专利名称：一种提高谷氨酸温度敏感突变株发酵产酸率的方法
一种提高谷氨酸温度敏感突变株发酵产酸率的方法技术领域：
本发明涉及一种提高L-谷氨酸发酵过程产率的方法，属于发酵法生
产氨基酸的技术领域。背景技术：
自1957年木下等发明了利用微生物发酵法生产谷氨酸以来，谷氨酸 发酵已经进行工业化的大规模生产。国内自1964年上海工业微生物研究所与上海天厨味 精厂协作，采用黄色短杆菌以发酵法生产谷氨酸获得成功以后，1965年在上海天厨味精厂 50m3发酵罐首先投产，完成了以蛋白质原料水解法向发酵法生产味精的转化。根据原轻工 业部规划，首先在沈阳味精厂与天津味精厂推广。1964年，由中国科学院微生物研究所与 杭州味精厂合作，于1966年采用北京棒杆菌发酵法生产谷氨酸在杭州味精厂投产，此后， 利用微生物发酵法生产谷氨酸在国内各味精厂相继推广，有力地推动了我国味精工业的崛 起。迄今为止，国内已全部采用发酵法生产味精。多数厂家现在生产上常用的菌株是T6-13、 FM415、 S9114和CMTC6282等。近60年来，全国味精产量(不含台湾)已由水解法生产的 4200吨发展到2008年的190万吨，占世界味精总产量的70%以上，居世界味精产量首位。
早在20世纪70年代，日本就有温度敏感型谷氨酸菌的研究报道。国内最早的报 道是1985年上海市工业微生物所的孙智凤等对温度敏感型变异株D0菌的选育及其作用的 报道，他们以该菌为出发菌株，经DES和NTG连续诱变处理，选育得到一株优良的温度敏感 型NI菌，此菌的生物素适应范围更广(25iig/L 200iig/L)，同时要在较高温度(37°C 40°C)下才能正常发酵产酸。将NI菌用于大米水解糖在6.5n^发酵罐上生产谷氨酸，平 均产酸率达5. 89%，平均糖酸转化率为47. 25%，平均发酵周期为26. 5h。 2002年陈宁等 报道定向选育出了具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟酸盐抗性的温度敏感性突变株TMG0106，然 后，以该突变株和产酸率高的天津短杆菌TG961为亲株，通过原生质体融合技术，成功地选 育出了产酸率高的融合子CN1021，在6m3发酵罐上其谷氨酸产量达14. 6%，糖酸转化率达 62.8%，并且该菌株系温度敏感型菌株，可用于谷氨酸强制发酵。2003年、2004年张克旭、 陈宁等又对温度敏感突变株CN1021发酵条件的研究进行了报道。莲花集团在几年前也致 力于以温度敏感型菌种替代传统的谷氨酸生产菌种的研究生产工作，经几年的研究探索， 也取得了较大的突破。 目前国内谷氨酸主要技术和产业化路线主要涉及湿磨玉米淀粉、双酶法制糖、精 料发酵、等电离交提取与精制工艺、废水处理与清洁生产等5个方面，其中谷氨酸发酵主要 采用生物素亚适量法发酵，产酸率在100 120g/L，平均转化率为60 % ，而国外主要采用添 加青霉素、温度敏感型等强制发酵工艺，产酸水平在140 160g/L左右，转化率65%以上。 本发明通过采用谷氨酸温度敏感突变株生产谷氨酸，产酸率可达到180g/L以上，糖酸转化 率达到62%以上。
发明内容本发明采用以谷氨酸温度敏感突变株在发酵过程提高温度的方法来 提高谷氨酸发酵产酸率。 典型的谷氨酸温度敏感突变株都是短杆菌属的变种，这些菌株在发酵培养基上 28°C 33t:培养时，生长良好，若在37°C 4(TC培养时不能生长或仅能微弱生长，在富含 生物素的发酵培养基中培养到适当阶段，把温度从28°C 33t:转换到37 4(TC后，可在培养基中积累大量谷氨酸。 谷氨酸温度敏感突变株多为基因突变型菌株，突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有关系的细胞膜结构的基因上(编码某些酶肽键结构的顺反子)，由于突变导致DNA分子上遗传密码的转换或颠换， 一个碱基为另一个碱基所置换，这样为该基因所指导的酶，在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。当控制培养温度为最适生长温度时，菌体正常生长；当温度提高到一定程度时，菌体便停止生长而大量产酸。由于其发酵控制方式与现行的采用生物素亚适量法发酵谷氨酸完全不同，在利用其发酵生产谷氨酸时，不需要控制生物素亚适量，仅需通过物理方式(培养温度的改变)就可以完成谷氨酸生产菌由生长型细胞向产酸型细胞的转变，从而避免了因原料的影响而造成产酸不稳定的现象，而且发酵稳定，发酵周期短，设备利用率高。另外，由于在采用温度敏感型菌株强制发酵过程中不存在生物素亚适量问题，生物素可以大过量，从而可以强化体内C02固定反应，提高谷氨酸对糖的转化率，达到高产酸、高转化率的目的。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的 本发明提供的一种提高L-谷氨酸发酵产率的方法，其特征是谷氨酸温度敏感突变株在发酵培养基上28°C 33t:培养时，生长良好，当发酵液稀释20倍浓度0D62。 值为0. 3-0. 8时，在1 30分钟内提高温度至37°C 4(TC培养，此时不能生长或仅能微弱生长，菌体可在发酵液中积累大量谷氨酸。
本发明的优点和积极效果 与现有谷氨酸生物素亚适量工艺相比，本发明的方法具有以下特点 由于谷氨酸温度敏感突变株发酵控制方式与现行的采用生物素亚适量法发酵谷
氨酸完全不同，在利用其发酵生产谷氨酸时，不需要控制生物素亚适量，仅需通过物理方式
(培养温度的改变)就可以完成谷氨酸生产菌由生长型细胞向产酸型细胞的转变，从而避
免了因原料的影响而造成产酸不稳定的现象；温度敏感型菌株具有耐生物素、温度敏感的
特点，要在较高的温度下才能正常发酵产酸(一般为37t: 4(TC);温度转换是影响产酸
的关键，温度对谷氨酸发酵具有生产性的影响表明，温度转换后，必须进行适度剩余生长，
完成从谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞的转变，以保证在富含生物素的培养基中高产谷
氨酸。生产原料易得，不仅可以利用生物素含量高的原料如糖蜜、薯干等直接进行发酵生
产，而且可以利用淀粉质原料；发酵工艺趋于简单，易于控制，发酵周期短，节约能耗，降低
