专利名称：一种与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白及其 编码基因。
背景技术：
叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，它的作用是捕获光能并将光能转移到反 应中心，对植物的生长及其产量有很重要的作用。根据乙烯侧链数目的不同，叶绿素可分为 3，8_联乙烯叶绿素(DV Chls)和3-乙烯叶绿素(单乙烯叶绿素，MV Chls) 0在正常情况 下，几乎所有的植物和细菌用于光合作用的叶绿素都是MV chls,目前只发现一类海洋生物 艮f]“the marine prochlorophyte Prochlorococcus marinus”利用的是DV Chls (Chisholm SW, Frankel SL, Goericke R， Olson RJ, Palenik B， Waterbury JB, West-Johnsrud L， Zettler ER(1992)Prochlorococcus marinus nov. gen. nov.sp. :A marine prokaryote containing divinylchlorophyll a and b· Arch· Microbiol· 157 :297_300)。叶绿素生物合成的多样性在于它是单乙烯叶绿素(MV Chls)和联乙烯叶绿素(DV Chls)合成的平行途径，DV Chls及其中间产物通过C-8乙烯基还原酶催化转化成MV Chls 及其中间产物(Rebeiz CA，Kolossov VL, Briskin D, GawienowskiM(2003)Chloroplast biogenesis :chlorophyll biosynthetic heterogeneity, multiple biosynthetic routes，and biological spin-offs, in :Nalwa HS(Ed.), Handbook of Photochemistry and Photobiology, vol. 4, American Scientific，Los Angeles :183_248)。迄今为止， 已检测到五种联乙烯叶绿素的中间产物，分别是联乙烯Mg-原卟啉IX(DV Mg-proto)、联 乙烯Mg-原卟啉单甲基酯(DV Mg-Proto monomethyl ester)、联乙烯原叶绿素酸酯a(DV Pchlide a)、联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)及联乙烯叶绿素a (DV Chl a) (Kolossov VL, Bohnert HJ, Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 :In situ screening for divinyl chlorophyll (ide)a reductase mutants by spectrofluorometry Analytical Biochemistry 348:192-197)。目前不清楚的是这些联乙烯中间物质是由一个具有广泛 特异性的C-8乙烯基还原酶催化还是由多个C-8乙烯基还原酶(每个酶都有特异底物) 催化生成相应的单乙烯中间物质(Rebeiz CA, Kolossov VL，Briskin D, Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis :chlorophyll biosynthetic heterogeneity, multiple biosynthetic routes，and biological spin-offs, in :Nalwa HS (Ed.), Handbook of Photochemistry and Photobiology, vol.4, American Scientific， Los Angeles 183-248) ο现已从拟南芥、绿硫细菌Chlorobium tepidum和蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803中分别克隆了相应的C-8乙烯基还原酶基因DVR、bciA和slrl923 (Nagata N， Tanaka R， Satoh S， Tanaka A(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaiiana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species.PlantCell 17 :233_240 ；Chew AGM, Bryant DA (2007)Characterization of a Plant-IikeProtochlorophylIide a DivinylReductase in Green Sulfur Bacteria. J Biol Chem 282 2967-2975 ；Islam MR, Aikawa S, Midorikawa T, Kashino Y, Satoh K, KoikeH (2008)slrl923 of Synechocystis sp. PCC6803 is essential for conversion of 3,8-divinyl (proto)chlorophyll(ide)to 3-monovinyl (proto) chlorophyll (ide). Plant Physiology 148 :1068-1081)。