专利名称：侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种对番茄上两种病毒(番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒) 快速鉴别的方法，属植物保护领域。
背景技术：
番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄上一 种危害异常严重的病毒，分类上属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属 (Begomovirus)，传播介体为烟粉虱(Bemisiatabaci)，病毒基因组为单链环状DNA，大小 2. 7-2. Skb0该病毒感染番茄后症状主要表现叶片变小，上卷，叶缘及叶脉之间黄化，植株生 长迟缓，节间变短，矮化，上部呈簇生状，对番茄的产量和质量影响极大，重病田常造成绝产 绝收。20世纪90年代，该病在多米尼加共和国导致当地番茄产量损失95% ；本世纪初，我 国的海南、台湾、广东、云南等南方地区番茄上就有该病发生危害的报道，2006-2009年该病 陆续在浙江、上海、江苏、安徽、山东、河北等地爆发，给当地的番茄生产造成了严重的损失， 其中浙江温州地区5000余亩番茄被毁。由于该病毒蔓延迅速、危害惨重、控制困难，已上升 为当前我国番茄生产上的主要限制因素之一。中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl china virus，PaLCCNV)也属于双 生病毒科菜豆金色花叶病毒属，传播介体为烟粉虱，病毒基因组为单链环状DNA，大小 2.7-2.8kb。该病毒最早是在我国广西的番木瓜上检测到的，所以称为中国番木瓜曲叶病 毒，其危害番茄主要表现叶片变小，上卷，叶缘及叶脉之间黄化，植株矮化，对番茄的产量和 质量影响严重。2007年该病在河南番茄上大面积发生危害，仅开封市开封县就有2000个日 光温室受到毁灭性的危害，直接经济损失近2000万元。2009年在安徽、江苏等地的番茄上 也陆续检测到了该病毒，显示该病毒也有蔓延扩散的迹象，是我国当前番茄生产上一个潜 在的威胁。由于两种病毒有着相似的粒体形状，相同的传播介体及相近的基因组结构，侵染 番茄后的田间症状也非常相近，由此也为其鉴别带来了很大的困难。目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有生物学接种法，血清学检测法，电镜 观察及分子生物学方法。由于这两种病毒在很多方面都具有非常接近的特性，因此传统的 植物病毒检测方法，如电镜观察(病毒粒子大小形状相近)、生物学接种鉴定(症状类似、介 体相同、周期长)、血清学检测(属于同一个属，序列有很高的同源性，血清学相关)等方法 都很难区分。目前在这两种病毒的检测上都是采用分子生物学的方法，需要获得其序列进 行同源比对后才能区分，尚未见到使用PCR即可区分这两种病毒的方法。本方法针对当前 这两种病毒在我国的危害现状，根据其序列特征，设计优化引物，只需一次PCR即可实现两 种病毒的鉴别，为当前这两种病毒的田间调查及今后的预测预报提供了较为简单的方法。 该方法是一种基于PCR的分子检测方法，保证了灵敏性和特异性，同时该方法通过引物的 优化设计，简化了操作，节省了成本。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，为侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的鉴别提供了一种快速、简便、灵敏、特异的方法。1、引物设计(1)根据 NCBI (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ？ db = nucleotide)上已报道的番茄黄化曲叶病毒核酸序列(GU111505)和中国番木瓜曲叶病毒 核酸序列(EU874386)设计引物，引物序列如下PA_F362 -GCACCACTCACATTCTCGGAAAC_3~TY_F833 :5:GGTCTACACGCTTACGCCTTATT_3、
PATY_R 5~-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下引物组合检测病毒名称目的片段大小PA_F362/PATY_R 中国番木瓜曲叶病毒 362bpTY_F833/PATY_R 番茄黄化曲叶病毒 833bp2、总 DNA 提取取IOmg番茄病叶于1. 5mL离心管，加100 μ L 0. 5mol/L NaOH，勻浆后5000rpm离 心5min,上清液用0. lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)稀释100倍，取1 μ L作为模板进行PCR扩
+飽
+曰ο3、PCR 扩增PCR反应体系包括DNA1 μ L10 X PCR 缓冲液2.5yLdNTPs (10mM/dNTP)0. 5 μ LPA_F362(10ymol/L)1 μ LTY_F833(10ymol/L)1 μ LPATY_R (10 μ mo 1 /L)1 μ LTaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 5 μ LddH2017. 5μ L总体积25 μ L反应条件为94°C预变性 IOmin ；94°C变性 45sec、53_59°C退火 45sec、72°C延伸 lmin, 30-40次循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。4、电泳检测 取10 μ L PCR产物经1 %琼脂糖凝胶在0. 5 X TBE缓冲液和120V电压条件下电泳 40min，在0. 5μ g/mL的溴化乙锭(EB)中染色lOmin，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感 染番茄黄化曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条833bp的核酸条带，在仅感染中国番木 瓜曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条362bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病 毒和中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到362bp和833bp两条核酸条带。
其中所述的退火温度53-59°C，也可以是55_57°C ；所述的循环次数30_40次，也可以是32-35次 本发明的有益效果是根据番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒核苷酸序列 设计引物PA_F362/PATY_R (检测中国番木瓜曲叶病毒)、TY_F833/PATY_R (检测番茄曲叶病 毒)，实现了这两种病毒的快速鉴别。该方法克服了常规的生物学方法、电镜观察法、血清学 方法及传统的PCR方法在这两种病毒鉴别上的缺陷，只用相当于一次普通PCR的时间和试 剂，就实现了番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别。
附图是番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的电泳检测结果(M:标准分子 量；1 中国番木瓜曲叶病毒；2 番茄黄化曲叶病毒；3 番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲 叶病毒的复合样品)
