专利名称：菜豆的pcr鉴定用引物及pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对菜豆生物资源进行PCR鉴定用引 物及使用该引物的PCR鉴定方法。
背景技术：
菜豆Phaseolus vulgaris,别名四季豆、芸豆、玉豆等，属于高蛋白、低脂肪、中等 淀粉含量的作物，是十分重要的植物蛋白来源，具有较高的食用价值，此外它还是营养价值 很高的饲料。菜豆的药用价值也很高，其籽粒可入药，性味甘平，有滋补、解热、利尿的作用， 对治疗水肿、脚气病有特种疗效。菜豆嫩荚和籽粒中还含有植物血细胞凝集素，是一种糖蛋 白，有凝集人体细胞、剌激淋巴细胞胚形转化、抑制白细胞、淋巴细胞转移等作用，并且在配 合肿瘤治疗中，可提高化学疗法和放射疗法的疗效。随着我国加入WTO，农产品国际竞争压 力更大，种植业结构必须进行调整，菜豆在种植业结构调整中可以起到重要作用，此外菜豆 还是我国传统的出口产品。为防止我国菜豆种质资源的流失，对我国的社会生产力造成难 以估量的损失，应该加大对我国菜豆资源的保护与研究工作。 以前，豆类品种的辨别和鉴定都是根据栽培过程中的品种特征的区别来进行的。 即，通过对豆类进行长期的栽培，追踪观察其成长过程中的特征，从而进行鉴定。这种品种 鉴定方法至少需要一年。尤其，对于近似品种的豆类，因其在形状和颜色等特征上无明显差 异，不易通过目视鉴别。另外，随着现代生物技术的出现，使基因资源更多的是以非活体的 遗传物质形式携带出境，使得口岸查验更加困难，因而研究及建立有效的遗传资源出境检 验鉴定方法以及相关的能力建设就显得极为必要。 另一方面，利用PCR(聚合酶链反应)的基因扩增法已被广泛利用于各个领域。PCR 法是以极微量的DNA为模板，短时间内将目的DNA区域扩增至数十万倍的方法，因其精度高 而广泛被利用于医学和微生物领域。在农产品领域中，已有利用RAPD(随机扩增多态DNA) 法对稻类品种进行鉴别的方法。而作为我国重要植物种质资源的菜豆，目前国内外对其检 测识别仅限于形态上，未见有关其分子鉴定方法的研究。 上述用于鉴别稻类品种的RAPD法是以基因组DNA为模板，以单个人工合成的较短 的随机多态核苷酸序列(通常为IO个碱基对)为引物，在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作 用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外 透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。由于该方法是从随机的 引物中选择RAPD标记，因此，即使没有所要鉴定品种的基因组信息也能进行鉴定。但是，该 方法有如下缺点由于使用了各自为IO个碱基对程度的较短的引物，所以退火温度较低， 容易因退火误操作而引起非特异扩增。并且，使用RAPD标记的PCR中包括鉴定所需的特异 扩增片段和多余的扩增片段，产生多个PCR产物，因此重复性较差，鉴定需要熟练的技术。
综上所述，为了保护菜豆种质资源，需要建立一种能够对难以从形态上进行判断 的菜豆进行辨别，且适合口岸检查应用的，简单且精确的生物鉴定方法，以此防止菜豆不会 以非活体遗传物质形式等非传统形态被携带出境。
发明内容
本发明所要解决的课题为，提供一种菜豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，对难 以从形态上进行判断的菜豆进行简单且精确的鉴定。 本发明所要解决的课题为，提供一种菜豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，能够 从原料含有菜豆的加工品以及种质资源中检测/鉴定菜豆。 本发明为了解决上述课题，应用PCR方法对菜豆的分子检测方法进行研究，通过 trnL序列设计特异引物，从而建立了对菜豆稳定、高效的鉴定方法、成本低，可根据对扩增 产物的普通琼脂糖电泳判定是否有菜豆核酸存在。 DNA测序技术是目前物种鉴别研究中运用最广的技术之一。而植物谱系地理学研 究中主要集中研究叶绿体DNA(chloroplast DNA， cpDNA)片段该基因组具有分子量小、单 亲遗传、多拷贝、结构简单及碱基序列重组少等特点，有利于进行遗传分析。此外，植物叶绿 体基因的某些区域，特别是一些非编码区域存在相对较高的核苷酸置换率，不仅适合于确 定物种之间的亲缘关系，同样也适合于物种鉴别研究。 植物叶绿体基因组、编码tRNA的trnL基因的内含子非编码区序列受外界选择压 力小、进化速率快、能提供较多的具有系统学意义的信息位点，多用于较低分类阶元及近期 分化类群间系统发育和种间、品种的鉴别研究。为此，本发明人对菜豆及其近缘种属植物的 trnL序列(菜豆的trnL序列参照SEQ ID No. 5)进行了测定和比较，以期为菜豆的鉴别提 供有效的分子标记系统。 本发明提供菜豆PCR鉴定用引物组合，其特征在于，能对菜豆的DNA进行扩增，生 成菜豆特异扩增片段。 本发明提供菜豆PCR鉴定用引物组合I，其核苷酸序列为
正向5' -GAATCCTTTCACCAAAATTCCA-3，
反向5' -TTTCAACTTCGAGTTGGTTTGA-3'。 本发明还提供一种菜豆PCR鉴定用引物组合II，其核苷酸序列为
正向5' -TAACAAACGAAATTGACG-3'
反向5' -TCCGATTATGATAAAGTGAA-3'。 本发明通过分析菜豆与其近缘种等豆科植物叶绿体trnL基因序列的基础上，设
