专利名称：副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法
技术领域：
本发明涉及动物疫病防控领域，特别是涉及一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载 体及构建方法。
背景技术：
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, Hps)是巴氏杆菌科成员，革兰氏阴性小 杆菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎；出现以发热、咳嗽和呼吸障碍等为特征的呼 吸道疾病症候群。可以并发或继发于蓝耳病、伪狂犬病、细小病毒病、圆环病毒病、猪瘟等 疫病，使疫情复杂化，经济损失加重。Glasser(1910)首次报道了该菌与猪的纤维素性浆 膜炎和多发性关节之间的联系，故该病也称Glasser’ s病，Kilianl976证明了该菌生长 时不需要X因子(血红素和其它卟啉类物质)，将该菌命名为副猪嗜血杆菌(Bouchet B， Vanier G, Jacques Μ, et al. Studies on the interactions of Haemophilus parasuis with porcine epithelial tracheal cells :Limitedrole of LOS in apoptosis and pro-inflammatory cytokine release[J]. Microbial Pathogenesis. 2009,46(2) 108-113)。芳香族氨基酸在细菌中只有一条通过分枝酸的合成途径，打断这一途径中的任何 一个关键基因，如aroA，axoD, aroC等，都能阻断细菌芳香族氨基酸的合成，而芳香族氨基 酸在哺乳动物细胞内不是一种代谢产物，含量甚微，故细菌从宿主体内获得这些化合物的 可能性极小，因此这些基因发生突变的细菌在宿主体内只能有限生长繁殖从而导致减毒效 应(刘英杰，芮贤良，徐永强，等.志贺氏菌芳香族氨基酸缺陷减毒株的构建[J].武警医 学· 1999(02) 68-70.)。自杀质粒是指那些在某些特定的细菌中自主复制而在其它细菌中不能自主复制 的质粒，它的复制需要一种特殊蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细 胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合到染色体上和染色体一起复制，利用自杀质粒的 这一特点，将基因工程技术构建的基因突变DNA片段，克隆入自杀质粒，利用突变基因两端 的同源片段与基因组发生同源交换重组构建精确的基因缺失株(徐建国主编.分子医学细 菌学[M].北京科学出版社，2000:296)，基因缺失株可作为动物疫病防治的疫苗。徐引弟等构建了重组自杀性质粒，获得了猪霍乱沙门氏菌突变株(徐引弟，郭爱 珍，陈焕春.猪霍乱沙门氏菌C500株crp _/gfp +缺失株的构建及鉴定[J].农业生 物技术学报.2008 (02) :196-201.)。罗晓松等通过自杀质粒构建了嗜水气单胞菌aopB-/ aopD-/aroA-缺失株(罗晓松，尚书，侯化鹏，等.鱼源嗜水气单胞菌aopB -/aoopD -/ aroA -缺失株的构建及鉴定[J].农业生物技术学报.2009 (01) :440_442.)。胡奕等利 用自杀性载体和同源重组的原理构建了 045的Ier基因缺失突变菌株PEPEC 045 ( Δ ler)， 并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠和乳猪的被动免疫保护作用进 行了研究，并证明所构建的045 (Aler)基因缺失突变弱毒菌株可作为预防PEPEC 045感染 的疫苗候选株(胡奕，宋杰，赵宝华.肠致病性大肠杆菌045基因缺失疫苗菌株的构建及其免疫原性分析[J].生物工程学报.2009 (02) :181-188.)。
发明内容
本发明针对防治副猪嗜血杆菌所致动物疫病的需要，提供一种副猪嗜血杆菌aroA 基因自杀载体及构建方法，该载体可用于构建筛选的副猪嗜血杆菌的弱毒力突变菌株，以 作为防治疫病的疫苗候选株。 一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨 架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因插入 在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述自杀载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制 的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表达盒，所述抗生素表 达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。所述骨架载体的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示，带有一个R6K条件复制起点，卡 那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI，。