具体实施例方式实例一以已知的感染番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的番茄混合样品和分别 感染番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的番茄样品为检测对象，以健康番茄样品为 阴性对照。1、引物设计(1)根据 NCBI (http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ？ db = nucleotide)上已报道的番茄黄化曲叶病毒核酸序列(GU111505)和中国番木瓜曲叶病毒 核酸序列(EU874386)设计引物，引物序列如下PA_F362 -GCACCACTCACATTCTCGGAAAC_3~TY_F833 :5:GGTCTACACGCTTACGCCTTATT_3、
PATY_R 5~-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3、(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下引物组合检测病毒名称目的片段大小PA_F362/PATY_R 中国番木瓜曲叶病毒 362bpTY_F833/PATY_R 番茄黄化曲叶病毒 833bp2、总 DNA 提取取IOmg番茄病叶于1. 5mL离心管，加100 μ L 0. 5mol/L NaOH,勻浆后5000rpm离 心5min,上清液用0. lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)稀释100倍，取1 μ L作为模板进行PCR扩
+飽
+曰ο3、PCR 扩增PCR反应体系包括DNA1 μ L
10 X PCR 缓冲液 2. 5 μ LdNTPs (10mM/dNTP)0. 5 μ LPA_F362(10ymol/L)1 μ LTY_F833(10ymol/L)1 μ L
PATY_R (10 μ mo 1 /L)1 μ LTaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 5 μ LddH2017. 5μ L总体积25 μ L反应条件为94°C预变性 IOmin ；94°C变性 45sec、56°C退火 45sec、72°C延伸lmin， 35次循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。4、电泳检测 取10 μ L PCR产物经1 %琼脂糖凝胶在0. 5 X TBE缓冲液和120V电压条件下电泳 40min，在0. 5μ g/mL的溴化乙锭(EB)中染色lOmin，染色后于凝胶成像系统中观察。5、结果分析在仅感染番茄黄化曲叶病毒的样品中可以观察到一条833bp的核酸条带，在仅感 染中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到一条362bp的核酸条带，在同时感染番茄黄 化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到362bp和833bp两条核酸条带。 SEQUENCE LISTING
<110>江苏省农业科学院
<120>侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法
<140>20091021130456
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<170>PatentIn version 3.5
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gcaccactca cattctcgga aac23
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<213>Papaya leaf curl china virus and Tomato yellow leaf curl virus <400>3
ttccatccga acattcaggc age2权利要求
侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的快速鉴别方法，包括以下步骤(1)引物设计①根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)上已报道的番茄黄化曲叶病毒核酸序列(GU111505)和中国番木瓜曲叶病毒核酸序列(EU874386)设计引物，引物序列如下PA_F3625`-GCACCACTCACATTCTCGGAAAC-3`TY_F8335`-GGTCTACACGCTTACGCCTTATT-3`PATY_R5`-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3`②引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下引物组合 检测病毒名称 目的片段大小PA_F362/PATY_R中国番木瓜曲叶病毒362bpTY_F833/PATY_R番茄黄化曲叶病毒 833bp(2)总DNA提取取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL0.5mol/LNaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。(3)PCR扩增PCR反应体系包括DNA 1μL10×PCR缓冲液2.5μLdNTPs(10mM/dNTP) 0.5μLPA_F362(10μmol/L) 1μLTY_F833(10μmol/L) 1μLPATY_R(10μmol/L)1μLTaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μLddH2O17.5μL总体积 25μL反应条件为94℃预变性10min；94℃变性45sec、53-59℃退火45sec、72℃延伸1min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。(4)电泳检测取10μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染番茄黄化曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条833bp的核酸条带，在仅感染中国番木瓜曲叶病毒的番茄样品中可以观察到一条362bp的核酸条带，在同时感染番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到362bp和833bp两条核酸条带。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶 病毒的方法，其特征在于PCR扩增中的退火温度为55-57°C。
3.根据权利要求1所述的快速鉴别侵染番茄的番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶 病毒的方法，其特征在于PCR扩增的循环次数为32-35次。
全文摘要
本发明提供一种快速鉴别番茄上两种类似病毒(番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒)的方法，属植物保护领域。根据番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒核苷酸序列设计三条引物，PA_F362，TY_F833，PATY_R，其中PA_F362/PATY_R组合检测中国番木瓜曲叶病毒，TY_F833/PATY_R组合检测番茄黄化曲叶病毒。样品提取总DNA后，只需一次PCR，即可实现番茄黄化曲叶病毒和中国番木瓜曲叶病毒两种病毒的鉴别。该方法克服了传统的生物学、血清学、电镜观察等方法上存在的问题，与传统的一次PCR检测一种病毒的方法相比，又减少了成本，节约了时间，是一种特异、灵敏、经济而又方便的检测方法。
文档编号C12Q1/70GK101845514SQ20091021304
公开日2010年9月29日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者余文贵, 刘莉, 周彤, 周益军, 孙海霞, 季英华, 程兆榜, 赵统敏 申请人:江苏省农业科学院