专利名称：一株腐败希瓦氏菌及其在有机废弃物处理上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，具体是涉及微生物在生产生物有机肥的技术应用，主要是一株腐败希瓦氏菌及其在有机废弃物处理上的应用。
背景技术：
在占地球表面超过80%的海洋、极地、冰川、高山和冻土等低温环境中广泛分布和生存着大量的低温菌[它们在长期的进化过程中，建立了能够适应冷环境的生长机制，依赖于独特的低温启动子，其RNA聚合酶即使在0°C也能进行基因的高效转录，保持菌体在低温下的正常生长和繁殖，这种有别于常温菌和高温菌的生命活动现象，其独特性值得人们加倍重视。1975年，Morita首次系统的报道了低温细菌，并分析了其生理特点，低温微生物可以在寒冷环境下生长，而人们所熟悉的嗜温微生物则在寒冷环境下表现为生 长停止甚至死亡，原因是嗜温微生物在极端环境下酶活力过低和蛋白质变性，表明低温微生物与嗜温微生物具有明显不同的生理机制。低温微生物在催化低温发酵过程和寒冷地区污水处理等领域具有潜在的应用价值。对低温微生物耐冷性的研究，不仅可以揭示其冷适应机理，同时为低温微生物应用提供坚实的理论基础。近年来，对低温微生物冷适应机理及其应用的研究逐渐展开，其中包括嗜冷酶的基本结构特点与其低温活性的关系，膜系统的流动性保持的分子基础和脂肪酸的组成关系，冷休克蛋白和抗冻蛋白结构及功能研究等领域。根据Morita的标准，低温微生物被分为两类可以在T5°C生长，最高生长温度在20°C以上生长，最适生长温度可以大于15°C的一类被称为耐冷微生物(psychrotoerants);可以在0°C或0°C以下生长，最适生长温度低于15°C，最高生长温度不超过20°C的一类微生物被称为嗜冷微生物(psychrophiles)。本发明应用的微生物腐败希瓦氏菌/wire/aciefls)属于耐冷微生物。在冬季o-io°c的低温环境下牛粪等有机物的堆肥起温是关键，中、高温菌在低温下难以正常繁殖，而低温菌细胞膜含有大量不饱和脂肪酸，使膜在低温下也能保持半流动状态，运输物质；加之核糖体结构和功能对低温不敏感，酶和蛋白质仍可合成并发挥作用。因此本发明利用低温菌的特殊生理机制，在冬季o-io°c的低温环境下的堆肥中加入低温菌，在堆肥发酵初期，这些低温菌首先利用堆肥中的可溶性糖和淀粉等简单有机物大量的快速的繁殖而产生热量，促进堆肥温度迅速升高，温度升高到15-20°c启动了中温微生物的大量繁殖，大量繁殖的代谢热量保证了堆肥的起温过程。堆肥启温过程的快慢是由加入的低温菌的数量和繁殖速度决定的。本发明应用的腐败希瓦氏菌就是在0-10°C时在牛粪等有机物中繁殖最快的微生物菌种。腐败希瓦氏菌的快速繁殖产生的热量能有效的促进中温菌和高温菌的繁殖，进而启动了堆肥的发酵温度，使堆肥能快速的达到高温阶段，完成堆肥的无害化处理。微生物发酵法是一种常用的低投入、高效益畜禽粪便无害化处理方法，畜禽粪便多数是自然堆积发酵，时间长，堆肥温度低，对有害微生物、寄生虫卵的杀灭和除臭效果不理想，并且长期的堆肥导致厌氧发酵增多，反消化细菌大量增殖，大量的氮元素损失。因此，在牛粪等有机物堆积过程中添加有效微生物，不仅可以加速有机碳的分解，减少氮素损失，减少堆制过程中氨气、硫化氢的挥发，缩短发酵时间，而且堆肥升温高，可以杀死病原微生物和寄生虫，使粪便达到充分腐熟，生产出优质的绿色有机肥料。在冬季等低温环境下堆肥起温是关键技术，有机物堆肥能否快速进入高温期影响着堆肥的无害化进程和发酵周期。在堆肥中蛋白酶和纤维素等酶活和酶效最高的微生物是中温菌，一旦环境达到中温菌的生长条件，就能大量的分解有机物，促进堆温升高和高温菌大量繁殖，产生生物热进入高温期。温度是堆肥顺利进行的重要因素，可以直接反映堆肥进程，温度上升是微生物代谢产热及堆体保温效应共同作用的结果。