专利名称：豌豆的pcr鉴定用引物及pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对豌豆生物资源进行PCR鉴定用引 物及使用该引物的PCR鉴定方法。
背景技术：
豌豆属豆科植物，我国已有两千多年的栽培历史，现在各地均有栽培，主要产区有 四川、河南、湖北、江苏、青海等十多个省区。豌豆的营养价值比较丰富，在豌豆荚和豆苗的 嫩叶中富含维生素C和能分解体内亚硝胺的酶，可以分解亚硝胺，具有抗癌防癌的作用。此 外，与一般蔬菜有所不同，豌豆所含的止杈酸、赤霉素和植物凝素等物质，具有抗菌消炎，增 强新陈代谢的功能。我国是一个豌豆属植物种质资源十分丰富的国家，有许多优良品种，这 些品种已成为我国许多地区生产上大量栽培的品种，大大地促进了我国豌豆相关产业的发 展。为防止我国豌豆种质资源的流失，对我国的社会生产力造成难以估量的损失，应该加大 对我国豌豆资源的保护与研究工作。 以前，豆类品种的辨别和鉴定都是根据栽培过程中的品种特征的区别来进行的。 即，通过对豆类进行长期的栽培，追踪观察其成长过程中的特征，从而进行鉴定。这种品种 鉴定方法至少需要一年。尤其，对于近似品种的豆类，因其在形状和颜色等特征上无明显差 异，不易通过目视鉴别。另外，随着现代生物技术的出现，使基因资源更多的是以非活体的 遗传物质形式携带出境，使得口岸查验更加困难，因而研究及建立有效的遗传资源出境检 验鉴定方法以及相关的能力建设就显得极为必要。 另一方面，利用PCR(聚合酶链反应)的基因扩增法已被广泛利用于各个领域。PCR 法是以极微量的DNA为模板，短时间内将目的DNA区域扩增至数十万倍的方法，因其精度高 而广泛被利用于医学和微生物领域。在农产品领域中，已有利用RAPD(随机扩增多态DNA) 法对稻类品种进行鉴别的方法。而作为我国重要植物种质资源的豌豆，目前国内外对其检 测识别仅限于形态上，未见有关其分子鉴定方法的研究。 上述用于鉴别稻类品种的RAPD法是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的较短 的随机多态核苷酸序列(通常为IO个碱基对)为引物，在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作 用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外 透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。由于该方法是从随机的 引物中选择RAPD标记，因此，即使没有所要鉴定品种的基因组信息也能进行鉴定。但是，该 方法有如下缺点由于使用了各自为IO个碱基对程度的较短的引物，所以退火温度较低， 容易因退火误操作而引起非特异扩增。并且，使用RAPD标记的PCR中包括鉴定所需的特异 扩增片段和多余的扩增片段，产生多个PCR产物，因此重复性较差，鉴定需要熟练的技术。
综上所述，为了保护豌豆种质资源，需要建立一种能够对难以从形态上进行判断 的豌豆进行辨别，且适合口岸检查应用的，简单且精确的生物鉴定方法，以此防止豌豆不会 以非活体遗传物质形式等非传统形态被携带出境。
发明内容
本发明所要解决的课题为，提供一种豌豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，对难以从形态上进行判断的豌豆进行简单且精确的鉴定。 本发明所要解决的课题为，提供一种豌豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，能够从原料含有豌豆的加工品以及种质资源中检测/鉴定豌豆。 本发明为了解决上述课题，应用PCR方法对豌豆的分子检测方法进行研究，通过trnL序列设计特异引物，从而建立了对豌豆稳定、高效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判定是否有豌豆核酸存在。 DNA测序技术是目前物种鉴别研究中运用最广的技术之一。而植物谱系地理学研究中主要集中研究叶绿体DNA(chloroplast DNA， cpDNA)片段该基因组具有分子量小、单亲遗传、多拷贝、结构简单及碱基序列重组少等特点，有利于进行遗传分析。此外，植物叶绿体基因的某些区域，特别是一些非编码区域存在相对较高的核苷酸置换率，不仅适合于确定物种之间的亲缘关系，同样也适合于物种鉴别研究。 植物叶绿体基因组、编码tRNA的trnL基因的内含子非编码区序列受外界选择压力小、进化速率快、能提供较多的具有系统学意义的信息位点，多用于较低分类阶元及近期分化类群间系统发育和种间、品种的鉴别研究。为此，本发明人对豌豆及其近缘种属植物的trnL序列(豌豆的trnL序列参照SEQ ID No. 3)进行了测定和比较，以期为豌豆的鉴别提供有效的分子标记系统。 本发明提供一种豌豆PCR鉴定用引物，其核苷酸序列为 正向5' -ATTCAAAATGGGCAATCCTG-3， 反向5' -TTGATTCTAATGTTTCCATTGTGAT-3'。 本发明通过分析豌豆与其近缘种植物叶绿体trnL基因序列的基础上，设计特异引物，能够快速、准确地对豌豆进行定性检测。本发明的引物可以通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得。本发明人在对相关植物的trnL序列进行测定和比较的基础上，根据豌豆trnL序列上的特异碱基位点设计了引物，因此仅对豌豆有扩增信号，而其他对照材料没有目的扩增信号。 另外，本发明提供一种豌豆PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述的引物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。 PCR 25iiL反应体系样品DNA 1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mM MgCL2 2 ii L， 10mM d證s 2 ii L， 10 ii MPrimers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNApolymerase 0. 1 li L， ddH20 15. 4 li L。本发明提供的豌豆PCR鉴定方法，其中PCR的反应过程为预变性95t:、3min，再经95。C变性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸30sec，35循环，最后72。C延伸5min。
本发明还提供一种豌豆PCR鉴定试剂盒，包括，上述引物。 可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具。
使用本发明的引物以及方法进行鉴定的样品来源包括，种子、小叶、豌豆加工品以及豌豆种质资源，但并不局限于此。 通过使用本发明的引物，对所测豌豆的DNA进行扩增，生成豌豆特异扩增片段，从而能够简单且精确地对豌豆进行鉴定。并且，本发明的引物仅对目的片段特异扩增，不会扩增其它区域，因此也能使用于一次PCR中导入两种以上引物的多重PCR中，从而能有效地縮短试验时间。并且，本研究建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、出境的禾本科类材料上检测豌豆，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。
