约1. 4kb的DNA片段，与预计情况完全符合。2S0E-PCR构建acyBl基因中断结构扩增得到的PCR产物经凝胶电泳纯化回收定量后进行S0E-PCR，反应条件 950C 45s, 720C 6min, 30Cycles ；72°C延伸 IOmin0 反应完成后，电泳检测到一条 4. 2kb 的 DNA 片段，与预计情况完全符合。所得到的PCR产物经DNA回收试剂盒回收纯化，BglII酶切后 插入pIE925的BmaHI位点中。通过安普霉素抗性筛选，得到若干acyBl基因发生中断的 阳性克隆子，命名为PZM2009。对所得到的阳性克隆子pZM2009再进行PCR及酶切验证，结果与SOE-PCR构建 acyBl基因中断结构完全符合。3acyBl基因中断载体的构建PZM2009不含链霉菌复制子，但由于其不含有其它适合在链霉菌系统中筛选 的抗性标记，所以不适合作为穿梭自杀载体用于链霉菌的基因置换。因此，本研究选用 了 SuperCosl作为基因置换载体。将pZM2009经BglII酶切后回收4. 21Λ的片段插入 SuperCosl载体中，相应得到acyBl基因中断载体pZM2010。^cyBl基因中断载体导入耐热链霉菌1)将pZM2010转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002 ；接种Iml耐热链霉菌菌丝体于9ml YEME培养基中，34°C培养18h ；2)用超声波处理耐热链霉菌菌丝体，转接2ml培养物于18ml新鲜TSB培养基中继 续于34°C培养继续培养16h。同时挑取一大肠杆菌转化子于含有安普霉素(Am)、卡那霉素 (Km)、氯霉素(Cml)的LB培养基中37°C培养16h ；3)用超声波处理耐热链霉菌菌丝体，转接Iml培养物于9ml新鲜TSB培养基，于 34°C继续培养3 4h。同时转接大肠杆菌培养物于加了上述三种抗生素的新鲜LB培养基 中培养3 4h ；同时收集链霉菌菌丝体和大肠杆菌培养物，3500rpm离心IOmin去上清，收 集菌体，用新鲜TSB悬浮菌体。3500rpm再离心10分钟去上清，用1/10体积的TSB悬浮菌 体；4)对链霉菌菌丝体进行适度的稀释，选择合适的稀释度，将大肠杆菌和链霉菌菌 丝等体积混合后涂布于YEME培养基，于34°C培养18 20小时；5)从34°C培养箱中取出培养物，用含安普霉素(ΙΟΟΟμ g/ml)和萘啶酮酸(500g/ ml)的Iml无菌水覆盖。3 5天后平板上长出5 30个数量不等的抗性菌落。5筛选acyBl基因中断双交换菌株挑取若干抗性菌落，分别涂布加入了安普霉素的抗性平板和卡那霉素的抗性平 板。不需要通过放松培养，可直接筛选得到了 acyBl基因中断的双交换菌株，双交换频率 ^ 10%，所得到的突变株命名为ZM7。在本实例中以下是应用到的一些培养基的组成(包含一些单项的制备方法)LB (Luria-Bertani)培养基(Sambrook et al.，1989)胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7. 0。LA 培养基(Sambrook et al.，1989)LB中加入终浓度为1. 5%的琼脂粉。
酵母膏-麦芽糖培养基(YEME)(Kisser et al.，2000)Difco酵母提取物3g，Difco蛋白胨5g，Oxoid麦芽糖3g，葡萄糖10g，蔗糖103g, 蒸馏水 1000ml，115°C灭菌 25min，临用前补加 MgCl2 · 6H20(2. 5M)2ml/l。改良高氏一号培养基玉米淀粉20g, NaCl 0. 5g, KNO3 lg, FeSO4 0. Olg, K2HPO4 0. 5g, MgSO4 7H20 0. 5g, 琼脂 20g,蒸馏水 1000ml, pH 7. 0-7. 2大肠杆菌培养方法在LB培养基中，37 °C摇床，200RPM培养过夜。耐热链霉菌培养方法在改良高氏一号培养基中，30°C恒温培养箱培养一周产孢后备用。耐热链霉菌菌丝培养方法在YEME培养基中，30°C摇床，200RPM摇床培养48小时。耐热链霉菌基因组DNA提取方法用YEME培养基培养耐热链霉菌菌丝体，吸取一定量的菌液于1. 5ml离心管中， 3000rpm离心15min收集菌体，加入Iml 10. 3%蔗糖溶液洗涤菌体两次后用500 μ 1溶菌酶 溶液重新悬浮50mg菌丝体，于37°C温育约30min至细胞成为半透明状。加入500 μ 1 2% SDS，混合振荡约Imin直到溶液的粘度显著下降，55°C温育15min，然后加入1/10体积3M醋 酸钠(unbuffered)和200 μ 1中性苯酚/氯仿，混合振荡均勻后，12000rpm离心5min，小心 地吸取上清液，弃去白色中间层。用中性苯酚/氯仿重复四五次抽提直至看不见(或非常 少)中间层为止，最后加入1倍体积的异丙醇(或2. 2倍体积的无水乙醇)，反复颠倒置絮 状DNA沉淀出现。用枪头挑取沉淀块置于一新离心管中，加入75%乙醇洗涤DNA两次，最后 弃去所有上清液，待乙醇挥发后，溶解于一定量TE缓冲液中。大肠杆菌质粒提取方法大肠杆菌在加入合适抗生素的LB培养基中37°C培养过夜，用1. 5ml离心管收集 菌液，12000rpm离心30s去上清收集菌体，加入200 μ 1预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl, IOmM EDTA, pH8. 0)悬浮菌体，振荡均勻后加入 400 μ 1 溶液 II (0. 2M NaOH, 1 % SDS)，快速颠倒10次左右混合均勻(动作要轻柔)，然后再加入300 μ 1溶液III (3. OM乙酸 钾，ΡΗ4. 8)混合均勻，12000rpm离心5min，吸取上清，用1/4体积苯酚氯仿溶液振荡抽提， 12000rpm离心5min后吸取上清，加入1倍体积异丙醇沉淀质粒DNA，离心5min后去上清收 集沉淀物，用70%乙醇洗涤两次，置工作台吹干后加一定量的TE缓冲液或ddH20溶解。PCRPCR反应参照试剂公司产品说明书推荐的反应体系和反应条件进行。本研究所用 的酶为TaKaRa公司的LA-Taq酶(用于长链PCR和高保真PCR)。长链PCR反应体系如下引物QOpmol/μ 1)各 1 μ 1模板DNA (约 30ng/ μ 1)1 μ 1DMSO2· 5 μ 12 X GC Buffer II25 μ 1dNTPs 混合物(2· 5mM)8 μ 1