已有实验证 明用NADPH作为还原剂，重组的绿硫细菌Chlorobium tepidum BciA蛋白质将DV Pchlide a 还原成 MV Pchlide a (Chew AGM, Bryant DA (2007) Characterization of a Plant-like Protochlorophy11ide a DivinylReductase in Green Sulfur Bacteria. J Biol Chem 282:2967-2975)；重组的拟南芥DVR蛋白质将DV Chlide a还原成MV Chlide a，但不能 将 DV Pchlide a、DV Chlide b、DV Chl a、DV Chl b 等 4 种 DV 物质转化为相应的 MV 物 质(Nagata N, Tanaka R, Tanaka A(2007)The major route for chlorophyll synthesis includes[3,8-divinyl]-chlorophyllide a reduction in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 48:1803-1808)。迄今为止，包括水稻在内的单子叶植物中还没有克隆出联 乙烯还原酶(即C-8乙烯基还原酶)基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白，来源于水稻 (Oryza sativa L.) 。本发明提供的与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与单乙烯叶绿素a合成相关的由1)衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。上述与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白的编码基因为如下1)_4)中任一所述的基 因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第9位至1226位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。序列1共1241个碱基，开放阅读框在序列1中的第9-1226位，其中第9_11位为 起始密码子，第1224-1226位为终止密码子。含有上述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之 内。上述重组载体具体可以为在pET30的多克隆位点间插入上述基因得到的重组表 达载体。扩增上述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。上述的蛋白或上述的基因在转化联乙烯叶绿素a为单乙烯叶绿素a中的应用也属 于本发明的保护范围之内。实验证明本发明提供的蛋白可以将联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a。
图1为水稻突变体824ys和野生型亲本824B的田间植株照片，A，幼苗期野生型 (左)和824ys突变体(右)植株表型，B,结实期野生型(左)和824ys突变体(右)植 株表型。图2为HPLC检测水稻突变体824ys和野生型亲本824B(WT)的叶绿素保留时间 (左)和吸收峰(右)的差异。图3为OsDVR酶学反应产物的HPLC检测光谱图，其中左边为保留时间，右边为吸 收峰；从上至下依次为A1是从野生型亲本824B叶绿素中分离出来的正常的单乙烯叶绿素 a (MV Chla) ；A2是从突变体824ys叶绿素中分离出来的联乙烯叶绿素a (DV Chla) ；A3是DV Chla与BL21/pET30空载体反应后的色素；A4是DV Chla与BL21/pET30_0sdvr表达的蛋白 质反应后的色素 ’A5是DV Chla与BL21/pET30-0sDVR表达的蛋白质反应后的色素。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。本发明的完成所依赖的遗传资源如下籼稻品系824B，于2004年8月，由四川农业大学自行培育的，培育所用父本是D香 1B，母本是R 46B。记载过该籼稻品系824B的非专利文献是黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓 建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007， 21(4) 355-359)。本发明涉及的其它材料如下突变体824ys，记载过该材料的非专利文献是(黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓 建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007， 21 (4) :355-359)。LB/kan培养基(液)，其组成是胰蛋白胨(Tryptone) IOg,酵母提取物 (YeastExtract) 5g，氯化钠(NaCl) 5g，琼脂粉(Agar power) 15g, PH 7.0，定容至 1L，灭菌后 冷却到约50°C时，加入卡那霉素(Kan) 50mg，制成LB/kan培养基；上述成份中不加琼脂粉则 制成LB/kan培养液。实施例1、水稻联乙烯叶绿素a还原酶基因的克隆及其验证一、水稻联乙烯叶绿素a还原酶基因的克隆1、基因的发现本发明人在水稻(品系为“824B”)中分离了一个自发突变体824ys (图1)，该突 变体在整个生长期显示黄绿叶型，叶绿素含量降低，叶绿体发育受到抑制，植物生长迟缓， 分蘖显著减少等(黄晓群，王平荣，赵海新，邓晓建.一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的 遗传分析与分子标记定位.