专利名称：来源于甘蓝油菜的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于甘蓝油菜的启动子及其应用。
背景技术：
植物中的脂肪酸又被称为植物油，它广泛存在于植物的种子中。植物油用途广泛， 运用生物技术改良植物体内脂肪酸的组分和含量具有重要的经济价值。其中，遗传工程技 术所选用的操作基因必需是植物体内脂肪酸生物合成过程中的关键基因，但是目前人们对 于植物脂肪酸生物合成的分子调控机制还不甚了解，因此，利用遗传工程技术提高油料作 物含油量的工作目前进展缓慢。以双子叶模式植物拟南芥为例，植物的胚胎发生主要分为 两个阶段早期形态发生过程和晚期成熟过程。整个胚胎发育过程中伴随着淀粉、蛋白质 和脂肪酸等贮藏物质的积累。在胚胎发育早期，主要是淀粉的大量积累，在组织和器官形 成以后，淀粉被转化为蛋白质和脂肪酸。在发育的种子中，碳水化合物通过糖酵解途径被分 解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被运输到质体后再转化成丙酮 酸和乙酰CoA，乙酰CoA作为底物参与脂肪酸的合成(Ruuska, S. A.，Girke, T.，Benning,
C., and Ohlrogge, J. B. (2002). Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsis seed filling. Plant Cell 14,1191-1206.)。在种子发育过程中，质体内的脂肪酸合成酶复合物中的酶类负责脂肪酸的合成， 所合成的脂肪酸被导入胞质酰基CoA库中以维持三酯酰甘油(TAG)积累。植物种子中的TAG 的生物合成是在内质网中进行的。TAG的前体是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的过 程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶 血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Ohlrogge 等，1979，Proc Natl Acad Sci，USA，76 1194-1198)。这三种酰基转移酶催化甘 油骨架的逐步酰基化过程。近十余年来，科学家们对利用遗传工程技术提高植物体内，特别 是种子中的脂肪酸含量进行了各种有益的探索。Shintani等在烟草中过量表达了 ACCase 的一个亚基_生物素羧化酶(BC亚基)，在烟草叶片中BC的表达水平提高了 3倍，其它三 个亚基的表达水平没有发生明显变化，但脂肪酸的含量和组成也没有明显改变(Shintani，
D.,Roesler,K. ,Shorrosh,B.，Savage，L，and Ohlrogge,J. (1997).Antisenseexpression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves. Plant Physiol 114， 881-886.)。另一项研究表明，增加丙酰CoA的含量能够提高脂肪酸的含量。Roeseler等 利用种子特异性表达启动子在油菜中过量表达拟南芥中的HO-ACCase基因，结果使ACCase 的活性明显提高，种子中的含油量提高3-5% (Roesler，K.，Shintani, D.，Savage, L.， Boddupalli, S. , and Ohlrogge, J. (1997). Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds. Plant Physiol 113, 75-81. )。Roeseler等的研究结果表明，丙酰CoA水平能够提高脂肪酸的含量，但提高幅度 较小。Dechesh等将菠菜的KASIII基因在烟草中过量表达，结果使KASIII的酶活性提高 7 100-300 倍，但脂肪酸的含量却降低了 5-10% (Dehesh 等，2001，Plant Physiol.，125 1103-1114)。上述研究结果表明，植物体内的脂肪酸代谢是一个复杂和高度协调的过程，通 过对脂肪酸代谢途径中的个别或单个基因进行遗传操作并不能够有效地改变脂肪酸的含 量。因此，Girke等人预言在脂肪酸的代谢过程中，很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因 子(例如转录因子)在起调控作用(Girke，Τ.，Todd, J.，Ruuska，S.，White, J.，Benning, C. , and Ohlrogge, J. (2000). Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds. Plant Physiol 124，1570-1581.)。目前，已发现的参与植物脂肪酸代谢的转录因子有拟南芥的WRIl和LECl等。其 中，WRIl编码一个AP2/ERra转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个 关键的调节因子(Cernac，Α.，and Benning, C. (2004). WRINKLEDlencodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J 40，575-585. )。LECl属于能结合启动子中顺式作用元件CCAAT盒的 一类转录因子，调控胚胎的发生与种子成熟，同时可能对胚胎形成过程中胚胎储存物的积 Mii^fiIK (Lotan, T. ，Ohto, M. ，Yee, K. M. ，West, Μ. Α. ，Lo, R. ，Kwong, R. W. ，Yamagishi, K. , Fischer, R. L. , Goldberg, R. B. , and Harada, J. J. (1998). Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell 93，1195-1205.)。过量表达LECl能大幅度增加转基因拟南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.， Tan, H. , Zheng, Q. , Fu, F. , Liang, Y. , Zhang, J. , Yang, Χ. , Wang, Τ. , Chong, K. , Wang, Χ. J., et al. (2008). LEAFY COTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Physiol 148，1042—1054.)。在拟南芥基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，至少有1500个，占整 个基因组的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110_2113)。这些转录因子大多 属于大的基因家族，有的基因家族又包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有 的。对转录因子的研究结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节 控制，从而有效改变植物的相关特性。CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作 用元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA 上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚 族NF-YA(又称为 HAP2 或 CBF-B)，NF_YB(又称为 HAP3 或 CBF-A)和 NF_YC(又称为 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面， 形成异源三聚体复合物。