所述抗生素表达盒为具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列的氯霉素表达盒。所述副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，其核苷酸序列如SEQ ID N03所示。一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体的构建方法，包括如下步骤(1)以 EZ-Tn5 <R6K y ori/KAN_2> 转座子为模板，PCR 扩增得到如 Seq ID No. 1 所 示的核苷酸序列，酶切连接环化为骨架质粒PSD ；(2)以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的基因组为模板，PCR扩增aroA基 因，如SEQ ID N04所示，并连接到质粒pGM-T上得到重组质粒pT_aroA ；(3)以PACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，扩增氯霉素表达盒片段cm 的引物5’端设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，(4)使用cm的引物中酶切位点的限制性内切酶酶切氯霉素表达盒片段cm和 pT-aroA，连接获得重组质粒pT-aroA-cm ；(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组自杀载体pSD-aroA-cm。所述扩增骨架载体的引物含有Nolt位点，序列如下SD-F 5ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG3SD-R 5TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC3。所述扩增aroA基因的引物如下 aroA-F 5TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG3，aroA-R 5TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC3，所述酶切pt-aroA-cm和pSD的限制性内切酶为BamHI、SalI。所述扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置有HindIII酶切位点，序列如下ChlF 5TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC3，ChlR 5AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA3 ；所述酶切氯霉素表达盒片段 cm 和 pT-aroA的限制性内切酶为HindIII。筛选aroA基因插入突变的副猪嗜血杆菌突变菌株的方法，将所述副猪嗜血杆菌 aroA基因自杀载体转化到副猪嗜血杆菌中进行共培养发生同源单交换，通过所述抗生素表 达盒所对应的抗生素筛选阳性克隆获得突变菌株。
本发明提供一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，该载体的骨架载体包含一个条件复制起点、抗生素抗性标记位点和多克隆位点，本发明将突变的aroA基因插入到骨架 载体的多克隆位点后获得自杀载体。突变的aroA基因为在aroA基因的插入一段抗生素表 达盒，一方面作为筛选阳性突变菌株的抗性标记位点，另一方面可以作为aroA基因突变插 入序列，该抗生素表达盒中断了 aroA基因的表达，从而打断了副猪嗜血杆菌自身芳香族氨 基酸的合成，而哺乳动物不具备芳香族氨基酸的合成途径，故细菌从宿主体内获得这些化 合物的可能性极小，因此在宿主体内只能有限生长繁殖，从而导致其对寄主细胞的毒力大 大减弱；该自杀载体环化连接后得到自杀质粒，其中条件复制起点限制其只能在表达η蛋 白的细菌中自主复制，而副猪嗜血杆菌不表达η蛋白，因此转入副猪嗜血杆菌后，超螺旋 的自杀质粒便会被线性化，因自杀质粒上含有受体菌副猪嗜血杆菌的基因同源序列一突 变的aroA基因中抗生素表达盒的两侧序列，线性化的自杀质粒便会杂交到受菌体的染色 体上，随着副猪嗜血杆菌基因组的复制，自杀质粒与受体菌的aroA基因发生置换，即同源 单交换，随着受体菌的分裂和染色体的复制，产生含有突变的aroA基因的副猪嗜血杆菌突 变菌株，自杀质粒的aroA基因中插入的抗生素表达盒为作为筛选阳性突变菌株的标记位 点，因此可加入该抗生素选出副猪嗜血杆菌aroA基因突变株。本发明进一步提供具体的骨架载体如Seq ID No. 1所示，带有一个R6K条件复制 起点R6K，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI, XbaI, Sail、AccI、HincII, PstI和SphI。该骨架载体只能在表达π蛋白的细菌中增殖，副猪嗜血杆菌不表达π蛋白， 因此限制该自杀载体在副猪嗜血杆菌中的自主复制。本发明的自杀载体中，突变的aroA基因插入序列为氯霉素表达盒，氯霉素是一种 常用抗性筛选物，并与卡那霉素相区别，共同用于筛选本发明的所要获得的阳性重组自杀 载体，其中氯霉素用于筛选本发明所要获得的阳性突变菌株。