专利名称：蚕豆的pcr鉴定引物及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及对蚕豆生物资源进行检测用引物及PCR 检测方法。
背景技术：
蚕豆属豆科野豌豆属植物。蚕豆中含有调节大脑和神经组织的重要成分钙、锌、 锰、磷脂等，并含有丰富的胆石碱，有增强记忆力的健脑作用。蚕豆中的钙，有利于骨骼对钙 的吸收与钙化，能促进人体骨骼的生长发育。蚕豆中的蛋白质含量丰富，且不含胆固醇，可 以提高食品营养价值，预防心血管疾病。蚕豆中的维生素C可以延缓动脉硬化，蚕豆皮中的 膳食纤维有降低胆固醇、促进肠蠕动的作用。此外，现代人还认为蚕豆也是抗癌食品之一， 对预防肠癌有作用。蚕豆在我国各地都有种植，是重要的粮、菜、肥兼用型作物。主要用于 稻、麦田套种和中耕作物行间间种，摘青嫩荚果做蔬菜或收子食用，茎杆翻压作绿肥。我国 是一个蚕豆属植物种质资源十分丰富的国家，有许多优良品种，主要的优良品种有四川青 胡豆、南翔白皮、兴宁、莆田等。这些品种已成为我国许多地区生产上大量栽培的品种，大大 地促进了我国蚕豆相关产业的发展。为防止我国蚕豆种质资源的流失，对我国的社会生产 力造成难以估量的损失，应该加大对我国蚕豆资源的保护与研究工作。 现代生物技术的出现，使基因资源更多的是以非活体的遗传物质形式携带出境， 使得口岸查验更加困难，因而研究及建立有效的遗传资源出境检验鉴定方法以及相关的能 力建设就显得极为必要。 目前国内外对于蚕豆的识别仅限于形态上，未见分子检测方法的研究。 本发明应用PCR方法对蚕豆的分子检测方法进行研究，通过trnL序列设计特异引
物，建立了对蚕豆稳定、高效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判
定是否有蚕豆核酸存在。
发明内容
本发明目的在于提供用于蚕豆PCR检测的引物及方法。 本发明通过分析蚕豆与其近缘种等禾本科植物叶绿体trnL基因序列的基础上，
设计特异引物，能够快速、准确地对蚕豆进行定性检测。 本发明提供的检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和2所示。 以样品总DNA为模板，上述的引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判定样品是否
为蚕豆。即检测PCR产物中是否存在198bp的特异性扩增。具体地说，可以利用琼脂糖凝
胶电泳进行检测，根据是否存在198bp的特异性条带，来判断样品是否为阳性。PCR25iiL反应体系样品DNA 1 ii L (1 0 _5 0 n g) ， 1 0 X P CR
buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mM MgCL2 2 ii L， 10mM d證s 2 ii L， 10 ii MPrimers 2 ii L， 5U/ ii L
Taq DNA polymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4ii L。 反应条件预变性94。C 3min，再经94。C变性30sec，66。C退火30sec，72。C延伸30sec，30循环，最后72。C延伸5min。 可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。 本发明建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、出境的禾本科类材 料上检测蚕豆，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗 费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。
图1是PCR对蚕豆特异性检测实验； 图中，M为DNA marker DL2， 000 ;1小扁豆；2蚕豆；3菜豆；4豌豆；5自贡冬豆；6
吉林小粒；7晋豆21 ;8冀豆12 ;9野生大豆236 ;10肯农18 ;11日本晴；12玉米；13中国
春；CK水对照。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物的设计根据蚕豆trnL序列，利用软件和Primer 3设计引物，经过多轮筛选，意外发现以 下引物的特异性显著优于其它引物，该引物序列为
正向5' -TTAAATGGGCAATCCTGAGC-3'
反向5' -CAATTGTGATCGAATCAAAACTAAA-3，。
实施例2总DNA的提取 (1)取0. 2 0. 3g植物组织，用硅胶保存，剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状，移 至已灭菌的1. 5mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。 (2)在离心管中加入已在65。C预热500ii L CTAB提取液(3% (w/v)CTAB， 100mM Tris-HCl(pH 8. 0) ， 2M NaCl，25mM EDTA(pH 8. 0) ， 4% b-merc即toethanol (v/v) ， and 5% PVP (w/v))混匀，置于65t:水浴锅保温30分钟。 (3)将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，上下
颠倒离心管充分混匀，12000转/分钟离心15分钟。 (4)吸取上清液置于另一已灭菌的1. 5mL离心管。 (5)再加入等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，重复步骤(3)， (4)。 (6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在_201:预冷)，轻轻颠倒离心管混匀，
置于_201:冰箱，放置30分钟。 (7) 10000转/分钟离心10分钟，倒去上清液，保留沉淀.此时的沉淀物主要为 DNA。 (8)加入400iiL70X乙醇，10000转/分钟离心5分钟，收集沉淀。置于37。C或 5(TC烘箱烘干。(9)加入100 ii L TE (或者灭菌水)溶解DNA，再加2 y LRNA酶(10mg/ml)， 37。C保温30分钟。 (10) 1. 0%琼脂糖电泳检测DNA浓度及质量。
实施例3PCR扩增方法的建立
1、PCR反应体系
以总DNA为模板，进行PCR反应，25 ii L反应体系中有样品样品DNA 1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2 ii L， 10mM dNTPs 2 ii L， 10 ii M Primers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNApolymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。
2、PCR反应条件 将样品管放入ABI PCR仪后，设置如下条件进行反应预变性94t: 3min，再经 94。C变性30sec，66。C退火30sec，72。C延伸30sec， 30循环，最后72。C延伸5min。反应结束后扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果。
实施例4蚕豆PCR方法的特异性确定 以蚕豆与其近缘种等13个豆科植物总DNA为模板，以水为阴性对照，通过PCR反 应结束后琼脂糖凝胶电泳198bp的特异性扩增条带判定阳性结果。
试验结果 只有蚕豆的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它近缘材料和阴性对照均没有扩增
信号，结果见图1。
序列表〈110〉中国检验检疫科学研究院〈120〉蚕豆的PCR鉴定引物及鉴定方法〈130>KHP09113377. 1〈160>2〈170>PatentIn version 3. 5〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1TTAAATGGGC AATCCTGAGC〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2CAATTGTGAT CGAATCAAAA CTAAA
权利要求
一种蚕豆鉴定用引物，其核苷酸序列为正向5’-TTAAATGGGCAATCCTGAGC-3’反向5’-CAATTGTGATCGAATCAAAACTAAA-3’。
2. —种检测蚕豆的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求l所述的引物进行 PCR扩增，根据PCR扩增产物判定样品是否为蚕豆。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产生 198bp的特异性扩增条带则判定阳性结果。
4. 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR的反应程序为预变性94°C 3min， 再经94。C变性30sec，54。C退火30sec，72。C延伸30sec，30循环，最后72。C延伸5min。
5. 含有权利要求1所述引物的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种蚕豆PCR鉴定用引物及方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本发明还进一步提供了蚕豆鉴定的PCR检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为蚕豆物种资源的鉴定提供了检测方法。
文档编号C12N15/11GK101701255SQ20091023801
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者徐涛, 许瑾 申请人:中国检验检疫科学研究院