成本等优点。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范围 实施例1 : 采用的菌株为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸温度敏感突变株；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基[葡萄糖18%、玉米浆2%、1%504*711200. 15%、K2HP04 0 . 45%、MnS04 0 . 00 0 3%、FeS04 0 . 00 0 3%、VB1 0.00004% ];培养方法将菌种接入种子培养基[葡萄糖2. 5%、玉米桨3%、K2HP04 *3H200. 3%、MgS04 *7H20 0. 1%、0. 0002%、FeS04 0 . 00 0 2%、VB1 0. 00002%，尿素0.055% ]中，接种量为10% ;在30°C 、pH为7. 0和溶氧为20%条件下于5L自动控制发酵罐中培养12h至对数期，按10X的接种量接入含有发酵培养基的30L自 动控制发酵罐中，控制初始培养温度为30°C，当发酵液稀释20倍浓度0062。 值为0. 35时， 在5分钟内提高温度至37t:培养，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式 控制溶氧0 10h为20 % ， 10 32h为5 % ，通过自动流加氨水控制pH在7. 0 7. 2，通 过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1. 5%，发酵 至32h停止。放罐时，L-谷氨酸的产量为181. Og/L，糖酸转化率为62.0%。
实施例2: 采用的菌株为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸温度敏感突变株；培养基为在 现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);种子培养方法同实施例1。发酵控制初始培养 温度为28°C ，当发酵液稀释20倍浓度0062。 值为0. 4时，在3分钟内提高温度至37"C培养， 其它培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为158. Og/L，糖酸转化率为60. 0%。
实施例3: 采用的菌株为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸温度敏感突变株；培养基为在 现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);种子培养方法同实施例1。发酵控制初始培养温 度为32°C，当发酵液稀释20倍浓度0062。 值为0. 6时，在15分钟内提高温度至38"C培养， 其它培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为162. Og/L，糖酸转化率为61. 9% 。
实施例4 : 采用的菌株为谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸温度敏感突变株；培养基为在 现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1);种子培养方法同实施例1。发酵控制初始培养温 度为33°C，当发酵液稀释20倍浓度0062。 值为0. 8时，在25分钟内提高温度至39。C培养， 其它培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为157. Og/L，糖酸转化率为61. 3% 。
权利要求
一种提高谷氨酸温度敏感突变株发酵产酸率的方法，其主要步骤为采用谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸温度敏感突变株经发酵获得L-谷氨酸，其特征在于发酵过程在前期低温培养至对数生长期，迅速提高培养温度，仅通过温度转换，并且要在温度转换之后进行适度的剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，实现谷氨酸的高产。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的发酵过程在前期低温培养温度为28°C 33°C。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的发酵过程在前期低温培养至对 数生长期时开始迅速提高温度时机是当发酵液稀释20倍浓度0D62Qnm值为0. 3-0. 8时。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是培养温度从28°C 33t:提高至37 40°C 所用的时间为1 30分钟。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是其中所说的发酵过程迅速提高培养温度至 37 40°C。
全文摘要
一种提高谷氨酸温度敏感突变株发酵产酸率的方法。本发明涉及一种发酵法制备L-谷氨酸的方法。本发明根据谷氨酸温度敏感突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变，在温度转换之后，进行适度地剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变的原理，仅通过采用控制温度就能实现谷氨酸高产的方法，来有效提高L-谷氨酸发酵产率。
文档编号C12R1/13GK101705263SQ20091022894
公开日2010年5月12日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日 公开号200910228946.发明者刘淑云, 徐庆阳, 谢希贤, 陈宁, 魏伟 申请人:天津科技大学