所述氯霉素表达盒插入在aroA基因的HindIII位点，该位点处于aroA基因的中 上游位置，如Seq ID No. 4的aroA基因起始密码子后第170bp位置，有利于及时阻断aroA 基因表达。本发明获得的自杀载体转入副猪嗜血杆菌中，由于不能自主复制，因此只能整合 到副猪嗜血杆菌得基因组DNA中，因发生同源重组单交换而将副猪嗜血杆菌中的aroA基因 置换成突变的aroA基因，通过抗生素筛选获得aroA基因突变株。将基因突变株接种到哺 乳动物细胞后，由于宿主细胞不产生芳香族氨基酸，因此接种的突变株细菌的增殖受到严 重减弱甚至不能复制繁殖，因此对宿主的毒力大大减弱，但能够使宿主对副猪嗜血杆菌产 生抗体，因此这样的突变株可作为预防副猪嗜血杆菌感染所致疫病的疫苗候选株。根据本发明的提供的自杀载体的结构，构建该自杀载体的方法是本领域常用的实 验方法，其中主要涉及到限制性酶切、连接，及在扩增各段序列的引物中设置酶切位点，以 便于下一步与载体或其他片段连接。本发明进一步提供构建该自杀载体的方法。以EZ-Tn5TM<R6K y ori/KAN-2>转座 子为模板，PCR扩增得到2000bp的如Seq ID No. 1所示的骨架载体片段，扩增引物5’端含 有NotI位点，用NotI内切酶酶切后，连接得到环化的骨架质粒pSD，其中顺次包括条件复 制起点R6K，卡那抗性选择标记和多克隆位点NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI 和SphI。以副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的基因组为模板，上下游扩增引物5’端分别设计有BamHI和SalI位点，以便于连接到骨架载体的多克隆位点上，PCR扩增含 有aroA基因的片段，如SEQ ID N04所示，克隆到质粒pGM_T上得到重组质粒pT_aroA ；以 PACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，如SEQ ID N02所示，扩增cm的引物5，端 设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，本发明优选HindIII酶切位点，cm插入 到pT-aroA的aroA基因中HindIII酶切位点使aroA基因突变，并获得含突变的aroA基因 的重组质粒pT-aroA-cm ；以BamHI和SalI双酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组自 杀载体 pSD-aroA-cm，如 SEQ ID NO. 3 所示。综上所述，本发明构建的自杀载体，可转化到副猪嗜血杆菌中，用于筛选基因突变 株，基因突变株不能自身合成芳香族氨基酸，也不能从宿主细胞获得足够的芳香族氨基酸， 只能有限繁殖，因此对宿主毒力非常弱，但能像野生菌株一样对宿主的免疫系统能产生诱 导，可作为预防副猪嗜血杆菌所致疫病的疫苗候选株。
图1.自杀载体质粒pSD的构建及鉴定1.载体骨架 PCR 扩增(2000bp) ；2. Marker DL15000 ;3_5· BamHI\SalI\NotI 单酶 切鉴定PSD载体图2. aroA基因的扩增1. Marker DL15000, 2-3. aroA 基因 PCR 产物 2304bp图3.图3氯霉素基因的扩增1. Marker DL2000 ；2-3.氯霉素基因 PCR 产物，906bp图4. pT-aroA 的鉴定1. Marker DL15000 ；2.载体骨架 PCR 扩增 2001bp ；3. pT-aroA 的 EcoRI 酶切鉴 定，三条带(3. 0kb+l. 4kb+0. 9kb) ；4. pT-aroA 的 NotI 酶切鉴定，两条带(3. Okb+2. 3kb)； 5. pT-aroA 的 HindIII 酶切鉴定，一条带(5. 3kb)图5.重组质粒pT-aroA-cm的酶切鉴定1. Marker DL15000bp ；2. pT-aroA-cm 的 BamHI+Sall 双酶切鉴定，两条带 (3. Okb+3. 2kb) ；3. pT-aroA-cm 的 EcoRI 鉴定，四条带(3. Okb+1. 7kb+0. 9kb+0. 6kb)； 4. pT-aroA-cm 的 HindIII 单酶切鉴定，两条带(5. 3kb+0. 9kb) ；5. pT-aroA-cm 的 NotI 酶切 鉴定，两条带(3. Okb+3. 2kb)图6.重组自杀质粒pSD-aroA-cm的构建及鉴定1. Marker DL15000bp ；2. pSD-aroA-cm 的 BamHI 单酶切鉴定，一条带(5. 2kb)； 3. pSD-aroA-cm 的 BamHI+Sall 双酶切鉴定，两条带(2. Okb+3. 2kb)图7重组自杀质粒pSD-aroA-cm的分子构成示意图
具体实施例方式1材料与方法1. 1.菌株和质粒副猪嗜血杆菌5型标准菌株HS80，本实验室有保存，可向公众发放(实现本发明的 目的，也可以用任何别的副猪嗜血杆菌菌株)质粒pGM-T和大肠杆菌T0P10购自天根生物技术有限公司；