计特异引物，能够快速、准确地对菜豆进行定性检测。本发明的引物可以通过利用本领域技 术人员公知的化学合成方法来进行的DNA合成技术来获得。本发明人在对相关植物的trnL 序列进行测定和比较的基础上，根据菜豆trnL序列上的特异碱基位点设计了引物，因此仅 对菜豆有扩增信号，而其他对照材料没有目的扩增信号。 另外、本发明提供一种菜豆PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述 引物组合I进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳164bp的特异性扩增条带判定 阳性结果。 本发明还提供一种菜豆PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物 组合II进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳255bp的特异性扩增条带判定阳性 结果。 PCR25iiL反应体系样品DNA 1 ii L (1 0 _5 0 n g) ， 1 0 X P CRbuffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mM MgCL2 2 ii L， 10mM dNTPs 2 ii L， 10 ii MPrimers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNA polymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4ii L。 引物组合I的反应条件预变性94。C、3min，再经94。C变性30sec，66。C退火 30sec，72t:延伸lmin，35循环，最后72"C延伸5min。 引物组合11的反应条件预变性94 °C 、 3min，再经94 。C变性30sec， 48 。C退火 30sec，72。C延伸lmin，35循环，最后72。C延伸5min。 本发明还提供一种菜豆PCR鉴定试剂盒，包括，上述引物组合I或/和II。
可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明的试剂盒可 以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多 个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外， 本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需 要的其它成分及用具。 使用本发明的引物以及方法进行鉴定的样品来源包括，菜豆的种子、小叶、菜豆加 工品以及菜豆种质资源，但并不局限于此。 通过使用本发明的引物，对所测菜豆的DNA进行扩增，生成菜豆特异扩增片段，从 而能够简单且精确地对菜豆进行鉴定。并且，本发明的引物仅对目的片段特异扩增，不会扩 增其它区域，因此也能使用于一次PCR中导入两种以上引物的多重PCR中，从而能有效地縮 短试验时间。并且，本研究建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、出境的豆 科类材料上检测菜豆，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产 生的耗费时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。
图1为利用本发明引物组合I的菜豆特异性检测实验结果； 图2为利用本发明引物组合II的菜豆特异性检测实验结果； 图中，1 :小扁豆、2 :蚕豆、3 :菜豆、4 :豌豆、 5 :自贡冬豆、6 :吉林小粒、7 :晋豆21、8 :冀豆12、 9 :野生大豆236、 10 :肯农18、 11 :日本晴、12 :玉米、 13 :中国春、CK :水对照。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1引物的设计 根据菜trnL序列，利用软件和Primer 3设计引物组合I，引物序列为 正向5' -GAATCCTTTCACCAAAATTCCA-3， 反向5， -TTTCAACTTCGAGTTGGTTTGA-3'。 根据菜豆trnL序列，利用软件和premier 5设计引物组合II，引物序列为 正向5' -TAACAAACGAAATTGACG-3' 反向5' -TCCGATTATGATAAAGTGAA-3，。 实施例2总DNA的提取
(1)取0. 2 0. 3g植物组织，用硅胶保存，剪碎后置研钵中加液氮研成粉末状，移 至已灭菌的1. 5mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。 (2)在离心管中加入已在65t:预热500 y LCTAB提取液(20g/LCTAB， 1. 4M NaCl，
0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA， pH 8.0)混匀，置于65。C水浴锅保温30分钟。 (3)将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，上下
颠倒离心管充分混匀，12000转/分钟离心15分钟。 (4)吸取上清液置于另一已灭菌的1. 5mL离心管。 (5)再加入等体积的氯仿/异戊醇(24 : l)，重复步骤(3)， (4)。 (6)加入等体积或两倍体积的无水乙醇(已在_201:预冷)，轻轻颠倒离心管混匀，
置于_201:冰箱，放置30分钟。 (7) 10000转/分钟离心10分钟，倒去上清液，保留沉淀.此时的沉淀物主要为 DNA。 (8)加入400iiL70X乙醇，10000转/分钟离心5分钟，收集沉淀。置于37。C或 50。C烘箱烘干。(9)加入100iiL TE(或者灭菌水)溶解DNA，再加2iiL RNA酶A(10mg/ml)， 37。C保温30分钟。 (10) 1. 0%琼脂糖电泳检测DNA浓度及质量。
实施例3PCR扩增方法的建立
1、PCR反应体系 以总DNA为模板，进行PCR反应，25 ii L反应体系中有样品样品DNA 1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2 ii L， 10mM dNTPs 2 ii L， 10 ii M Primers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNApolymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。