该三聚体复合物对DNA有很高的亲和力(Gusmaroli，G.，Tonelli， C. , and Mantovani, R. (2002). Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits. Gene 283,41-48. ；Romier, C., Cocchiarella, F. ， Mantovani, R. ， and Moras, D. (2003). The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y. J Biol Chem 278,1336-1345)。编码NF-Y亚基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母与动物体中，各种亚 基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中，NF-Y亚基是由多种不同基因编码的。在 拟南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年报道了三个NF-Y亚族中的共29个ESTs 的序列(Gusmaroli, G. , Tonelli, C. , and Mantovani, R. (2001). Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana. Gene 264,173-185),本发 明的发明人于2004年完成了该家族32个基因cDNA的克隆，其中9个HAP2，11个HAP3， 12 个 HAP5 (Wei 等，2004，Plant Physiol.，135 :773_782)。NF-YB 亚族的转录因子在基 因内部都含有一个保守的B结构域，依据B结构域序列的差异，该家族被分为两类=LEAFY COTYLEDON 1 (LECl)类型和非 LECl 类型(Kwong, R. W.，Bui，A. Q.，Lee，H.，Kwong, L. W.， Fischer,R. L. ,Goldberg,R. B. ,and Harada,J. J. (2003). LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regu lators essential for embryo development. Plant Cell 15，5—18)。 LECl类型包括两个基因LECl和LEAFY COTYLEDONl-Iike (LlL)。这两个基因都是特异性 地在胚胎和种子发育过程中表达。LECl类型的转录因子的B结构域含有16个保守的氨 基酸残基，这16个氨基酸残基在非LECl类型的转录因子中是不存在的。B结构域是决定 LECl类转录因子在功能上区别于其它非LECl类转录因子的关键因素(Hyes eimg等，2003， Proc Natl Acad Sci，USA, 100 :2152_2156)。LECl 是 HAP3 家族中功能研究的较为清楚的 一个蛋白。LECl是拟南芥胚胎发生过程中一个关键的调控因子。LECl参与了种子成熟的 多个过程，包括种子的干燥和养分的积累。目前，在玉米、向日葵和胡萝卜中，均发现了 LECl 白勺胃(Zhang, S. ， Wo ng, L. ， Meng, L. ， and Lemaux, P. G. (2002). Similarity of expression patterns of k nottedl and ZmLECl during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zea mays L·)· Planta 215,191-194. ；Yazawa, K. , Takahata, K. , and Kamada, H. (2004). Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledonl and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis. Plant Physiol Biochem 42，215-223.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种启动子。本发明提供的启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序 列。本发明的目的在于提供另一种启动子。所述另一种启动子的核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1的自5’端第872-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序 列。本发明的目的在于提供又一种启动子。所述又一种启动子的核苷酸序列是如下1)或2)或3):
1)序列表中序列1的自5’端第891-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序 列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序 列。所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓 冲液，pH7.2,7% SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。本发明的启动子活性片段还包括与来自SEQ ID NO. 1的片段的核苷酸序列互补的 核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得 到的启动子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活 性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发 明的启动子核苷酸序列具有优选地75%或更高，更优选地85%或更高，甚至更优选地90% 或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％ )表示，其可 以用来评价相关序列之间的同源性。含有任一上述的启动子的重组载体也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体具体是任一上述的启动子与下述1)或2)或3)的基因一起插入载 体pCAMBIA-2300的多克隆位点制成的重组表达载体1)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3 ；3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。含有任一上述的启动子的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。含有任一上述的启动子的重组菌也属于本发明的保护范围之内。任一上述的启动子在驱动目的基因在胚胎或种子组织中特异表达中的应用也属 于本发明的保护范围之内。上述目的基因是下述1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2 ；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3 ；3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、 组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃 薯或烟草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪 草等单子叶植物。