EZ-Tn5 <R6K y ori/KAN_2>转座子和表达π蛋白的感受态大肠杆菌EC100D pir-116 购于 EPICENTRE 公司；pACYC184质粒，本实验室有保存可向公众发放，也可购买到。1. 2主要试剂PCR预混体系2 XPCR superMix、小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试 剂盒购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，细菌基因 组提取试剂盒购自QIAGEN公司，引物(表1)合成及测序由Irwitrogen公司完成。核酸限 制性内切酶BamH I、SalI和Hind III均为TaKaRa(大连)公司产品。1. 3PCR引物设计本发明使用引物(表1)由Invitrogen公司合成。表1本研究中所用引物Table lprimers used in this paper 注下划线为酶切位点序列实施例1.骨架载体pSD的构建以EZ-Tn5 <R6K y ori/KAN_2>为模板，扩增长度2000bp载体骨架，带有一个R6K 条件复制起点R6K，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点NotI、BamHI, XbaI, Sail, AccI、 HincII, PstI和SphI，用于扩增的上下游引物SD-F/SD-R的5’端设计NotI限制性内切酶 位点(见表1)，PCR体系及条件PCR预混体系2 X PCR superMix 25 μ L，H2O 22 μ L，上下游 引物 SD-F/SD-R 各 1 μ L，模板 1 μ L。95°C变性 5min ；94°C 30s, 56°C 45s, 72°C 30s, 30 个循 环；72°C IOmin0 PCR验证扩增片段大小约2000bp，大小与预期相符，如图1第2泳道，测序 结果正确；PCR产物通过引物上的NotI位点进行酶切、连接环化得到质粒pSD，酶切鉴定质 粒pSD，结果如图1 ；pSD转化感受态大肠杆菌EC100D pir-116。实施例2.突变的aroA基因的制备步骤1.使用细菌基因组提取试剂盒提取Hps基因组为模板，使用表1中的引物 aroA-F/aroA-R扩增aroA基因，引物5’端分别设入了 BamHI、SalI位点，PCR扩增片段序列如Seq ID NO. 4所示，包括整个aroA基因(1314bp)及其上游约952bp片段和下游部分片 段，与引物设计所预期的大小相符约2300bp (见图2)，扩增片段与质粒pGM-T连接，得到重 组质粒pT-aroA，并转化到感受态大肠杆菌ToplO中，增菌后提取质粒pT-aroA，pT-aroA的 EcoRI酶切鉴定，得到三条带3. 0kb、l. 4kb、0. 9kb ；NotI酶切鉴定得到两条带3. Okb+2. 3kb ； Hindlll酶切鉴定，一条带(5. 3kb)酶切结果与预期相符，如图4所示。步骤2.以pACYC184质粒为模板，使用表1中的引物ChlF/ChlR扩增氯霉素表达 盒片段cm，氯霉素基因片段长约906bp，扩增大小与预期相符(见图3)。步骤3.如Seq ID NO. 4所示，在Seq ID NO. 4所示核苷酸序列的第1124bp位点即 在aroA基因起始密码子后第173bp位点处有一个Hindlll位点，可以用来制备aroA插入突 变载体。cm和质粒pT-aroA经Hindlll酶切消化，连接后筛选阳性重组质粒pT-aroA-cm， 酶切鉴定pT-aroA-cm，见图5，鉴定结果与预期相符合。实施例3.含突变aroA基因的自杀质粒的构建pT-aroA-cm重组质粒和pSD都经过限制性内切酶BamHI与Sail的消化后，回收 aroA-cm片段，核苷酸序列如Seq ID NO. 5所示，经连接反应插入到骨架载体pSD上，构建成 pSD-aroA-cm重组自杀载体，结构如图7所示，转化感受态大肠杆菌EC100D pir_116，用氯 霉素和卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒pSD-aroA-cm，用PCR、酶切进行鉴定，如图6所示 BamHI单酶切鉴定，一条带(约5. 2kb) ；3. pSD-aroA-cm的BamHI+Sall双酶切鉴定，两条带 (约2. Okb+3. 2kb)，证明构建获得自杀载体。SEQUENCE LISTING<110>北京市农林科学院<120>副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法<130>P09528/NLK<160>11<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2000<212>DNA<213>骨架载体<400>1ggtgtctcaa aatctctgataaaactgtct gcttacataaaacgtcttgc tcgaggccgcatgggctcgc gataatgtcgcgatgcgcca gagttgtttctgagatggtc agactaaacttatccgtact cctgatgatgccaggtatta gaagaatatccctgcgccgg ttgcattcgatcgtctcgct caggcgcaat
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〈213〉重组质粒pT-aroA-cm的序列
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13
<213>扩增氯霉素表达盒的引物ChlR<400>11agaagcttaa atacctgtga cggaaga2权利要求