中国水稻科学，2007，21 (4) :355-359)。遗传分析发现该突变体 受一对隐性核基因控制。通过图位克隆方法，鉴定了一个与拟南芥联乙烯叶绿素酸酯a(DV Chlide a)还原酶基因(DVR)同源的基因0s03g22780，命名为OsDVR。OsDVR位于水稻第3 染色体短臂上，其核苷酸序列如序列表序列1所示，其开放阅读框(ORF)是自5’端第9位 至1226位(序列1共1241个碱基，开放阅读框在序列1中的第9-1226位，其中第9_11位为起始密码子，第1224-1226位为终止密码子)。ORF由1218个核苷酸组成，编码序列表中 序列2所示的蛋白，序列2由405个氨基酸组成，分子量约为43kD。通过http //www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/预测，其编码的氨基酸在N末端含有58个氨基酸的叶绿体靶序 列，表明此蛋白质位于叶绿体上。824ys突变体中的该基因的开放阅读框(ORF)有9个核苷 酸缺失，也即序列1的自5’端第960位至968位缺失，导致3个氨基酸的缺失。2、水稻联乙烯叶绿素a还原酶基因的克隆合成下述引物对Pl 5' CAGGATCCATGGCTGCCCTCCTCCTCT 3‘(下划线为 BamH I 酶切位点)P2 5' GAAGAATTCCGAGGCCTAGAAGATGGT 3‘(下划线为 EcoR I 酶切位点)以正常绿色水稻籼稻品系824B的叶片提取的DNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR 扩增，得到1241bp的片段，将该片段连接在pMD-18-T (TaKaRa)载体上，构建成pMD_0sDVR， 然后转化到大肠杆菌JM109菌株中，筛选阳性克隆后测序。测序结果表明扩增得到的片段 具有序列表中序列1所示的序列，其开放阅读框是第9位至第1226位。序列比对分析发现 该基因与拟南芥的联乙烯还原酶基因DVR同源，因此将测序过的该片段命名为OsDVR。另外，从水稻824ys突变体的叶片提取的DNA为模板，用引物Pl和P2进行PCR扩 增，得到1232bp的片段，将该片段连接在pMD-18-T载体上，构建成pMD-Osdvr，然后转化到 大肠杆菌JM109菌株中，筛选阳性克隆后测序。测序结果表明扩增得到的片段在序列表中 序列1所示的序列第960至968位缺失了 9个核苷酸，将测序过的该片段命名为Osdvr。3、籼稻品系824B与突变体824ys的叶绿素HPLC分析因为该基因OsDVR与拟南芥的联乙烯还原酶基因DVR同源，根据文献(NagataN， Tanaka R, Satoh S, Tanaka A(2005)Identification of a vinyl reductase gene forchlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution ofProchlorococcus Species. Plant Cell 17 :233_240)知，如果植物体内联乙 烯还原酶缺失，那么植物内叶绿素生物合成的最终产物应是联乙烯叶绿素。为了进一步确 认是OsDVR基因突变造成了 824ys突变体表型，本发明对野生型水稻品系824B和突变体 824ys的叶绿素进行了 HPLC检测。首先用100%丙酮浸提野生型籼稻品系824B与突变体824ys叶片中的叶绿素， 然后用HPLC对两种叶绿素分别进行分析，HPLC检测条件是流动相甲醇乙腈丙酮= 1:3: 1，401，11111/111士11，上样量5“1(4.6讓 i. d. X 150mm long ;C18，5 μ m，Agilent)，柱 中洗脱的色素用660nm的波长监测。结果如图2所示，洗脱突变体叶绿素a的保留时间比野生型824B提前了约18秒， 吸收峰红移10nm，野生型叶绿素a的吸收峰是430nm和664nm，突变体为440nm和664nm ； 洗脱叶绿素b的保留时间和野生型824B基本相同，但吸收峰也发生了变化，野生型叶绿 素b的吸收峰是462nm和648nm，突变体为472nm和652nm，表明突变体的叶绿素是联乙烯 叶绿素 a 和联乙烯叶绿素 b (Shedbalkar VP, Rebeiz CA (1992) Chloroplast biogenesis Determination of the molar extinction coefficients ofdivinyl chlorophyll a and b and their pheophytins. Anal Biochem 207 261-266 ；Nakanishi H, Nozue H, Suzuki K, Kaneko Y, Taguchi G, Hayashida N(2005)Characterization of the Arabidopsis thaliana mutant pcb2 whichaccumulates divinylchlorophylls. Plant Cell Physiol46 :467_473 ；Nagata N，Tanaka R，Satoh S，Tanaka A(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsisthaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species. Plant Cell 17 233-240)，同时也说明突变体中联乙烯还原酶发生了突变，乙烯基不能还原为乙基，因而不 能生成正常的单乙烯叶绿素。样品的叶绿素a和b的保留时间和吸收波长是根据标准样品叶绿素a和b的保留 时间和吸收波长所确定的，标准样品叶绿素a和b购自Sigma公司。