实验证明本发明的发明人构建了 3个在种子特异并适度表达的启动子，用于驱 动转基因油菜中AtLlL基因、BnLECl基因和BnLlL基因表达。转基因实验表明能显著提高 油料作物油菜种子中的油含量，为转基因方法提高油料作物的脂肪酸含量提供一条行之有 效的途径。这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的 理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
图1为AtLlL蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，61-126为保守的 NF-YB结构域。图2为油菜napin A启动子缺失片段与⑶S基因融合表达载体简图，+1表示预测 的转录起始点，箭头指示转录方向；数字表示napin A启动子以及相应突变体(D系列突变 体)的长度与突变的相对位置，GUS编码区未按长度比列绘制。图3为napin A启动子缺失片段驱动⑶S表达酶活分析DO、D4、D6和D7为油菜 napin A启动子的缺失驱动GUS的转基因拟南芥果荚中GUS酶活，每个缺失片段启动子测 定5个独立家系，以典型家系表示该缺失片段启动子驱动能力。数据为三次独立测定的平 均值。图4为D4和D6启动子驱动AtLlL表达载体，+1表示预测的转录起始点，箭头指示 转录方向；D4、D6表示不同长度的napin A启动子突变体，启动子按照长度比例绘制，AtLlL 基因未按长度比列绘制。图5为D4: :AtLlL转基因油菜种子中油含量，中油821为非转基因油菜野生型对 照；D4: :AtLlL#l、D4: :AtLlL#2、D4: :AtLlL#3、D4: :AtLlL#4 为以中油 821 为背景的转基因
油菜株系。图6为D6: :AtLlL转基因油菜种子中油含量，Westar油菜为非转基因野生型油菜 对照；D6: :AtLlL#l、D6: :AtLlL#2、D6: :AtLlL#3、D6: AtLlL#4 为以 Westar 为背景的转基因 油菜株系。图7为BnLECl蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，59-126为保守的 NF-YB结构域。图8为为D7启动子驱动BnLECl表达载体，+1表示预测的转录起始点，箭头指示 转录方向；D7表示napin A启动子突变体的长度，启动子按照长度比例绘制，BnLECl基因未 按长度比列绘制。图9为为D7: IBnLECl转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜 对照；D7: :BnLECl#2、D7: :BnLECl#3、D7: :BnLECl#4、D7: :BnLECl#5 为以 Westar 为背景的转 基因油菜株系。图10为为BnLlL蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，56 121为保守 的NF-YB结构域。图11为D7和D6启动子驱动BnLlL表达载体简图，+1表示预测的转录起始点，箭 头指示转录方向；D0、D6和D7表示napin A启动子以及相应突变体的长度，启动子按照长 度比例绘制，BnLlL基因未按长度比列绘制。图12为DO: :BnLlL转基因油菜种子中油含量，中油821为非转基因油菜野生型对照；DOBnLlL#1、DOBnLlL#2、DOBnLlL#3、DOBnLlL#4为以中油82l为背景的转基因油菜株系。
图13为D6BnLlL转基因油菜种子中油含量，中油82l为非转基因油菜野生型对照；D6BnLlL#3、D6BnLlL#4、D6BnLlL#5、D6BnLlL#6为以中油82l为背景的转基因油菜株系。
图14为D6BnLlL转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜对照；D6BnLlL#6、D6BnLlL#7、D6BnLlL#8、D6gnLlL#9为以Westar为背景的转基因油菜株系。
图15为D7BnLlL转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜对照；D7BnLlL#5、D7BnLlL#6、D7BnLlL#7、D7BnLlL#8为以Westar为背景的转基因油菜株系。
图16为DOBnLlL转基因拟南芥幼苗表型，Col一0野生型对照种子和以Col一0为背景的转基因种子在MS培养基上萌发，培养条件为22~C，光照强度80—120 u旷旷，16小时光照的温室中培养生长12天，左边为Col一0非转基因野生型对照苗；右边为DOBnLlL转基因苗；转基因幼苗子叶缺乏或畸形变小，红色箭头指示为子叶。
图17为DOBnLlL转基因拟南芥种子中油含量，Col一0为非转基因野生型拟南芥对照；DOgnLlL#9、DOBnLlL#10、DOBnLlL#1 l为以Col一0为背景的转基因拟南芥株系；*表示与对照比较有显著差异，P<0．0l；拟南芥种子中油含量测定采用GC／MS方法，数据为三次独立测定的平均值。
图18为D7BnLlL转基因拟南芥种子中油含量，Col一0为非转基因野生型拟南芥对照；D7BnLlL#4、D7BnLlL#6、D7BnLlL#12、D7BnLlL#13为以Col一0为背景的转基因拟南芥株系；*表示与对照比较有显著差异，P<0．01；拟南芥种子中油含量测定采用GC／MS方法，数据为三次独立测定的平均值。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。中油821、Westar油菜均由西南大学李加纳老师在2007年7月赠送，其原始来源不清楚。拟南芥(Col一0)种子由2001年5月ABRC(http／／www．arabidopsis．org)赠送，其原始来源不清楚。
实施例l、种子含油量高的转基因油菜的获得
一、启动子的获得及其检测
l、启动子的获得
根据napin A启动子的核苷酸序列(GenBank号502798．1)，按照图2设计napinA启动子缺失片段引物(F为前端引物，R为反向引物)，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L)中的种子胚胎特异表达的启动子，引物序列如下(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基)
Do F5’ 一CGAAAGCTTTCTTCATCGGTGATTGATTC一3’
D7 F5’ 一CGAAAGCTTCCATGCCAGAACATTAGCTACACG一3’
D6 F5’ 一CGAAAGCTTAAGAATCGTTCATAAGATGCCATGC一3’
D4 F5’ 一CGAAAGCTTTTTTAATTTTATGAAGTTAAGTTT一3’