一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因插入在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述自杀载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，所述骨架载体的核苷酸序 列如Seq ID No. 1所示，带有一个R6K条件复制起点，卡那抗性选择标记位点和多克隆位点 NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI 和 SphI。
3.根据权利要求1或2所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，所述抗生素表达盒为 具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列的氯霉素表达盒。
4.根据权利要求3所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，其核苷酸序列如SEQ IDN03所示。
5.一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体的构建方法，包括如下步骤(1)以EZ-Tn5 <R6KYori/KAN-2>转座子为模板，PCR扩增得到如SeqID No. 1所示的 核苷酸序列，连接环化为骨架质粒PSD ；(2)以副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)的基因组为模板，PCR扩增aroA基因， 如SEQ ID N04所示，并连接到质粒pGM-T上得到重组质粒pT_aroA ；(3)以pACYC184质粒为模板扩增氯霉素表达盒片段cm，扩增氯霉素表达盒片段cm的 引物5’端设置有aroA基因序列中任意一个限制性酶切位点，(4)使用cm的引物中酶切位点的限制性内切酶酶切氯霉素表达盒片段cm和pT-aroA， 连接获得重组质粒pT-aroA-cm ；(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后连接得到重组自杀载体pSD-aroA-cm。
6.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增骨架载体的引物含有NotI位点，序列如下SD-F 5-ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG-3SD-R :5-TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC-3。
7.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增aroA基因的引物如下aroA-F 5-TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG-3，aroA-R 5-TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC-3，所述酶切pT-aroA-cm和pSD的限制性内切酶为BamHI、Sail。
8.根据权利要求5所述的构建方法，所述扩增氯霉素表达盒片段cm的引物5’端设置 有HindIII酶切位点，序列如下ChlF 5-TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC-3,ChlR :5-AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA-3 ；所述酶切氯霉素表达盒片段 cm和 pT-aroA 的限制性内切酶为HindIII。
9.筛选aroA基因插入突变的副猪嗜血杆菌突变菌株的方法，指将权利要求1 4任一 所述的副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体转化到副猪嗜血杆菌中进行共培养发生同源单交 换，通过所述抗生素表达盒所对应的抗生素筛选阳性克隆获得突变菌株。
全文摘要
本发明“一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体及构建方法”，属于动物疫病防控领域，一种副猪嗜血杆菌aroA基因自杀载体，包括骨架载体和突变的aroA基因，所述骨架载体包含条件复制起点、抗生素抗性选择位点和多克隆位点，所述突变的aroA基因插入在所述多克隆位点上，所述条件复制起点指使所述自杀载体不在副猪嗜血杆菌中自主复制的起始序列，所述突变的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表达盒，所述抗生素表达盒与所述抗生素抗性选择位点为分别针对不同的抗生素选择的基因位点。本发明提供的自杀载体能够用于选择aroA基因突变的弱毒副猪嗜血杆菌菌株。
文档编号C12N15/74GK101875944SQ20091023804
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者叶飞, 孙慧玲, 张培君, 张莉, 徐慧, 徐福洲, 王宏俊, 贺云霞, 龚玉梅 申请人:北京市农林科学院