专利名称：海产贝类中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法
技术领域：
本发明涉及海产贝类中病毒的浓缩方法，具体涉及到海产贝类中病毒的浓缩方法 和贝类体内甲型肝炎病毒OfepatitiS A viruses, HAV)浓缩方法的回收率测定。
背景技术：
贝类是富集病毒的重要载体，以往的研究是通过细胞培养来进行病毒的增殖和检 测，但是细胞培养的方法不但耗时耗资，并且许多病毒找不到合适的细胞系进行培养，致使 贝类体内许多病毒的研究滞后。PCR方法的应用解决了上述难题，但是在病毒的检测过程中 又经常出现两种问题一是由于含量太低而不能直接被检测到，二是必须除去或者尽量减 少在RT-PCR反应过程中的RNA抑制剂，发明一种贝类体内病毒的浓缩方法是十分必要的。贝类中的病毒浓缩是一个理化过程，常用的贝类浓缩方法一是沉淀法， organic-occulation(OF)和PEG是两种常用的絮凝剂，是具有强烈吸水性以及凝聚和沉 淀蛋白作用的高分子聚合物，此方法首先要改变样品PH值(硼酸盐、甘氨酸、牛肉膏、牛 肉膏-二氯二氟是四种常用的缓冲液)，使病毒粒与样品微粒分开，利用OF和PEG把病毒 粒沉淀下来，最终通过氯仿抽提的方法将病毒抽提出来。有学者比较这四种缓冲液和OF、 PEG-6000和PEG-8000三种絮凝剂，得出四种缓冲液对浓缩效率没有多大影响，这三种絮 凝剂中PEG-8000的浓缩效率最高，但是该方法在透析之后需要洗膜，并且需要过夜处理， 既费时工作量又大，所以在处理大批样品时该方法并不实用。近来又有学者提出将PEG和 Pro-cipitate两种透析方法同时使用，该方法浓缩效率较高，但是比PEG-8000方法更耗 时。第二种常用的方法是差速离心，此方法通过调节pH和离心速度来达到将病毒粒子和组 织分开的目的，但是该方法获得的最终产物中抑制剂比较多。本方法综合了上述两种方法 的优点，在差速离心的基础上再进行氯仿抽提，既节约了时间又提高了浓缩效率。
发明内容
本发明提供一种海产贝类中病毒的浓缩方法，该方法包括取25g贝肉组织于 勻浆器中快速勻浆，将勻浆液放入50mL的灭菌离心管中并加入等体积的甘氨酸缓冲液 (pH9. 0)；调整pH至7. 2士0.4，室温条件下震荡30min左右，4 °C条件下，5，000X g离心 15min,取上清液；上清液于4°C条件下，10，000 X g离心lh，再次收集上清液；上清液在超速 离心机中140，000 Xg离心1. 5h，弃上清；沉淀用ImL PB S(pH7. 4)重悬，以溶解沉淀；将重 悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min，然后4，OOOXg离心 30min ；吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500 μ L浓缩样品，冻存备检。本发明还提供一种海产贝类中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括(1)取2mL的病毒减毒活疫苗添加到25g勻浆的贝肉中，作为试验样品，用病毒减 毒活疫苗作为浓缩前的阳性对照，用未添加病毒减毒活疫苗的贝肉样品作为阴性对照；(2)用上述浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的贝肉和未添加病毒减毒活疫苗的贝 肉进行浓缩，得到浓缩样品；
(3)采用Trizol的方法进行贝类体内病毒RNA的提取；(4)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长 度为76bp ；(5)病毒标准曲线的建立，用EASY-Dilluti0n将已知拷贝数的重组质粒作IO2 1076个梯度的稀释；20 μ L RT-PCR反应体系为10. 0 μ L 的 STOR Premix Ex TaqQX)、引物各0. 4 μ L、 0. 4 μ L 的 ROX Reference Dye II (50 X)、质粒模板 2. 0 μ L 和灭菌水 6. 8 μ L ；反应条件95°C 10s,95 °C 15s,60°C lmin,40个循环，熔解曲线分析条件为 950C 10s,60°C lmin,95°C 15s ；(6)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算贝类样品中病毒的回收率。在上述方法中，病毒的实例为甲型肝炎病毒。