napinA R 5' -TTAGTCGACTCGTGTATGTTTTTAATCTTG-3‘。用CTAB法提取油菜中油821 (谢柱存.中油821的特性与栽培[J].广西农业科 学，1991，(05) 213)基因组 DNA，在 napin A 前端引物(DO F、D4 F、D6 F 和 D7 F)和后端 引物napinA R的分别引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回目的片段并对其进行纯化，得到DO、D4、 D6和D7扩增片段。将回收纯化的D0、D4、D6和D7片段连接入到载体pGEM-Teasy (Promega 公司)中。然后将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.Coli)DH5a感受态细胞，筛选阳 性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培 养12-16小时，提取质粒，得到含有回收片段的重组质粒，分别命名为pGEM-DO、pGEM_D4、 PGEM-D6和pGEM-D7。对上述重组质粒进行DNA测序分析，测序结果表明扩增得到的4个片 段与napin A启动子(GenBank号J02798. 1)序列相对应部分相同。各个启动子序列分别 如下DO的序列如序列表中序列1所示；D4的序列如序列表中序列1的自5’端第 832-1145位所示；D6的序列如序列表中序列1的自5’端第872-1145位所示；D7的序列如 序列表中序列1的自5，端第891-1145位所示。2、启动子的检测Dnapin A启动子缺失片段(D系列启动子)与GUS编码区的融合表达载体构建分别挑选pGEM-DO、pGEM_D4、pGEM_D6和pGEM_D7序列正确的阳性克隆，大量制 备质粒DNA，用购于NEB公司的Hindlll/Sal I双酶切得到相应启动子插入片段，用胶回 收试剂盒(购自鼎国公司)回收DO、D4、D6和D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶 (Roche公司)与经过同样酶切的pBI121(购自Clontech)载体连接，形成pBI121_D0:⑶S、 PBI121-D4: :GUS、pBI121_D6: :GUS 和 pBI121_D7: :GUS 的 GUS 表达载体。热激法转化大肠 杆菌(E. coli)DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基 中，37°C、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。载体的构建简图， 见图2。2)转基因拟南芥中启动子驱动GUS蛋白表达的检测A、转基因拟南芥的获得将步骤1)得到的 pBI121-D0: :GUS、pBI121-D4: :GUS、pBI121-D6: :GUS 和 PBI121-D7::⑶S四种表达载体分别用电激转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农 杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28°C， 150rpm振荡培养2天。所获菌液以2 %接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5，OOOrpm,20分钟离心收集 菌体，菌体重悬于250ml含有5%蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇勻。转化液转 入250ml烧杯中，将已去掉花和果荚的Col-O野生型拟南芥(Feng，H.，An, F.，Zhang, S.，Ji, Z.，Ling, H. Q.，and Zuo, J. (2006). Light-regulated, tissue-specific, and cell differentiation-specific expression of the Arabidopsis Fe (III)-chelate reductase gene AtFR06. Plant Physiol 140，1345-1354.)倒置于烧杯中，真空抽 20 秒为 宜。为提高转化效率，一周后可再重复转化一次。将转化后的拟南芥培养得到种子，将得到 的拟南芥种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥。
B、⑶S酶活性的检测取步骤A中的转基因拟南芥T3代的相同标记时间的同期拟南芥果荚lOOmg，用 液氮研磨成干粉，加500 μ 1提取液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7. O ；lOmmol/L巯基乙醇； lmmol/L EDTA，pH8. 0 ；0. 月桂酸肌氨酸钠；0. 1% Triton X-100)，13，OOOrpm 离心 10 分 钟，上清液用于⑶S活性及蛋白浓度测定。取5 μ 1酶提取液加入到45 μ 1检测液中(酶 提取液中加入2mmol/L 4-甲基伞型酮酰-β -葡萄糖醛酸苷W-Methyl umbelIiferyl β -D glucuronide, MUG])，立即混勻，快速取5 μ 1反应混合液，加入到195 μ 1反应终止液 (0. 2mol/L Na2CO3)中，混勻，即酶活性测定0点；反应混合液于37°C保温，一小时后取5 μ 1 反应混合液加入到195 μ 1反应终止液中终止反应；用Tecan GENios荧光分光光度计(激 发光波长为365nm，发射光为455nm)测定每个样品的荧光强度，计算反应生成的4-甲基伞 型酮 G-methylumbelliferone，MU)的量；按照 Bradford 方法，用 Tecan GENios 测定样品 中蛋白含量；计算样品中GUS活性，GUS活性=单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位 pmolMU. mg-1. mirT1)，结果如图3所示，结果表明随着启动子长度的缩短，GUS酶活性逐渐降 低，表明启动子的驱动GUS报告基因表达的能力降低。二、种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因AtLlL的克隆根据核苷酸序列(GenBank号AB0256^. 1)设计引物Pl和P2，用于扩增拟南芥 (Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Col-O)中的调控植物脂肪酸代谢的转录因子 基因，引物序列如下(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基) Pl (AtLlL 上游引物)5 ‘ -TTAGTCGACCACAAACACAAAAGTCGTGT-3 ‘P2 (AtLlL 下游引物)5 ‘ -CGAGGATCCGCAAAACTAATGCTTTATTGA-3 ‘用TRIZAL试剂(购自hvitrogen公司)并参照试剂盒说明书提取拟南芥哥伦比 亚生态型(Col-O)新鲜果荚的总RNA，然后用hvitrogen公司的superscript IIReverse Transcriptase试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，再以所合成的cDNA 为模板，在引物Pl和P2的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼 脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约0. 8Kb的目的片段并对 其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Teasy (Promega公司)中，再将连接产物用热 激法转化大肠杆菌(E.Coli)DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄 青霉素的5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收 片段的重组质粒，命名为PGEM-AtLlL,对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中 的SEQ ID NO 2的序列，序列2由937个碱基组成，包括38个碱基的5' UTR区，其编码序 列为自5'端第39-743位碱基，自5'端第219-416位碱基编码NF-TO结构域。