LA-Taq 或 Taq (5U)(MH2O总体积0. 5μ 1 11. 0μ 1 50 μ 1DNA片段回收步骤1)从反应液中回收PCR产物将0. 4ml纯化树脂(使用前充分混勻)装入离心纯化柱，然后加入50 100 μ 1 无石蜡油的PCR反应液，颠倒混勻后静置3分钟。13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废 液。加入500μ1 80%异丙醇(或乙醇)，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重 复第二步一次，此步骤13000rpm离心2分钟，务必将异丙醇(或乙醇)除尽。如果纯化柱 上还残留有异丙醇(或乙醇)，再离心1分钟。将纯化柱套入干净的1.5ml离心管中，加入 50 μ 1超纯水或TE缓冲液于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13000r/min离 心30秒。离心管中的液体即是纯化的PCR产物，取4μ 1电泳检测。2)从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液(50 100 μ 1反应体系)在1 %的普通琼 脂糖凝胶上电泳，染色。在长波紫外灯下迅速切下含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶，并装入 2ml离心管中。尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶，这样可简化操作，提高回收量及DNA片段 的质量。200-400mg琼脂糖凝胶中加入0. 4ml纯化树脂(使用前充分混勻)，70°C保温5_10 分钟，每两分钟颠倒混勻1次，使琼脂糖凝胶完全融化。对于高浓度的琼脂糖凝胶O. 0% )， 每200mg的琼脂糖凝胶中加入500 μ 1纯化树脂，加热时间延长到15分钟将混和液装入离 心纯化柱，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入500 μ 1 80%异丙醇(或乙醇)， 13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复4步一次，此步骤13000rpm离心2分钟， 务必将异丙醇(或乙醇)，再离心1分钟。将纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，加 入40 μ 1超纯水或TE缓冲液于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2分钟后，13000rpm离 心30秒。离心管中的液体即是纯化的PCR产物，取4μ 1电泳检测。DNA 连接用于DNA连接反应的载体DNA和外源DNA片段经适当的限制内切酶切割后，纯化 后用T4DNA连接酶连接。酶连反应体系中外源DNA与载体的比例应为3 4 1，酶连体系 为20 μ 1左右，16°C酶连反应过夜或置于室温酶连2 3小时后备转化用。实施例2 :acyBl基因中断菌株转化泰乐菌素1种子培养方法从改良高氏一号培养基上挑取ZM7单菌落，接入一级种子摇瓶培养基中，种子摇 瓶培养基装量为50ml/500ml摇瓶，30°C摇床，200RPM培养48hr左右。取0. 2ml 一级种子培 养液转接于二级种子培养基中，30°C摇瓶，200RPM培养Mhr左右。2发酵转化方法取3ml 二级种子培养液接种于发酵摇瓶培养基中，30°C发酵48hr后，向培养液中 加入泰乐菌素底物，继续转化48hr左右后，下摇床。3液相检测泰乐菌素、乙酰泰乐菌素和异戊酰泰乐菌素取发酵液10ml，加入50%甲醇10ml，超声波处理30min，0. 45um滤膜过滤发酵液， 处理过的样品适量稀释后，进行液质联机检测，结果如图3所示，表明泰乐菌素中的A组分只能被转化成乙酰泰乐菌素A，未检测到异戊酰泰乐菌素A及泰乐菌素其它组分的异戊酰 基化衍生物。以下是实例中应用到的一些培养基成分(包含一些单项的制备方法)耐热链霉菌种子摇瓶培养基大豆粉15g，玉米淀粉30g，酵母提取物2g，K2HPO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，自来水 1000ml, pH 7. 0-7. 2。发酵摇瓶培养基玉米淀粉30g,大豆粉 30g,酵母提取物 2g，MgSO4 · 7H20 5g，K2HPO4IOOg, KH2PO4 60g，消泡剂 0. 2ml,自来水 1000ml, PH 7. 0-7. 2。底物配制及补料方法将3g泰乐菌素溶于IOOml蒸馏水中，使用0. 22微米无菌过滤器过滤除菌，取5ml 泰乐菌素加入50ml发酵液中。检测效价用流动相的配制乙腈醋酸铵冰醋酸=45 45 10，醋酸铵溶液浓度为0. 15M。序列表<110>中牧实业股份有限公司<120>acyBl基因中断菌株的构建及其转化泰乐菌素的方法<130>ZM001<160>7<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>27<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>1gaagatctat ggctgcgctc ctgaagc27<210>2<211>40<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>2ggtcgacgga tccccggaat tctacatgtt cccgccggtg40<210>3<211>40<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>3caccggcggg aacatgtaga attccgggga tccgtcgacc40<210>4