在已报道和公开的技术中冬季发酵牛粪等生产有机肥采用的启温方法是在堆肥中输入热蒸汽和热水的方法来达到堆肥的启温过程，或者直接在堆肥的堆制部位铺设加温的装置来控制和增加堆肥的温度。比如专利CN10179234A公开的有机物堆肥启温的方法是采用加热装置在发酵仓底部加热。专利CN101200386B是发明了一个增温和增氧的可调螺旋搅拌式堆肥装置，用于堆肥的温度升高。这些方法都是在有机物堆肥前期通过增加外部的能量来启动发酵，虽然方法先进、适用，但是采用的设备比较昂贵和大大的增加了生产有机肥的成本。仅能在有条件的有机肥生产中应用，而在中小型的有机肥生产企业中难以 推广。同样有专利公开了利用复合微生物应用于低温有机物发酵，比如专利CN101381689A公开了利用枯草芽孢杆菌、圆褐固氮菌、绿色木霉制成的发酵剂用于堆肥的温度升高；专利CN101880182A采用枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、小单孢菌和嗜纤维分解菌用在低温是发酵畜禽粪便和处理秸杆。专利CN1800357A公开的内容提到了低温细菌和高温细菌，但其特指的低温细菌是发酵酵母和白地霉。上述专利公开的一些微生物是自然界中常见的种类多数属于中温菌类型。虽然有些菌种适应低温环境，但这些菌种在低温条件下的具体生长情况和数量没有公开说明，这些专利提到的菌种没有包括本专利发明的腐败希瓦氏菌或者与腐败希瓦氏菌相近的菌种。关于低温环境的希瓦氏菌的研究和应用也有许多公开的资料，比如微生物学报2004，44 (5):526-566中报道了希瓦氏菌在低温环境下用于降解染料。专利申请号200910140943. 3和201010220341. I公开了希瓦氏菌用于微生物燃料电池；200310112361. 7公开了希瓦氏菌用于脱色；00806387. 7公开了希瓦氏菌用于对石油烃污染物的清除。这些公开的内容共同说明希瓦氏菌是一种低温的微生物，比较适应低温的环境能依据其特点发挥其功能。申请者查阅了所有公开的资料和文献还没有发现适应低温环境的希瓦氏菌在处理有机废弃物中用于堆肥启温方面的应用和报道。
发明内容
为了解决冬季低温情况下中小型有机肥厂处理有机废弃物中出现的堆肥发酵启温慢，甚至无法启温的技术难题，本发明充分利用低温微生物的特点从长期放置于低温的牛粪中(牛粪样品放置低温冰箱中6个月以上)分离到一株能在低温环境下的牛粪等有机物堆肥内的有效微生物菌群中占主导地位的微生物菌株，命名为CR7菌株。本发明所提供的CR7菌株,经鉴定为腐败希瓦氏菌putrefaciens),保藏编号为CGMCC No. 6192。本发明所述的腐败希瓦氏菌CGMCC No. 6192在有机废弃物处理中的应用。
本发明还公开了一种由腐败希瓦氏菌CGMCC No. 6192制成的微生物菌剂。 所述微生物菌剂可通过下述方法制备
(1)将CR7细菌在低温5°C条件下活化，挑选生长速度最快的单菌落，作为发酵菌剂的菌种；
(2)按照配方(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1L)，配制发酵所需培养基2-4L，121 °C 20min 灭菌；
(3)将豆粉与麸皮按照1:3的体积比例拌均匀，含水量30%，装袋，每袋200g，包扎121°C30min灭菌，共灭菌两次，间隔24h ；
(4)将(I)活化的菌种接种到(2)制备的培养基中，置15°C120r/min摇床发酵48h ；
(5)在无菌条件下，将步骤(3)发酵料与步骤(4)的菌液，按照体积比固体料菌液=2 5的比例混合均匀，放在烘箱中30V烘干，抽样检测后包装。(6)检测步骤(5)烘干的样品中CR7的活菌数量。CR7的数量达到IO8以上，符合标准。上述制备的烘干菌剂，在包装袋不损坏情况下，室温条件下储藏时间为6个月，0-4°C条件下储藏时间为2年，保存有效菌体的数量是105cfu/min以上。上述菌剂在低温条件下启动发酵的应用