图1是PCR对豌豆特异性检测实验； 其中1 :小扁豆、2 :蚕豆、3 :菜豆、4 :豌豆、5 :自贡冬豆、6 :吉林小粒、7 :晋豆21、8 :冀豆12、9 :野生大豆236、10 :肯农18、11 :日本晴、12 :玉米、13 :中国春、CK :水对照。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物的设计 根据豌豆trnL序列，利用软件和Primer 3设计引物，引物序列为
正向5' -ATTCAAAATGGGCAATCCTG-3，
反向5' -TTGATTCTAATGTTTCCATTGTGAT-3，。
实施例2总DNA的提取 (1)取0. 2 0. 3g植物组织，用硅胶保存，剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状，移至已灭菌的1. 5mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。 (2)在离心管中加入已在65。C预热500 y L CTAB提取液(20g/LCTAB， 1. 4M NaCl，
0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA， pH 8. 0)混匀，置于65。C水浴锅保温30分钟。 (3)将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，上下
颠倒离心管充分混匀，12000转/分钟离心15分钟。 (4)吸取上清液置于另一已灭菌的1. 5mL离心管。 (5)再加入等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，重复步骤(3)， (4)。 (6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在_201:预冷)，轻轻颠倒离心管混匀，
置于_201:冰箱，放置30分钟。 (7) 10000转/分钟离心10分钟，倒去上清液，保留沉淀.此时的沉淀物主要为DNA。 (8)加入400 ii L 70%乙醇，10000转/分钟离心5分钟，收集沉淀。置于37。C或5(TC烘箱烘干。 (9)加入100 ii L TE (或者灭菌水)溶解DNA，再加2 y L RNA酶(10mg/ml) ， 37。C保温30分钟。 (10) 1. 0%琼脂糖电泳检测DNA浓度及质量。
实施例3 PCR扩增方法的建立
1、PCR反应体系 以总DNA为模板，进行PCR反应，25 ii L反应体系中有样品样品DNA1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+ free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2 ii L， 10mM dNTPs 2 ii L，10 ii M Primers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNApolymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。
2、PCR反应条件将样品管放入ABI PCR仪后，设置如下条件进行反应预变性95t: 3min，再经95。C
变性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸30sec， 35循环，最后72。C延伸5min。反应结束后扩
增产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果。 实施例4豌豆PCR方法的特异性确定 以豌豆与其近缘种等13个豆科植物总DNA为模板，以水为阴性对照，通过PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳206bp的特异性扩增条带判定阳性结果。
试验结果 只有豌豆的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它近缘材料和阴性对照均没有扩增
信号，结果见图1。
序列表〈110〉中国检验检疫科学研究院〈120〉豌豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法
0053]〈130〉〈160>3〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1attc朋朋tg ggc朋tcctg〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ttgattctea tgtttccatt gtgat〈210>3〈211>409〈212>DNA〈213>豌豆(Zea mays)〈400>3acttecc朋g tg朋朋cttt C3朋ttcag3 ga朋ccctgg朋ttc朋朋t gggc朋tcctgagcc朋3tc cttctttctg朋朋ca朋te 3朋gttc3ga朋gtg朋朋t c朋朋朋gga
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aacaaatgga gttgacaaca ttcaattgat 180
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a皿ttttteg teagagg皿 409
权利要求
一种豌豆PCR鉴定用引物，其能对豌豆的叶绿体trnL基因进行扩增，生成豌豆特异性扩增片段。
2. 如权利要求1所述的豌豆PCR鉴定用引物，其核苷酸序列为 正向5' -ATTCAAAATGGGCAATCCTG-3'反向5， -TTGATTCTAATGTTTCCATTGTGAT-3，。
3. —种豌豆PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引 物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR的反应程序为预变性95t:、3min，再经 95。C变性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸30sec，35循环，最后72。C延伸5min。
5. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自豌豆的种子、小叶、豌豆 加工品以及豌豆种质资源。
6. —种豌豆PCR鉴定用试剂盒，包括，权利要求1或2所述引物。
全文摘要
本发明提供了一种豌豆PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本发明的豌豆PCR鉴定方法，是以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为豌豆物种资源的鉴定提供了检测方法。
文档编号C12N15/11GK101701254SQ20091023801
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者徐涛, 许瑾 申请人:中国检验检疫科学研究院