自5'端第 744-937位碱基为该基因组基因的3'非编码区。将该基因命名为AtLlL，将其编码蛋白命 名为AtLlL，该基因蛋白的框架结构图见图1。2、用D4和D6启动子驱动AtLlL表达的转基因载体的构建挑选步骤二的步骤1中的序列正确的pGEM-AtLlL阳性克隆，大量制备质粒DNA，用 从NEB公司购得的Ml I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公 司)回收AtLlL基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的 pCAMBIA-2300(简称 pC2300) (CAMBIA 公司，http://www. cambia. org/daisy/cambia/585.html)连接，形成pC2300: AtLlL的中间载体。然后把步骤一中步骤2得到的pGEM-D4、pGEM_D6正确的阳性克隆，大量制备质 粒DNA JSHindinAal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司) 回收D4、D6启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的 pC2300: AtLlL 中间载体连接，形成 pC2300_D4: AtLlL 和 pC2300_D6: AtLlL 的最终载体。热激法转化大肠杆菌(E. coli)DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡 那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切 鉴定，表达载体的构建图，见图4。3、转基因油菜的获得1)转化农杆菌将步骤2得到的表达载体(pC2300-D4: AtLlL和pC2300_D6 AtLlL)分别用电激 转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含 卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2% 接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小 时。所获菌液经5，OOOrpm, 20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5%蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇勻，得到含有pC2300-D4: AtLlL的转化液和含有pC2300_D6 AtLlL 的转化液。2)转化油菜A、转 pC2300-D4: :AtLlL 的转基因油菜把上述含有pC2300-D4: :AtLlL的转化液转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的 中油821油菜花序浸泡在转化液中；浸泡时间为1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为 提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜 种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗)， 至此获得转pC2300-D4: :AtLlL的转基因油菜。B、转 pC2300-D6: AtLlL 的转基因油菜按照上述步骤A的方法，将含有pC2300-D4 AtLlL的转化液换成含有 PC2300-D6: AtLlL 的转化液，将油菜品种换成 Westar 油菜(Chandler，S. F.，and Thorpe, Τ. Α. (1987). Characterization of Growth,Water Relations,and Proline Accumulation inSodium Sulfate Tolerant Callus of Brassica napus L. cv Westar(Canola). Plant Physiol 84，106-111.)，其余操作完全相同，得到转pC2300_D6: :AtLlL的转基因油菜。4、转基因油菜的检测A、转pC2300-D4: :AtLlL的转基因油菜的检测以非转基因中油821为野生型对照1。将转基因油菜苗培养，得到Tl代种子，对Tl代种子(转pC2300-D4: :AtLlL的转 基因油菜和野生型对照1)进行含油量的测定与计算，其中含油量=种子油脂(质量)/种 子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECT0R22/N型傅立叶变换近红 外光谱仪测定，运用OPUS 5. 5软件进行分析得到的。光谱采集条件分辨率ScnT1，扫描次 数32次，谱区范围12000-4000(31^1,室温23_25°C。测定结果如图5所示，用D4启动子驱动 AtLlL过表达，转pC2300-D4::AtLlL的转基因油菜的种子含油量高于野生型对照1的种子含油量。B、转PC2300-D6: AtLlL的转基因油菜的检测以非转基因Westar油菜为野生型对照2。将转基因油菜苗继代培养，得到Tl代种子，对Tl代种子(转pC2300-D6: :AtLlL 的转基因油菜和野生型对照2)进行含油量的测定，测定方法同上述步骤A。测定结果如图 6所示，用D6启动子驱动AtLlL过表达，转pC2300-D6: AtLlL的转基因油菜的种子含油量 高于野生型对照2的种子含油量以上可知，D4和D6启动子驱动AtLlL过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。实施例2、种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因&1LEC1的克隆根据拟南芥LlL的核苷酸序列(GenBank号AB025628)设计引物P3和P4，用于 扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子 BnLECl基因基因组DNA序列，引物序列如下P3 (BnLECl 上游引物)5' -TTAGTCGACCGAGGACGGCAGAGAAACAAT-3 ‘P4(&iLECl 下游引物)5' -CGAGGATCCTTTACTAGTTCACTTATACTG-3‘用CTAB法提取油菜中油821基因组DNA，在引物P3和P4的引导下进行PCR扩 增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA 回收试剂盒回收长度约为1.8Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体 pGEM-Teasy (Promega公司)中。将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E. coli)DH5a感受态 细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37°C、 200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM_BnLECl。对 其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO. 3的核苷酸序列，包括19 个碱基的5' UTR区，3' UTR区为1889到1898位碱基。自5'端第20-72位碱基为该基 因组基因的第一个外显子，自5'端第73-1246位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自 5'端第1M7-1889位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5'端第1889-1898位碱基 为该基因组基因的3'非编码区。