(I)菌剂的扩繁在室内(10°c以上)菌剂按照1:10的体积比混拌在砻糠或麸皮等有机料中，加入总体积的30%的温水(20-30°C)，搅拌均匀，堆制发酵10-20h。(2)在室外(O-IO0C )堆制的新鲜牛粪按着生产有机肥的方法在添加配料的同时加Ad)扩繁的启动菌剂，加入量为体积比的1:1000搅拌均匀，堆制发酵。(3)堆肥中放入温度计，观察加入启动菌剂和不加入启动菌剂(正常有机肥的生产)的堆肥中的温度变化。堆肥48h后加入启动菌剂的处理组温度上升到50°C以上，高出对照组的温度10-15°C。为启动发酵成功。腐败希瓦氏菌CGMCC No. 6192分离自长期处于低温环境的牛粪堆肥中，并且低温环境下在牛粪等有机物堆肥内的有效微生物菌群中占主导地位。由该菌种制得的菌剂能在冬季牛粪等畜禽粪便堆肥中应用，快速启动堆肥发酵，提高堆肥发酵温度，缩短堆肥的发酵周期，减少氮元素的损失作用。提高产量和减少生产成本。另一方面，该菌剂应用于利用畜禽粪便生产有机肥的促腐剂中，在冬季无论是在室内和露天生产有机肥均能确保有机肥发酵温度的启动和缩短有机质腐熟的周期。
具体实施例方式于2012年6月6日将菌株CR7送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为腐败希瓦氏菌/wire/aciefls),保藏编号为CGMCCNo. 6192 ;保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所；邮编100101 。实施例一牛粪堆肥启动菌种的分离
采集新鲜牛粪和牛粪堆肥的拌料(牛粪中加入1%豆柏、1%砻糠、2%草木灰)放置于
0-4°C冰箱中，6个月后采用肉汤培养基分离微生物菌种，分离方法是稀释分离法，分离温度是1_4°C，挑取48h内生长出单菌落的微生物菌株，继续用肉汤培养基在低温下诱导培养，选择在24h内生长出明显单菌落的微生物菌种编号，保存备用。实施例二 菌种在灭菌牛粪培养基中适应性的测定
实施例一筛出的系列菌种接种到灭菌的牛粪培养基中，培养及配方是牛粪中加入1%豆柏、1%砻糠、2%草木灰。置0-5°C的冰箱中，每隔2h测菌体数量，根据菌体数量制定每个菌种的生长曲线，保留在48h内生长达到105cfu/min以上的菌种，选取在最短时间内繁殖到达最大生长数量和菌体繁殖数量最高的菌种。通过实验得到一株在牛肉膏培养基上是乳红色的菌种，实验编号为CR7，CR7在16h达到I. 3X109cfu/ml, OD400是I. 473，比达到同等数量的大肠杆菌CGMCC1. 907繁殖速度快了 4h。实施例三CR7菌株在露天堆制牛粪中的生存数量测定
纯化的CR7菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上发酵培养48小时，发酵液4000r/min离心，保留沉淀物，即CR7菌株菌体，这些菌体按照1:10的体积比混拌到灭菌的砻糠或麸皮
中，测定菌体含量在108cfu/min以上，及制备了 CR7菌剂。按照O. 1%的比例接种到新鲜牛粪中，混拌均匀，堆制发酵。每天取堆肥中20cm下的样品，在实验室内立即采用稀释分离方法测定样品中CR7菌株的菌体数量。分离的培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基，调查平板上乳红色的细菌菌落数，即CR7菌株的菌落数。经测定48h达到I. 7X 109cfu/min。实施例四CR7菌株菌种鉴定