<211>39<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>4gcccctgccg aaacatcttc tgtaggctgg agctgcttc39<210>5<211>39<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>5gaagcatctc cagcctacag aagatgtttc ggcaggggc39<210>6<211>26<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>6gaagatcttc agcgggacag ggccgg26<210>7<211>2749<212>DNA<213>Streptomyces thermotolerans<400>70152]gatcacactcttcgaggaactccacgggcgctgacgcacgcggcgagggcgcgccccgca600153]ccggtcgtcccgcgtcggctacggagtgccggacggggcgggttcggacctgggtgtcga1200154]gccggcgtccggggaccgccgcggccgtcccagggttcgcatgaccggcttctccacgaa1800155]gaagtgcaggaacgccgacagccccagcgccagcgtgaaggcgagcagggtcagcccgac2400156]ggcggccggtgtgtcccactgccggtaatagccctgcttcccgccggcgaagcggtgccc3000157]gtactggatgatcaggtagtgcacgaggtagaaggcgaaggtgagttcccccagcagcac3600158]catcgtcctggtccccagccaggagcggacgccgcgcacatcaccgacggccaccgaggc4200159]gagcagcagcgcgatcaccgggacggtcaaCgCgCCggggtcgtagtggttcggcaccgc4800160]gaacgtcaccgcgaacaccgctgagaacagcgcgacgcaggccaggggacgcgggcccct5400161]ccagcgtccccggatcacgatctgggccatgagcatcccgagcacgaactccagcagccg6000162]caccggcgggaacatgtagatgaaccaccaccgcagctgcggcatgtccgggtcccacgg6600163]caggggcgggctggccggcagcagcagtgcgaccagggggatggagacggcggccacgga7200164]caccgcggcggcccaccgccagagccggtccgtacggaccttggtgaagaaggcgaagag7800165]gaacgggaacatggcgtagaagaacagctcgcaggagagcgaccacgccaccgggttcat8400166]gctgccgtactcgtggtggtcggggaaccatgcctggatcagcagcaggttcgtgagcag9000167]tccgtcccacaccgatcggcccatgttgggctcgttgagggccagcacgatcagcagcgt9600168]caccagcagcacgggcaggtgcagcgagtacgcgcggaccgtgcgccgccgccagaagtt1020
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权利要求
1.耐热链霉菌CGMCCNo. 3193。
2.构建的acyBl基因被破坏了的重组载体pZM2010。
3.一种发酵转化泰乐菌素的方法，该方法包括先培养耐热链霉菌CGMCC No. 3193, 然后向发酵液中补入泰乐菌素底物，进行生物转化。发酵温度为30°C，发酵培养基PH为 7. 0-7. 2。
全文摘要
根据已报道的基因序列信息设计引物，从耐热链霉菌基因组DNA中将含有acyB1基因的基因片段克隆下来，得到含有acyB1基因片段的重组载体；通过SOE-PCR技术构建acyB1基因被破坏了的重组载体；通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移，将这个载体导入耐热链霉菌中；通过同源重组、抗性筛选、PCR验证和HPLC-MS分析得到acyB1基因被破坏的耐热链霉菌基因突变株；将这个基因突变株转化大环内酯类抗生素，得到乙酰大环内酯类抗生素。本研究工作为大环内酯类抗生素进行专一性酰基化改造建立了一个平台。
文档编号C12P19/62GK102051341SQ200910210820
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月11日 优先权日2009年11月11日
发明者张国栋, 曹芹, 王华丽, 郑应华, 闵勇, 齐鹏 申请人:中牧实业股份有限公司