专利名称：：海洋细菌新型低温碱性蛋白酶mp晶体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体。
背景技术：
：酶制剂产业经历了半个多世纪的起步和迅速发展之后，现已形成一个富有活力的高技术产业，在洗涤、皮革、食品、饲料、制药和纺织等工业领域得到广泛应用。蛋白酶作为一种酶制剂，其市场占有率已经超过了40%。碱性蛋白酶的应用起源于20世纪60年代，来自地衣芽孢杆菌的Carlsberg丝氨酸蛋白酶首次作为洗涤添加剂被推向市场。由于其不仅能够水解去除衣物上的奶渍、汗渍、血渍等污物，而且与洗涤剂的相容性较好，因此受到了世界范围的酶制剂市场的关注。随着绿色、环保、节能理念的深入，无磷和低温洗涤已成为一个趋势，它改变了长久以来的洗涤习惯。为了获得更好的洗涤效果，人们不得不提高洗涤液的碱度，同时在洗涤液中添加氧化剂增强洗涤效果，但已有的天然碱性蛋白酶不能很好的适应现有的应用环境。因此，许多国家展开了应用蛋白质工程对现有的碱性蛋白酶进行人工改造的研究，同时从自然界中寻找新的碱性抗氧化蛋白酶。传统上从自然界中筛选得到的抗氧化蛋白酶OSP(OxidatilvelyStableProtease)多数来源于陆地的芽孢杆菌属菌株，属于丝氨酸蛋白酶类。海洋环境不同于陆地，造就的生物具有独特的代谢途径和遗传背景，代谢过程中的酶类在性质、功能上与陆地生物酶有很多不同。欧、美及日本等国每年投入数亿美元的资金，用于海洋酶领域的研究与开发。在海底发现了许多极端微生物。这些微生物生活在接近冰点的环境中，它们的酶演化出适应低温的能力。例如来自黄海的细菌YS-80的新型低温碱性蛋白酶MP就具有独特性能的低温蛋白酶，为目前我国紧缺的蛋白酶增添新来源，深入进一步研究开发是我国酶制剂工业急需迫切任务。
发明内容本发明的目的在于采用现代科学技术，开发提供来自黄海的细菌YS-80的海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体。本发明提供的海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体(简称蛋白酶MP(晶体))，其特征在于来自黄海的海洋细菌YS-80的新型低温碱性蛋白酶MP晶体，既具有蛋白酶MP结构特征性能，又具有晶体特征参数，蛋白酶MP是胞外酶，分子量49320Da，pi=8.5，最适催化温度30°C，最适pH9.5;EDTA抑制酶活性。低温碱性蛋白酶MP含463个氨基酸。蛋白酶MP是一种整体结构较紧凑的低温蛋白酶。和中温同源蛋白相比，低温酶通常柔性更好，氢键更弱，表面环区更松散，蛋白酶MP整体结构见图l，蛋白酶MP结构中含有一个锌离子、两个氯离子和八个钙离子。蛋白酶MP有两个结构域，N端结构域是蛋白水解结构域，含有活性位点(包括锌离子)，从20至247残基。C端结构域是从248至463残基，包括一个平行P巻结构和七个结合的钙离子，主要和蛋白稳定性相关。蛋白酶MP和PAP有42个氨基酸的差别，主要是在C端结构域。结合锌离子的活性位点在蛋白酶MP中含有保守的锌结合金属蛋白酶(metzincin)的基序HEXXHXXGXXHZ(蛋白酶MP的169-180残基)，其中Hisl69，Hisl73，Hisl79和Tyr209是锌离子的配体。Tyr209和锌离子距离为2.77A。f丐离子蛋白酶MP含有8个钙离子。通过蛋白酶MP的结构分析，蛋白酶MP的8个钙离子中的5个(Ca700，Ca701，Ca702，Ca705andCa706)结合在平行P巻结构的核心，在这里其它离子很难进入并占据配基的位置。蛋白酶MP中的Ca704和Ca707这两个钙离子的所有配基都和氨基酸残基结合，而Ca703却更靠近溶剂。环区蛋白酶MP的整体结构较紧凑，主要表现为蛋白酶MP中的几个环的位置向蛋白内部移动。这些环包括残基21-29，67-70，220-226，405-421,428-432和440-447。