(I)形态和生理生化鉴定参照东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》，科学出版社，2001年。经观察CR7菌株CGMCC No. 6192 :生长范围为5_40°C，最适生长温度在25°C左右，生长pH范围7. 0-10. O。在牛肉膏蛋白胨固体培养基上是乳红色菌落，革兰氏染色阴性，过氧化酶阳性，吲哚、MR、VP和糖发酵实验阴性，产H2S。(2) 16s rDNA 鉴定鉴定
1)设计引物P0:5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQ ID NO. I)
P5 :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ (SEQ ID NO. 2)
由上海生工公司合成(PO代表正向引物，P5代表反向引物)；
2)菌株的培养按常规方法将CR7菌株接种于肉汤培养液中，28°C，180rpm 条件下振荡培养至对数期；
3)菌株16SrDNA的扩增和序列分析
PCR 反应体系10XPCR buffer 5 μ L, dNTP mixture (IOmM) I μ L，MgCl2 (25mM)4μ L,引物 PO (5 μ M) IyL, Ρ5(5μΜ) I μ L, Taq DNA polymerase (5U/μ L) O. 5 μ L,Template 5 μ L,加入 ddH20 致终体积 50 μ L。PCR 反应条件95°C预变性 10min，94°C变性 40s，46°C退火 40s，72°C延伸 I. 5min,30个循环，72 °C冷却，4 1至恒定。4)扩增后PCR产物由上海生工生物技术有限公司直接测序。测序结果在GENEBANK序列比较结果是CR7与腐败希瓦氏菌的同源性达到99%,结合形态和生理生化实验结果判断CR7菌株属于腐败希瓦氏菌Qsheivanellapu trefaci ens )。实施例五CR7菌剂的制备
(I)将CR7细菌在低温5°C条件下活化，挑选生长速度最快的单菌落菌株，试管保藏作为发酵菌剂的菌株；(2)按照配方(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1L)，配制培养基2-4L，灭菌121°C20min ；
(3)将豆粉与麸皮按照1:3的配料体积比拌好，加入体积比30%的水，每袋装入200g拌料，包扎好后，放入灭菌锅中，灭菌121°C 30min，24h后再121°C 30min灭菌，共灭菌2次；
(4)将保藏的菌种接种到发酵培养基中，15°C,120r/min发酵48h ；
(5)在超净工作台里，先用75%酒精将瓷盘灭菌，再将瓷盘紫外灭菌20min后，将灭菌的发酵料平铺在瓷盘上，将(4)发酵好的菌液，按照固体料菌液=200g 500mL的比例，倒在瓷盘的拌料上，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，放在烘箱中30°C烘干；
(6)采用稀释涂布法检测(5)干燥菌剂中CR7的活菌数量达到IO8以上，符合国家有机·肥接种剂的标准(NY 227-94)。·实施例六CR7菌剂在冬季牛粪堆肥生产有机肥的启动发酵作用
CR7菌剂在应用前要先扩繁，扩繁方法是在室内(10°C以上)将包装干燥的菌剂按照I 10的体积比混拌在砻糠或麸皮等有机料中，加入总体积的30%的温水(20-300C )，搅拌均匀，堆制发酵10-20h。按着生产有机肥的生产方法在添加配料的同时加入扩繁的CR7启动菌剂，加入量为体积比的1:1000搅拌均匀，堆制发酵。在冬季室外温度是0-10°C左右，堆制的新鲜牛粪中含有的微生物或者加入的中温菌的促腐剂很难繁殖，微生物不繁殖就不会产生温度或者微生物繁殖很慢，产生的热量很少。加入了 CR7启动菌剂后，CR7菌种在5°C左右就会很快繁殖。它的繁殖会不断的产生热量，产生的热量就会不断的促进周围的微生物开始繁殖，堆肥中大量的微生物都开始繁殖必然会产生大量的热量。这样堆肥的温度就很快的升高，一般加入CR7启动菌剂堆肥48h温度上升到50°C以上，高出不加入CR7启动菌剂的堆肥温度10-15°C。CR7启动菌剂的加入是起到启动和引领堆肥中微生物快速繁殖的作用。实施例七CR7低温启动菌剂与市场上公开销售的牛粪发酵促腐剂配合使用的效果