将该基因命名为&1LEC1，将其编码蛋白命名为&1LEC1，该 基因蛋白一级结构中所含保守的NF-YB结构域简图，见图7。2、用D7启动子驱动&1LEC1表达的转基因载体的构建挑选实施例2中步骤1中pGEM-BnLECl序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA， 用从NEB公司购得的Ml I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国 公司)回收&1LEC1基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过 的pCAMBIA-2300 (简称pC2300)连接，形成pC2300: BnLECl的中间载体。然后分别把实施例1中步骤一中步骤2得到pGEM-D7正确的阳性克隆，大量制备 质粒DNA JSHindinAal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公 司)回收D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的 PC2300: :BnLECl中间载体连接，分别形成pC2300_D7: BnLECl的最终载体。热激法转化大肠杆菌(E. coli)DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡 那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切 鉴定。表达载体的构建图，见图8。
3、转基因油菜的获得1)转化农杆菌将步骤2得到的表达载体PC2300-D7: :&iLECl用电激转化方法转入农杆菌中。挑 取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L) 中，28°C，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2%接种量接菌于含有利福平和卡那霉 素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5，000rpm、20分钟 离心收集菌体，菌体 重悬于250ml含有5 %蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇勻，得到含 有 pC2300-D7: BnLECl 的转化液。幻转化油菜转pC2300-D7: BnLECl 的转基因油菜把含有pC2300-D7: BnLECl的转化液转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的油菜 花序(该油菜是Westar)浸泡在转化液中，浸泡1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为 提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜 种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗，至 此获得转PC2300-D7: =BnLECl的转基因油菜。4、转基因油菜的检测以非转基因油菜Westar为野生型对照。将转基因油菜苗培养，得到Tl代种子，对Tl代种子(转pC2300-D7: BnLECl的转 基因油菜和野生型对照)进行含油量的测定与计算，其中含油量=种子油脂(质量)/种子 干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECT0R22/N型傅立叶变换近红外 光谱仪测定，运用OPUS 5. 5软件进行分析得到的。光谱采集条件分辨率ScnT1，扫描次数32 次，谱区范围12000-4000(^-1,室温23_25°C。测定结果如图9所示，D7启动子驱动foiLECl 过表达，转PC2300-D7: IBnLECl的转基因油菜种子含油量高于Westar野生型对照种子含油 量，说明D7启动子驱动&1LEC1过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。实施例3、种子含油量高的转基因拟南芥和转基因油菜的获得及其检测1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因&1L1L的克隆根据拟南芥LlL的核苷酸序列(GenBank号AB025628)设计引物P5和P6，用于 扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子 BnLlL基因基因组DNA序列，引物序列如下(酶切位点划线为酶切位点，前面三个碱基为保 护碱基)P5 (BnLlL 上游引物)5 ‘ -TTAGTCGACAGGGTTTGGTGATTGGGATC-3 ‘P6 (BnLlL 下游引物)5 ‘ -CGAGGATCCGGTATGCGTTGAAGCTCCTC-3 ‘用CTAB法提取油菜中油821基因组DNA，在引物P5和P6的引导下进行PCR扩 增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA 回收试剂盒回收长度约为1. 1Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体 pGEM-Teasy (Promega公司)中。将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E. coli)DH5a感受态 细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37°C、 200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM_&iLlL。对 其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO. 4的核苷酸序列，包括沈0个碱基的5'端非编码区，3'端非编码区为911到1170位碱基。自5'端第216-276位碱 基为该基因组基因的第一个外显子，自5'端第277-341位碱基为该基因组基因的第一个 内含子，自5'端第342-910位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5'端第911-1170 位碱基为该基因组基因3'非编码区。将该基因命名为&1L1L，将其编码蛋白命名为&1L1L， 该基因蛋白一级结构中所含保守的NF-YB结构域简图，见图10。2、用DO、D6和D7启动子驱动BnLlL表达的转基因载体的构建挑选实施例3中步骤1中pGEM-BnLlL序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA， 用从NEB公司购得的Ml I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国 公司)回收&1L1L基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过Ml I/BamH I (购于NEB公司)双酶切过的pCAMBIA-2300 (简称pC2300)连接，形成pC2300: BnLlL的 中间载体。