蛋白酶MP晶体见图2，晶体结构数据列于表1。表l蛋白酶MP的晶体结构数据<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述晶体结构测定与精修是在1.1000埃的锌离子吸收波长收集天然蛋白的衍射数据并以Denzo软件处理数据。在SWISS-MODEL网站使用PAP的第三种形式的晶体结构(PDB编号10MJ)构建MP的结构模型，以此作为分子置换(MR)的模板。以MolR印软件完成分子置换。以Coot软件建立2Fo-Fc电子密度图，以Refmac5软件进行结构精修。由于缺少电子密度，残基1-2以及184-188没有出现在蛋白结构中。本发明提供的海洋细菌YS-80的新型低温碱性蛋白酶MP晶体的培育成长分下列步骤。①提取和纯化蛋白酶MP由海洋细菌YS-80发酵制备。将海洋细菌YS_80(分离自深海海泥海洋细菌(YS-80)保藏在中国武汉CCTCC，保藏号为CCTCCNO:M209177。)在最适温度(30°C)培养48h，MP分泌到培养基中，离心(如5000rpm，30分)发酵液弃去菌体。上清液在4°C用65wt%硫酸铵沉淀30分钟，沉淀复溶于去离子水中，通过截留分子量为10kD的超滤膜浓縮上清液，冻干浓縮液，再在Tris缓冲液(lOmMTris，lOOmMNaCl，pH8.0)复溶冻干粉并用Superdex200(GE公司)分子筛凝胶柱层析纯化得到纯化的蛋白酶MP。上述所述Tris为三羟甲基氨基甲烷。电感耦合等离子体发射光谱(ICP)分析蛋白酶MP溶于Tris缓冲液(同上)，送至中科院上海有机化学所进行ICP分析测定金属原子在蛋白中的含量。结果说明蛋白中含有锌离子和钙离子(表2)。表2MP蛋白酶的IPC分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>以Tris缓冲液(10mMTris，lOOmMNaCl，pH8.0)反复稀释和浓縮待测样品，确保蛋白酶MP样品不受杂质的干扰。ICP分析检测出蛋白酶MP样品中含有四种原子。能够确认MP中存在钙离子、锌离子和磷酸根离子。理论上ICP不能对蛋白中的原子进行定量分析，但可以计算相对浓度。钙离子的浓度大约是锌离子浓度的八倍，这一结果同蛋白酶MP蛋白中钙离子和锌离子的真实比值一致。②结晶步骤①分子筛层析得到的蛋白酶MP浓縮至20mg/ml，以悬滴蒸汽扩散法(公知的)在不同温度筛选蛋白酶MP的结晶条件。在20°C，pH8.5，0.2mol/L乙酸钠，O.lmol/LTris和30X聚乙二醇4000的条件下获得蛋白酶MP的针状晶体，但不能用于X射线衍射。优化后的结晶条件为4。C，pH8.O，O.2mol/L乙酸钠，O.lmol/LTris，25%聚乙二醇4000和0.lmol/L硫酸锂。晶体(图2)装入毛细管，送至芝加哥阿贡国家实验室先进光子源(APS)进行X射线衍射测定。结果如表l。本发明提供的海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体的酶制剂在洗涤、医药、皮革、纺织、饲料等领域具有广泛应用用途。图1蛋白酶MP整体空间结构模型图图2蛋白酶MP晶体具体实施例方式本发明用下列具体实施方案例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并非限于下列具体实施方案例。本发明的海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体，制备为提取及纯化将海洋细菌YS-80(分离自深海海泥海洋细菌(YS-80)保藏在中国武汉CCTCC，保藏号为CCTCCNO:M209177。)在最适温度(30°C)培养48h，MP分泌到培养基中，离心(如5000rpm，30分)发酵液弃去菌体。