图1是HAV实时定量RT-PCR标准曲线图；图2是HAV实时定量RT-PCR扩增曲线图；图3是HAV实时定量RT-PCR熔解曲线图。
具体实施例方式(一)浓缩方法1、取25g贝肉组织于勻浆器中快速勻浆，将勻浆液放入50mL的灭菌离心管中并加 入等体积的甘氨酸缓冲液(PH9.0)；2、调整pH至7. 2士0. 4，室温条件下震荡30min左右，4°C条件下，5，OOOXg离心 15min，取上清液；3、上清液于4°C 10，OOOXg离心lh，收集上清液；4、上清液在超速离心机中140，OOOXg离心1. 5h，弃上清；5、沉淀用ImL PB S(pH7. 4)重悬，一般以溶解沉淀为宜；6、将重悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min，然 后 4，OOOXg 离心 30min ；7、吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500 μ L浓缩样品，冻存备检。(二)回收率的测定用荧光实时定量RT-PCR方法计数(以甲型肝炎病毒的计数为例)1、样品的制备取2mL的甲型肝炎减毒活疫苗添加到25g勻浆的贝肉中，作为试验 样品，用甲型肝炎减毒活疫苗作为浓缩前的对照，用未添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉样 品作为阴性对照；2、用上述贝类浓缩方法将添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉和未添加甲型肝炎减 毒活疫苗的贝肉进行浓缩，得到两份大约2mL左右的浓缩样品；3、甲型肝炎病毒(HAV) RNA的提取提取甲型肝炎减毒活疫苗(A)、添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉浓缩样(B)和未 添加甲型肝炎减毒活疫苗贝肉浓缩样(C)的RNA。具体方法如下
(1)于贝类浓缩样中加入ImL Trizol，30°C孵育5min ；(2)然后4°C低温下12，OOOXg转速离心10分钟，取上清液；(3)上清液中加入0. 2mL氯仿，30°C孵育!Bmin ；(4)之后4°C低温12，OOOXg转速离心15min，取上清液；(5)上清液中加入0. 5mL异丙醇，30°C孵育IOmin, 12000 Xg离心lOmin，取沉淀；(6)沉淀中加入ImL 75%乙醇，4°C 8000 Xg离心5min，取沉淀；(7)室温放置5-10分钟晾干沉淀，加入50 μ L RNase-free水，_80°C保存。4、引物的设计甲型肝炎(HAV)PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的 片段长度为76bp。引物序列为HAV(+) :ACAXGAXGCAXGAATXGTTCCTXGATCCHAV(-) :TCCCCTATTXGXGCTTTCCCTT。5、反转录体系为2. Ομ L 的 5XPrimeScript Buffer、0. 5 μ L 的 PrimeScript RTEnzyme Mix Ι、0· 5 μ L 的 Random 6mers、1· 5 μ L 的总 RNA 禾口 5· 5 μ L 的无 RNase 灭菌水。反转录条件为37°C 15min,85°C 15s，合成甲型肝炎病毒cDNA的第一条链。6、反应体系为2. 5μ L 的 IOXEx Taq buffer、1. 0 μ L 的引物、2. 0 μ L 的 dNTP、 0. 5 μ L 的 Taq 酶、2. 0 μ L 的 cDNA 和 16. 0 μ L 的 DEPC 水。7、循环参数为94°C预变性5min ；然后94°C变性20s ；60°C复性lmin，72°C延伸 30s，共40个循环；最后72°C延伸5min。8、目的片段克隆PCR产物经2%琼脂糖凝胶回收纯化得到76bp的目的片段，切下琼脂糖凝胶中的 目的条带，与PMD 18-T载体连接，连接产物转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞中，37°C培养 12 16h，挑白色单菌落用载体引物进行扩增，从而获得阳性克隆，对阳性克隆进行LB液体培养基培养。