2、PCR反应条件 将样品管放入ABI PCR仪后，根据引物组合I设置如下条件进行反应预变性 94。C、3min，再经94。C变性30sec，66。C退火30sec，72。C延伸lmin，35循环，最后72。C延伸 5min ;根据引物组合II设置如下条件进行反应预变性94t:、3min，再经94。C变性30sec， 48t:退火30sec，72t:延伸lmin， 35循环，最后72。C延伸5min。反应结束后扩增产物经过琼 脂糖凝胶电泳判定结果。 实施例4菜豆PCR方法的特异性确定 以菜豆与其近缘种等13个豆科植物总DNA为模板，以水为阴性对照，通过PCR反 应结束后琼脂糖凝胶电泳164bp或255bp的特异性扩增条带判定阳性结果。
试验结果 只有菜豆的PCR扩增产物出现阳性扩增，而其它豆科材料和阴性对照均没有目的 扩增信号，结果见图l(引物组合I)和图2(引物组合I1)。
序列表 〈110〉中国检验检疫科学研究院 〈120〉菜豆的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法 〈160>5 〈170>PatentIn version 3.3 〈210>1
〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>1gaatcctttcacc肌肌ttcca
〈210>2〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>2tttcaacttcgagttggtttga
〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>3t朋c朋3cg朋3ttgacg
<210>4〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列
〈400>4tccg3ttetg3teaagtg朋
<210>5〈211>500〈212>DNA〈213〉菜豆(Phaseolus vulgaris)〈400>5朋accctgga attc3c朋tg朋ttcaga幼gtgataat朋gctgttctaac;aaacg3朋t tgacgactttccaaaattcc;agg朋tggat c朋3朋te朋ctttcaatttattectettt atteatgaag3朋gatgtg33tca朋cc朋ctcg朋gttgtattcacttt3tcateatcg gatea朋cccagategeigtcctattctaca tgtcaataccatccgtcgactteat朋3tc
22
22
18
20
ggcaatcctg agccaaatcc cgttttctga 60
3^3ggg3te ggtgctigag3 ctctetgg朋 120
ttttcttgca ttegt朋aag aatcctttca 180
catttegaga catetatata ctgaaatect 240
atcgatttgt gate皿朋te ttc3ca皿tg 300
皿皿皿3g3t gg皿tetttc ttgatga皿t 360
ttg皿g皿ct g3tc皿tc3g 3tgag皿te3 420
gac^c皿tg朋eittgaa3g teagagg朋ei 480
500
权利要求
菜豆PCR鉴定用引物组合，其特征在于，其能对菜豆的叶绿体trnL基因进行扩增，生成菜豆特异性扩增片段。
2. 如权利要求1所述的菜豆PCR鉴定用引物组合，其核苷酸序列为 正向5' -GAATCCTTTCACCAAAATTCCA-3'反向5， -TTTCAACTTCGAGTTGGTTTGA-3，。
3. —种菜豆PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组 合进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR的反应程序为预变性94t:、3min，再经 94。C变性30sec，66。C退火30sec，72。C延伸lmin，35循环，最后72。C延伸5min。
5. 如权利要求3至4所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自菜豆的种子、小叶、菜豆 加工品以及菜豆种质资源。
6. 如权利要求1所述的菜豆PCR鉴定用引物组合，其核苷酸序列为 正向5' -TAACAAACGAAATTGACG-3'反向5' -TCCGATTATGATAAAGTGAA-3，。
7. —种菜豆PCR鉴定方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求6所述的引物组 合进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR的反应程序为预变性94t:、3min，再经 94。C变性30sec，48。C退火30sec，72。C延伸lmin，35循环，最后72。C延伸5min。
9. 如权利要求7至8所述的方法，其特征在于，样品总DNA来自菜豆的种子、小叶、菜豆 加工品以及菜豆种质资源。
10. —种菜豆PCR鉴定用试剂盒，其包括，权利要求1或2或6所述引物组合。
全文摘要
本发明提供了菜豆PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，所述引物能对菜豆的叶绿体trnL基因进行扩增，生成菜豆特异性扩增片段，具体核苷酸序列可如序列表SEQ ID No.1&2和No.3&4所示。本发明的菜豆PCR鉴定方法，是以样品总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖电泳判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为菜豆物种资源的鉴定提供了检测方法。
文档编号C12N15/11GK101701258SQ20091023802
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者徐涛, 许瑾 申请人:中国检验检疫科学研究院