二、水稻联乙烯叶绿素a还原酶基因编码的蛋白的功能验证1、重组载体的构建将步骤一的步骤2中经验证正确的pMD-OsDVR和pMD_0sdvr用BamHI和 EcoRI双酶切，连接到经同样酶切过的表达载体pET30 (Novagen)上，构成重组表达载体 pET30-0sDVR和pET30_0sdvr。将重组表达载体pET30_0sDVR和pET30_0sdvr转化大肠杆菌 菌株BL21，在37°C，LB/kan培养基上过夜培养，挑选单克隆于37°C，LB/kan培养液中振荡 培养，提取质粒DNA (OMEGA试剂盒)，用BamHI和EcoRI双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测OsDVR 和Osdvr基因是否插入载体pET30中，将检测含有OsDVR和Osdvr基因的重组表达载体的 克隆送上海英骏公司测序，筛选正确插入PET30的OsDVR和Osdvr基因的重组表达载体的 克隆，命名为 BL21/pET30-0sDVR 和 BL21/pET30_0sdvr。2、诱导表达^ M JC M (Nagata N, Tanaka R, Satoh S, Tanaka A (2005) Identification ofa vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species. Plant Cell 17: 233-240 ；Nagata N, Tanaka R, Tanaka A(2007)The major route for chlorophyll synthesis includes[3, 8-divinyl]-chlorophyllide a reduction in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 48 1803-1808)的方法将 BL21/pET30_0sDVR 和 BL21/ pET30-0sdvr进行诱导表达，具体方法如下分别挑选BL21/pET30_0sDVR，BL21/ pET30-0sdvr和含有空载体pET30的BL21 (空载体对照CK)单克隆于20°C，LB/kan培养 液中振荡培养过夜，分别取Iml菌液于IOOml LB/kan培养液，30°C振荡培养30min后加入 IPTG (终浓度为0. 5mM)，于30°C诱导培养7h，4°C IOOOOrpm离心lOmin，沉淀用含有6. 7ug πιΓ1溶菌酶和3. 3ug mr'DNasel酶的50mM Tris-HCl的溶液悬浮，溶解产物放入_20°C冰箱 保存。用SDD-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达的蛋白质。结果显示在约43KD处，BL21/ pET30-0sDVR和BL21/pET30_0sdvr均有明显的蛋白质，而对照空载体CK没有，说明OsDVR 和Osdvr基因在BL21中表达了蛋白质，并且蛋白质的分子量与推测的相符合。3、酶促反应验证蛋白功能将BL21/pET30-0sDVR表达的蛋白、突变体对照(pET30_0sdvr表达的蛋白)和 空载体对照分别与联乙烯叶绿素a在反应buffer中30°C反应lOmin，然后用丙酮终止反 应，转入乙醚中，经氮气吹干，再溶于丙酮，最后用HPLC检测，流动相甲醇乙腈丙酮= 1:3: 1，401，11111/1^11，进样量5111(4.6讓 i. d. X 150mm long ；C185um,Agilent) (Nagata N, Tanaka R, Tanaka A(2007)The major route for chlorophyllsynthesis includes[3,8-divinyl]-chlorophyl1ide a reduction in Arabidopsis thaliana. PlantCell Physiol 48 :1803-1808)，柱中洗脱的色素用660nm的波长监测。其中，反应底物联乙烯叶绿素a是从水稻824ys突变体的叶绿素中通过HPLC分离 出来的。分离方法是参照步骤一的步骤3，首先用100%丙酮浸提突变体824ys叶片中的 叶绿素，然后用HPLC对其叶绿素进行分离，HPLC检测条件是流动相甲醇乙腈丙酮= 1:3: 1，401，11111/111士11，上样量5“1(4.6讓 i. d. X 150mm long ;C18，5 μ m，Agilent)，柱 中洗脱的色素用660nm的波长监测。如图2所示，洗脱突变体联乙烯叶绿素a的保留时间 比正常的单乙烯叶绿素a对照(购自Sigma公司，或按同样方法从正常绿色水稻品种的叶 片中浸提和分离)提前了约18秒，吸收峰红移10nm(正常的单乙烯叶绿素a对照的吸收峰 是430nm和664nm，而突变体联乙烯叶绿素a为440nm和664nm)，在相应保留时间收集联乙 烯叶绿素a。结果如图3所示，联乙烯叶绿素a(DV Chla)与BL21/pET30_0sDVR表达的蛋白质 反应后，其中大部色素的保留时间和吸收峰发生变化，变得与单乙烯叶绿素a(MV Chla)相 同(参见图3中的A5)，而DV Chla与BL21/pET30-0sdvr表达的蛋白质反应后，或与BL21/ PET30空载体反应后，其色素的保留时间和吸收峰均与DVChla—样，没有发生变化(分别参 见图3中的A4和A3)，表明BL21/pET30-0sDVR表达的蛋白质将联乙烯叶绿素a转化为单乙 烯叶绿素a，而突变体对照和空载体对照不能转化联乙烯叶绿素a为单乙烯叶绿素a。这证 明824ys突变体是由OsDVR基因的突变所造成的，OsDVR基因编码有功能的联乙烯叶绿素 a还原酶OsDVR，本发明首次证实联乙烯叶绿素a还原酶转化联乙烯叶绿素a为单乙烯叶绿 素a(即正常的叶绿素a)。序列表<110>四川农业大学<120> 一种与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白及其编码基因<160>2<210>1<211> 1241<212>DNA<213> 水稻(Oryza sativa L.)<400>1caggatccatggctgccctcctcctctcctcccacctcaccgccgcctcctcatcctcca60