9、标准阳性对照质粒的制作利用质粒小量提取试剂盒提取含有目的片段的重组质粒，重组质粒的浓度用紫外 分光光度计检测，0D260/0D280为1. 99，表明该重组质粒的纯度很高。10、HAV标准曲线的建立用EASY-Dillution将上述已知拷贝数的重组质粒作102 1076个梯度的稀释。 20 μ L Real-time PCR 反应体系为10. 0 μ L 的 STORPremix Ex Taq O X)、0· 4 μ L 的引物、 0. 4 μ L 的 ROX ReferenceDye II (50 X)、2. 0 μ L 的质粒模板和 6. 8 μ L 的灭菌水以起始模板数的对数为X轴，以临界循环数(Ct)为Y轴，建立实时定量PCR的标准 曲线(图1)。线性回归方程为y = -3. 217X+39. 425，标准曲线斜率为-3. 217，R2 = 0. 999， 表明RT-PCR扩增该标准样品的线性关系良好，符合制备实时定量PCR标准曲线的要求，熔 解曲线分析表明扩增产物非常单一，特异性好。反应条件95°C 10s,95°C 15s,60°C lmin，40个循环。得到的扩增曲线和熔解曲线 见图2、图3。熔解曲线分析条件为95°C 10s，60°C lmin，95°C 15s。11、HAV回收率的计算将上述三份甲型肝炎减毒活疫苗(A)、添加甲型肝炎减毒活疫苗的贝肉浓缩样
权利要求
1.一种海产贝类中病毒的浓缩方法，该方法包括取25g贝肉组织于勻浆器中快速勻浆，将勻浆液放入50mL的灭菌离心管中并加入等体 积的甘氨酸缓冲液(PH9. 0)；调整pH至7. 2士0. 4，室温条件下震荡30min左右，4°C条件下， 5，OOOXg离心15min，取上清液；上清液于4°C条件下，10，OOOXg离心lh，再次收集上清 液；上清液在超速离心机中140，OOOXg离心1. 5h，弃上清；沉淀用ImL PBS (pH7. 4)重悬， 以溶解沉淀；将重悬液加入一个2mL的灭菌离心管中并加入等量体积的氯仿，震荡30min， 然后4，OOOXg离心30min ；吸取上清液，上层液相即为病毒抽提样，得到约500 μ L浓缩样 品，冻存备检。
2.海产贝类中病毒浓缩回收率的测定方法，该方法包括(1)取2mL的病毒减毒活疫苗添加到25g勻浆的贝肉中，作为试验样品，用病毒减毒活 疫苗作为浓缩前的阳性对照，用未添加病毒减毒活疫苗的贝肉样品作为阴性对照；(2)用权利要求1所述的浓缩方法将添加病毒减毒活疫苗的贝肉和未添加病毒减毒活 疫苗的贝肉进行浓缩，得到浓缩样品；(3)采用Trizol的方法进行贝类体内病毒RNA的提取；(4)病毒PCR引物设计位于HAV基因组中编码V1-V3衣壳蛋白的区域，目的片段长度为 76bp ；(5)病毒标准曲线的建立，用EASY-Dillution将已知拷贝数的重组质粒作IO2 10 个梯度的稀释；20 μ L RT-PCR 反应体系为10. 0μ L 的 STOR Premix Ex Taq Q X)、引物各 0. 4 μ L、 0. 4 μ L 的 ROX Reference Dye II (50 X)、质粒模板 2. 0 μ L 和灭菌水 6. 8 μ L ；反应条件95°C 10s,95°C 15s, 60°C lmin,40个循环，熔解曲线分析条件为95°C 10s， 60°C lmin,95°C 15s ；(6)根据标准曲线计算样品中病毒的拷贝数，从而计算贝类样品中病毒的回收率。
3.根据权利要求2所述的病毒浓缩回收率的测定方法，其中病毒为甲型肝炎病毒。
全文摘要
本发明提供一种海产贝类中病毒的浓缩方法及病毒浓缩回收率的测定方法。其方法包括组织匀浆、差速离心、氯仿去除脂蛋白。以甲型肝炎病毒为实施例，采用荧光定量PCR方法进行病毒回收率的测定，回收率达62.7％。该方法可用于贝类中病毒的直接浓缩，以利于开展海产贝类食用安全监测与评价。
文档编号C12Q1/68GK102051346SQ200910211150
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月6日 优先权日2009年11月6日
发明者付慧, 吴利军, 明红霞, 李利利, 樊景凤, 陈佳莹 申请人:国家海洋环境监测中心