然后分别把实施例1中步骤一中步骤2得到pGEM-DO、pGEM_D6和pGEM_D7正确 的阳性克隆，大量制备质粒DNA，经Hindlll/Ml I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收 试剂盒(购自鼎国公司)回收D0、D6和D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche 公司)与经过相同酶切过的PC2300: :BnLlL中间载体连接，分别形成pC2300-D0: BnLlL, PC2300-D6: BnLlL 和 pC2300_D7: BnLlL 的最终载体。热激法转化大肠杆菌(E. coli)DH5 α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡 那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切 鉴定。表达载体的构建图，见图11。3、种子含油量高的转基因油菜的获得1)转化农杆菌将步骤2 得到的表达载体(pC2300-D0: :&iL1L、pC2300-D6: :&iL1L 和 PC2300-D7::BnLlL)用电激转化方法转入农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于 20mlLB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，观°C，150rpm振荡培养2 天。然后，所获菌液以2%接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照 上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5，OOOrpm,20分钟离心收集菌体，菌体重悬于 250ml含有5 %蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇勻，分别得到含有pC2300_D0 BnLlL, PC2300-D6: BnLlL 禾口 pC2300_D7: BnLlL 的转化液。2)转基因油菜中油821的获得本步骤所指的油菜品种是中油821。把含有pC2300-D0 BnLlL的转化液和含有pC2300_D6 BnLlL的转化液分别转入 塑料袋中，将已经去掉果荚和花的油菜花序浸泡在转化液中，浸泡1分钟为宜，浸泡期间不 停晃动浸染液。为提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的 油菜培养，得油菜种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为 转基因油菜苗，至此获得转PC2300-D0: BnLlL的转基因油菜和转pC2300_D6 BnLlL的转 基因油菜。a、转pC2300-D0: BnLlL的转基因油菜种子含量检测以非转基因油菜中油821为野生型对照。将转基因油菜苗继代培养，得到Tl代种子，对Tl代种子(转pC2300-D0: BnLlL的转基因油菜和野生型对照)进行含油量的测定与计算，其中含油量=种子油脂(质量)/ 种子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECT0R22/N型傅立叶变换近 红外光谱仪测定，运用OPUS 5. 5软件进行分析得到的。光谱采集条件分辨率ScnT1，扫描 次数32次，谱区范围12000-4000(^-1,室温23_25°C。测定结果如图12所示，DO启动子驱动&1L1L表达，由于&1L1L表达量过高，使得 转基因油菜种子中的油含量低于非转基因野生型对照中油821。b、转pC2300-D6: BnLlL的转基因油菜种子含量检测将转PC2300-D6::BnLlL的转基因油菜和野生型对照的Tl代种子按照上述的测定 方法进行含油量的测定，测定结果如图13所示，用D6启动子驱动&1L1L过表达，转基因油 菜种子含油量高于中油821野生型对照的种子含油量。3)转基因油菜Westar的获得及其种子含油量的检测本步骤所指的油菜品种是ffestar。按照步骤2)中获得转基因油菜中油821的方法，制备转pC2300-D6: BnLlL的转 基因油菜Westar和转pC2300_D7: BnLlL的转基因油菜Westar。a、转pC2300-D6: BnLlL的转基因油菜种子含油量检测转基因油菜Westar的含油量检测以非转基因油菜Westar为野生型对照。将转pC2300-D6: BnLlL的转基因油菜和野生型对照的Tl代种子按照步骤2)的 测定方法进行含油量的测定，测定结果如图14所示，用D6启动子驱动&1L1L过表达，转基 因油菜种子含油量高于野生型对照的种子含油量。b、转pC2300-D7: BnLlL的转基因油菜种子含油量检测将转pC2300-D7: BnLlL的转基因油菜和野生型对照的Tl代种子按照步骤2)的 测定方法进行含油量的测定，测定结果如图15所示，用D7启动子驱动&1L1L过表达，转基 因油菜种子含油量高于野生型对照的种子含油量。4、种子含油量高的转基因拟南芥的获得将实施例3的步骤2得到的pC2300-D0: BnLlL和pC2300_D7: BnLlL按照步骤一 的步骤2的步骤2)提供的方法导入拟南芥Col-Ο，制备出转PC2300-D0::BnLlL的转基因拟 南芥和转PC2300-D7: BnLlL的转基因拟南芥。1)转pC2300-D0: BnLlL的转基因拟南芥的检测a、转pC2300-D0: BnLlL的转基因拟南芥的幼苗表型将转PC2300-D0::BnLlL的转基因拟南芥种子进行卡那霉素筛选，得到阳性转基 因植株，将阳性植株的种子播在MS培养基上，以Col-O非转基因野生型种子作为对照，在培 养条件为22°C，光照强度80-120 μ E-2S-1,16小时光照的温室中培养。转基因拟南芥种子在 MS培养基上萌发生长12天的表型为发育相对迟缓，幼苗相对弱小，幼苗期没有子叶或子叶 变小，见图16。说明转PC2300-D0::BnLlL的转基因拟南芥种子胚胎在发育时受到影响，导 致胚胎发育异常，从而影响幼苗的生长发育，导致子叶消失或子叶变得短小。b、种子含油量测定以非转基因Col-O为野生型对照。分别取同批次转pC2300-D0: BnLlL的转基因拟南芥和野生型对照种子各100毫克，在液氮中研磨成干粉，然后转移到带密封盖的试管中，加入3ml甲醇(含2. 5%，ν/ν)，在 80°C水浴加热90分钟.再加入4. 5ml 0. 9% NaCl和Iml正己烷，混勻，4，OOOrpm离心10 分钟，收集正己烷相。真空抽干正己烷，用100 μ 1乙酸乙酯溶解真空干燥残留物，取Iy 1 上样分析。所用GC/MS仪为TurboMass (Perkin Elmer公司)，所用GC柱为30mX 0. 25mm BPX-70柱，GC升温程序为初始温度120°C，保持1分钟，以每分钟10°C的速率升至150°C， 然后以每分钟4°C的速率升温至230°C，保持10分钟.以C17:0的三酯酰甘油作内标。结果如图17所示，DO: BnLlL转基因拟南芥种子含油量明显低于Col-O非转基因 野生型种子含油量。2)转pC2300-D7: BnLlL的转基因拟南芥的检测以非转基因Col-O为野生型对照。按照步骤4中测转pC2300-D0:: BnLlL的转基因拟南芥种子含油量的方法，测定转 PC2300-D7: :BnLlL的转基因拟南芥和野生型对照中种子的含油量。结果如图18所示，转PC2300-D7::BnLlL的转基因拟南芥的种子含油量明显高于 Col-O非转基因野生型种子含油量。上述结果表明D7启动子驱动BnLlL适度过量表达后可以显著提高拟南芥种子的 含油量，而DO启动子驱动&1L1L由于表达量过高反而使得拟南芥种子中的含油量下降。序列表<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>来源于甘蓝油菜的启动子及其应用<160>4<210>1<211>1145<212>DNA<213> 甘蓝油菜(Brassica napus)<400>1