ccacgtcccccactgctcgaccggcgccaagcttcgtctccttccgcgccgccaacgccg120
cccctaagggtgcccgtcggggttggcctttccttgcttcgtcggtagagccaccgcctg180
CtgCgtCggCggcgcagccgttccggtcactggcgccgtcggagaccaccgtgctggtca240
cgggcgccacgggctacatcgggcgttatgtcgtccgcgagctcctccgccgcggccacc300
CCgtggtCgCCgtggCgCgCccccggagcgggctgcgcggccgcaacggccccgacgagg360
tcgtcgcggacctcgcccccgcccgcgtcgtcttctccgacgtcaccgacgcgggcgcgc420
tccgcgccgacctgtcgccgcacggccccatccacgccgcggtgtgctgcctcgccagcc480
gcggcggcggcgtgcgggactcgtggcgcgtggactaccgcgccacgctgcacaccctcc540
aggcggcgcgcggcctcggcgccgcgcacttcgtcctcctctccgccgtctgcgtccaga600
1801851900114]AlaValCysValGlnLysProLeuLeuGluPheGlnArgAlaLysLeu0115]1952002050116]ArgPheGluGlyGluLeuAlaAlaGluAlaSerArgAspProSerPhe0117]2102152200118]ThrTyrSerlieValArgProThrAlaPhePheLysSerLeuGlyGly0119]2252302352400120]GlnValGluThrValLysAsnGlyGlnProTyrValMetPheGlyAsp0121]2452502550122]GlyLysLeuCysAlaCysLysProlieSerGluGluAspLeuAlaAla0123]2602652700124]PhelieAlaAspCyslieSerAspGluGlyLysAlaAsnLyslieLeu0125]2752802850126]ProlieGlyGlyProGlyLysAlaLeuThrProLeuGluGlnGlyGlu0127]2902953000128]MetLeuPheArgLeuLeuGlyArgGluProArgPhelieLysValPro0129]3053103153200130]lieGlnValMetAspAlaAlalieTrpValLeuAspAlaLeuAlaLys0131]3253303350132]ValPheProGlyValGluAspAlaAlaGluPheGlyLyslieGlyArg0133]3403453500134]TyrTyrAlaSerGluSerMetLeuValLeuAspProAspThrGlyGlu0135]3553603650136]TyrSerAspGluMetThrProSerTyrGlySerAspThrLeuGluGln0137]3703753800138]PhePheGluArgVallieArgGluGlyMetAlaGlyGlnGluLeuGly0139]3853903954000140]GluGlnThrliePhe0141]405
10
权利要求
一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与单乙烯叶绿素a合成相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)_4) 中任一所述的基因1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第9至1226位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pET30的多克隆 位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。
6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任一片段的引物对。
7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的基因在转化联乙烯叶绿素a为单乙 烯叶绿素a中的应用。 全文摘要
本发明公开了一种与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白及其编码基因。本发明提供的与单乙烯叶绿素a合成相关的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与单乙烯叶绿素a合成相关的由1)衍生的蛋白质。实验证明本发明提供的蛋白可以将联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a。
文档编号C12N15/63GK101899424SQ20091023838
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者万春美, 张帆涛, 王平荣, 邓晓建, 高家旭 申请人:四川农业大学