采用实施例五制备的菌剂，按照实施例六的方法加入牛粪的堆肥中，同时加入市场上销售的RW促腐剂(鹤壁人元生物肥技术研发中心生产)，产品使用参照产品说明书。实验场地选在江苏省泗洪县谷丰化工有机肥厂。实验设计
每一个处理组以总量10吨设计，发酵料分别为湿度为65%左右的纯牛粪6-7吨，砻糠
1-2吨，草木灰I吨，处理组一 CR7固体单菌剂和RW促腐剂按照体积比的1:10混合，每10吨加入2kg ;处理组二 每10吨加入2kgRW促腐剂；对照组不加任何促腐剂。每组的肥堆设计为长X宽X高为12mXl. 5mX I. 2m的堆体,用翻抛机进行翻抛,搅拌均勻，条垛式发酵。每天上午9点和下午4点，先测定室外温度，再用温度计插入肥堆30-40cm下，保持lOmin，读取肥堆的温度，记录数值。分别在堆肥发酵的起始和结束进行取样。用取土器插入堆中，每堆取5个点以上。取得的样品立即混合均匀，用密封袋冷冻保存。每处理各采集3个平行样品。立即烘干，用中华人民共和国有机肥新标准NY525-2011测定全氮和全碳的变化，计算C/N变化和水分变化，分析堆肥是否腐熟。
实验结果
测得每天室外平均温度在5°C左右，处理组一，堆肥时间在48h左右，温度上升到30°C左右，72h内肥堆温度升到50°C以上；处理组二，堆肥时间在60h温度上升到30°C，达到50°C需要80h ;对照组肥堆温度基本没有变化。重复两次实验证明结果一样，加入CR7单菌剂混合的RW菌剂，肥堆启动发酵时间缩短20h。根据有机肥新标准NY525-2011测定全氮含量由I. 78%上升至IJ 2. 01%和全碳由38. 02%降低到31. 32%, C/N由21. 36降低到15. 58，根据文献(吴银宝，汪植三.堆肥腐熟指标的研究.农业环境科学学报，2003，22 (2) 189-193.)C/N小于20，再结合堆肥温度达到50°C以上有4-5d，认为堆肥达到腐熟。因此运用CR7单菌剂混合的RW菌剂可以满足堆肥的要求，而且可以在低温5°C条件下，启动发酵，缩短发 酵时间20-30d左右。
权利要求
1.一株腐败希瓦氏菌(5^(9^3/7(9773 /w/ire/aciefls) CR7菌株，它的保藏号为CGMCCNo.6192。
2.腐败希瓦氏菌CGMCCNo. 6192在处理有机废弃物中的应用。
3.腐败希瓦氏菌CGMCCNo. 6192在畜禽粪便堆肥发酵中的应用。
4.腐败希瓦氏菌CGMCCNo. 6192在制备利用畜禽粪便生产有机肥的促腐剂中的应用。
5.一种腐败希瓦氏菌CGMCC No. 6192微生物菌剂，其特征在于腐败希瓦氏菌CGMCCNo. 6192活菌数量达到IO8以上。
全文摘要
本发明公开了一株腐败希瓦氏菌(shewanella putrefaciens)CR7，该菌株的保藏编号是CGMCC No.6192。该菌株分离自长期处于低温环境的牛粪堆肥中，该菌株制成的菌剂能在冬季牛粪等畜禽粪便堆肥中应用，有快速启动堆肥发酵，提高堆肥发酵温度，缩短堆肥的发酵周期，减少氮元素损失的作用。该菌株制成的菌剂应用于冬季有机肥的生产，减少有机肥堆肥前期需要加温的环节，缩短有机肥生产周期，提高产量和减少生产成本。
文档编号C05F17/00GK102925383SQ20121038349
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者陈双林, 张磊, 闫淑珍 申请人:南京师范大学