0177]aagctttcttcatcggtgattgattcctttaaagacttatgtttcttatcttgcttctga600178]ggcaagtattcagttaccagttaccacttatattctggactttctgactgcatcctcatt1200179]tttccaacattttaaatttcactattggctgaatgcttcttctttgaggaagaaacaatt1800180]cagatggcagaaatgtatcaaccaatgcatgtacctcttgttctcaaaac2400181]atctatcggatggttccatttgctttgtcatccaattagtgactactttatattattcac3000182]tcctctttattactattttcatgcgaggttgccatgtacattatatttgtaaggattgac3600183]gctattgagcgtttttcttcaattttctttattttagacatgggtatgaaatgtgtgtta4200184]gagttgggttgaatgagatatacgttcaagtgaagtggcataccgttctcgagtaaggat4800185]gacctacccattcttgagacaaatgttacattttagtatcagagtaaaatgtgtacctat5400186]aactcaaattcgattgacatgtatccattc3.3. C 3. 3.3.3.3. taaaccagcctgcacctgca6000187]tccacatttcaagtattttcaaaccgttcggctcctatccaccgggtgtaacaagacgga6600188]ttccgaatttggaagattttgactcaaattcccaatttatattgaccgtgactaaatcaa7200189]ctttaacttctataattctgattaagctcccaatttatattcccaacggcactacctcca7800190]aaatttatagactctcatccccttttaaaccaacttagtaaacgtttttttttttaattt840
tatgaagttaagtttttaccttgtttttaaaaagaatcgttcataagatgccatgccaga900
acattagctacacgttacacatagcatgcagccgcggagaattgtttttcttcgccactt960
gtcactcccttcaaacacctaagagcttctctctcacagcacacacatacaatcacatgc1020
gtgcatgcattattacacgtgatcgccatgcaaatctcctttatagccta1080
catccgcttcactctttactctcatcaatacaaacaagat 3.3.3.3.3. C 3. 3.1140
cacga1145
<210>2
<211>937
<212>DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>2
C 3. C 3.3.3. C 3. C 3.aaagtcgtgtatttagaacaagaaagatatggaacgtggaggcttccatg60
gctaccgcaagctgtccgtg3.3.C3.3.C3.CC3.ctccttctccaccaggattagcagcgaatt120
ttctgatggcagagggcagtatgcgtcctccagaattcaaccagcctaacaaaaccagta180
atggtggtgaggaggagtgcacggtgagggagcaagacaggttcatgcctattgccaacg240
tgatacggatcatgcggaggatcttacctgctcacgccaagatctcagatgactccaagg300
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ggtgccagcgggaacagcgcaagaccatcactgctgaggacgtcttgtgggcaatgagca420
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taactgttagtaggtgcaagctgtagcttatgaattcaagtttaagcgaaaacaatgctg840
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<210>3
<211>1898
<212>DNA
<213> (Brassica napus L)
<400>3
cgaggacggcagagaaacaatggaacgtgg agctcctctctctcactatcagctacccaa60
atctaactctggtaatcaaataataagtgcctatttatgtatatacgtgcctgcactatg120
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caaatatttcgtgatatggtatataagaacaatttttaatgggggatgatagatcttcat420
权利要求
1.一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或幻或3)1)序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
2.一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或幻或3)1)序列表中序列1的自5’端第872-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
3.一种启动子，其核苷酸序列是如下1)或幻或3)1)序列表中序列1的自5’端第891-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
4.含有权利要求1-3任一所述的启动子的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是权利要求1-3任一 所述的启动子与下述1)或幻或幻的基因一起插入载体pCAMBIA-2300的多克隆位点制成 的重组载体1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
6.含有权利要求1-3任一所述的启动子的转基因细胞系。
7.含有权利要求1-3任一所述的启动子的重组菌。
8.权利要求1-3任一所述的启动子在驱动目的基因在胚胎或种子组织中特异表达中 的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述目的基因是下述1)或幻或幻的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
全文摘要
本发明公开了来源于甘蓝油菜的启动子及其应用。该启动子核苷酸序列是如下1)或2)或3)1)序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。将该启动子适度表达AtL1L基因、BnLEC1基因和BnL1L基因，可以提高油料作物油菜种子中的油含量，这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
文档编号C12N15/11GK102071193SQ200910238288
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者左建儒, 谭河林 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所