上清液在4t:用65wt^硫酸铵沉淀30分钟，沉淀复溶于去离子水中，通过截留分子量为10kD的超滤膜浓縮上清液，冻干浓縮液，再在Tris缓冲液(10mMTris，100mMNaCl，pH8.0)复溶冻干粉并用Superdex200(GE公司)分子筛凝胶柱层析纯化得到纯化的蛋白酶MP。由中科院上海有机化学所进行ICP分析测定金属原子在蛋白中的含量。结果说明蛋白中含有锌离子和钙离子(表2)。结晶步骤①分子筛层析得到的蛋白酶MP浓縮至20mg/ml，以悬滴蒸汽扩散法在不同温度筛选蛋白酶MP的结晶条件。在20。C，pH8.5，0.2mol/L乙酸钠，O.lmol/LTris和30%聚乙二醇4000的条件下获得蛋白酶MP的针状晶体，但不能用于X射线衍射。优化后的结晶条件为4。C，pH8.O，O.2mol/L乙酸钠，0.lmol/LTris，25%聚乙二醇4000和0.lmol/L硫酸锂。晶体(图2)装入毛细管，送至芝加哥阿贡国家实验室先进光子源(APS)进行X射线权利要求海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体，其特征在于该低温碱性蛋白酶MP晶体为斜状晶体，是胞外酶，分子量49320Da，PI＝8.5，最适催化温度30℃，最适PH9.5，EDTA抑制酶活性，含463个氨基酸；整体结构中主要表现为几个环的位置向蛋白内移动，含有一个锌离子、两个氯离子和八个钙离子的N端结构域和C端结构域，所述N端结构域是蛋白水解结构域，含有结合锌离子活性位点，从20至247残基，其中His169，His173，His179和Tyr209是锌离子的配体，Tyr209和锌离子距离为2.77A，所述C端结构域是从248至463残基的一个平行β卷结构和七个结合钙离子，其中Ca700，Ca701，Ca702，Ca705和Ca706结合在平行β卷结构的核心，Ca704和Ca707的钙离子的所有配基都和氨基酸残基结合，Ca703更靠近溶剂；所述环包括残基21-29，67-70，220-226，405-421，428-432和440-447；晶体结构参数为空间群P212121晶胞参数a＝45.91b＝75.20c＝115.42分子数(a.u)1MatthewsCoefficient1.96数据采集解析度62.99-1.80衍射点数28189Completeness(％)78.25模型和精修参数总原子数3744蛋白(463残基)3396水分子337金属离子9氯离子2Rwork(％)16.98Rfree(％)21.90ReflectionsincludedinRfreeset1472立体化学参数键长键角1.927°氨基酸拉氏图分布分析最适宜区域97.35％允许区域2.65％。F2009102427195C00011.tif,F2009102427195C00012.tif,F2009102427195C00013.tif,F2009102427195C00014.tif全文摘要本发明涉及一种海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体，其特征在于该低温碱性蛋白酶MP晶体为斜状晶体，是胞外酶，分子量49320Da，PI＝8.5，最适催化温度30℃，最适PH9.5，EDTA抑制酶活性，含463个氨基酸；整体结构中主要表现为几个环的位置向蛋白内移动，含有一个锌离子、两个氯离子和八个钙离子的N端结构域和C端结构域，所述N端结构域是蛋白水解结构域，含有结合锌离子活性位点，所述C端结构域是从248至463残基的一个平行β卷结构和七个结合钙离子，结合在平行β卷结构的核心。该蛋白酶MP晶体的酶制剂在洗涤、医药、皮革、纺织、饲料等领域具有广泛应用。文档编号C12N9/52GK101717762SQ200910242719公开日2010年6月2日申请日期2009年12月15日优先权日2009年12月15日发明者孙谧,朱重昊,王伟,王芳,郝建华申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所