专利名称：玉米的pcr鉴定引物及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及对玉米生物资源进行检测用引物及PCR 方法。
背景技术：
玉米Zea mays属禾本科玉米属。全世界玉米播种面积仅次于小麦、水稻而居第三 位。我国的玉米产量居世界第二位。在我国玉米的播种面积很大，分布也很广，是我国北方 和西南山区及其它旱谷地区人民的主要粮食之一。玉米具有很高营养价值和保健作用，其 除了含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、胡萝卜素外，还含有核黄素、维生素等营养物质。这些 物质对预防心脏病、癌症等疾病有很大的好处。玉米中所含的胡萝卜素，被人体吸收后能转 化为维生素A，它具有防癌作用；植物纤维素能加速致癌物质和其他毒物的排出；天然维生 素E则有促进细胞分裂、延缓衰老、降低血清胆固醇、防止皮肤病变的功能，还能减轻动脉 硬化和脑功能衰退。此外，多吃玉米还能抑制抗癌药物对人体的副作用，剌激大脑细胞，增 强人的脑力和记忆力此外。我国是一个玉米属植物种质资源十分丰富的国家，有许多优良 品种，这些品种已成为我国许多地区生产上大量栽培的品种，大大地促进了我国玉米相关 产业的发展。随着改革开放以来畜牧业的大发展，人民生活水平的提高，玉米工业的发展， 玉米已成为粮食、饲料、工业原料和出口商品的多用途作物。为防止我国玉米种质资源的流 失，对我国的社会生产力造成难以估量的损失，应该加大对我国玉米资源的保护与研究工 作。 现代生物技术的出现，使基因资源更多的是以非活体的遗传物质形式携带出境， 使得口岸查验更加困难，因而研究及建立有效的遗传资源出境检验鉴定方法以及相关的能 力建设就显得极为必要。 目前国内外对于Zea mays的识别仅限于形态上，利用分子标记技术进行品种鉴定 的研究很多，但是在种的水平上未见分子检测方法的研究。 本发明应用PCR方法对玉米的分子检测方法进行研究，通过trnL序列设计特异引 物，建立了对玉米稳定、高效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判 定是否有玉米核酸存在。
发明内容
本发明目的在于提供用于玉米PCR检测的引物及方法。 本发明通过分析玉米与其近缘种等禾本科植物叶绿体trnL基因序列的基础上，
设计特异引物，能够快速、准确地对Zea mays进行定性检测。 本发明提供的检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和2所示。 以样品总DNA为模板，上述的引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判定样品是否
为玉米。即检测PCR产物中是否存在230bp的特异性扩增。具体地说，可以利用琼脂糖凝
胶电泳进行检测，根据是否存在230bp的特异性条带，来判断样品是否为阳性。
PCR25iiL反应体系样 品DNA 1 ii L (1 0 _5 0 n g) ， 1 0 X P CRbuffer(Mg2+free)2. 5ii L，25mM MgCL2 2 ii L， 10mM d證s 2 ii L， 10 ii MPrimers 1 ii L/l ii L，5U/ ii L Taq DNA polymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。 反应条件预变性95。C 5min，再经95。C变性30sec，45。C退火30sec，72。C延伸lmin，30循环，最后72。C延伸5min。 可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。 本发明建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、出境的禾本科类材料上检测玉米，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。
图1是PCR法对玉米的特异性检测结果； 其中，M为DL2， OOODNA分子量标准；1玉米，2小伞，3粗山羊草，4黑麦，5栽培一粒，6肯农18， 7日本晴，8中国春，CK水对照。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物的设计根据玉米trnL序列，利用软件和Primer 3设计引物及，经过多轮筛选，意外发现以下引物的特异性显著优于其它引物，该引物序列为
正向5' -GATCTCGAAAACAATGAA-3'
反向5' -AAAGGAAAAGGATAGGTG-3'。
实施例2总DNA的提取 (1)取0. 2 0. 3g植物组织，用硅胶保存，剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状，移至已灭菌的1. 5mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。 (2)在离心管中加入已在65t:预热500 y LCTAB提取液(20g/LCTAB， 1. 4M NaCl，
0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA， pH 8.0)混匀，置于65。C水浴锅保温30分钟。 (3)将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，上下
颠倒离心管充分混匀，12000转/分钟离心15分钟。 (4)吸取上清液置于另一已灭菌的1. 5mL离心管。 (5)再加入等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，重复步骤(3)， (4)。 (6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在_201:预冷)，轻轻颠倒离心管混匀，
置于_201:冰箱，放置30分钟。 (7) 10000转/分钟离心10分钟，倒去上清液，保留沉淀.此时的沉淀物主要为DNA。 (8)加入400iiL70X乙醇，10000转/分钟离心5分钟，收集沉淀。置于37。C或50。C烘箱烘干。(9)加入100 ii L TE (或者灭菌水)溶解DNA，再加2 y LRNA酶(10mg/ml)，37。C保温30分钟。 (10) 1. 0%琼脂糖电泳检测DNA浓度及质量。
实施例3PCR扩增方法的建立
1、PCR反应体系 以总DNA为模板，进行PCR反应，25 ii L反应体系中有样品样品DNA1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2iiL，10mM dNTPs 2 ii L，10 ii M Primers 1 u L/1 u L， 5U/ u L TaqDNA polymerase 0. 1 u L， ddH20 15. 4 u L。
2、PCR反应条件 将样品管放入ABI 7900PCR仪后，设置如下条件进行反应预变性95t: 5min，再经95。C变性30sec，45。C退火30sec，72。C延伸lmin， 30循环，最后72。C延伸5min。反应结
束后扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳判定结果。
实施例4玉米PCR方法的特异性确定 以玉米与其近缘种等8个植物总DNA为模板，以水为阴性对照，通过PCR反应结束后琼脂糖凝胶电泳230bp的特异性扩增条带判定阳性结果。
试验结果 只有玉米的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它近缘材料和阴性对照均没有扩增
信号，结果见图1。
序列表〈110〉中国检验检疫科学研究院〈120〉玉米的PCR鉴定引物及鉴定方法〈130〉KHP09113381.6〈160>2〈170>PatentIn version 3. 5〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1GATCTCGAAA ACAATGAA〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2AAAGGAAAAG GATAGGTG
权利要求
一种玉米鉴定用引物，其核苷酸序列为正向5’-GATCTCGAAAACAATGAA-3’反向5’-AAAGGAAAAGGATAGGTG-3’。
2. —种检测玉米的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求l所述的引物进行 PCR扩增，根据PCR扩增产物判定样品是否为玉米。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，产生 230bp的特异性扩增条带则判定阳性结果。反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。
4. 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，PCR的反应程序为预变性95°C 5min， 再经95。C变性30sec，45。C退火30sec，72。C延伸lmin，30循环，最后72。C延伸5min。
5. 含有权利要求1所述引物的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种玉米PCR鉴定用引物及方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本发明还进一步提供了玉米鉴定的PCR检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为玉米物种资源的鉴定提供了检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101701256SQ200910238018
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者徐涛, 许瑾 申请人:中国检验检疫科学研究院