一种鲍鱼希瓦氏菌及其用途以及饲料及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种鲍鱼希瓦氏菌，该鲍鱼希瓦氏菌的保藏号为CGMCCNo.9138。本发明还公开了一种饲料，该饲料含有所述鲍鱼希瓦氏菌和基础营养物质。本发明还公开了所述的鲍鱼希瓦氏菌和/或所述饲料在对虾培养中的用途。此外，本发明还公开了所述鲍鱼希瓦氏菌在制备对虾饲料中的用途。本发明的鲍鱼希瓦氏菌能够分泌淀粉酶，显著提高对虾的生长性能，缩短养殖周期，安全不会对对虾产生不良作用。而且，将本发明的鲍鱼希瓦氏菌添加到对虾饲料中喂养对虾能明显地增强对虾的免疫力。
【专利说明】一种鲍鱼希瓦氏菌及其用途以及饲料及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域,具体地,涉及一种鲍鱼希瓦氏菌(Shewanella haliotis)及其用途以及含有该鲍鱼希瓦氏菌的饲料及其用途。
【背景技术】
[0002]南美白对奸(Penaeus vannamei Boone),学名凡纳对奸，属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对虫下科(Penaeidae)、对奸属(Penaeus),是广温广盐性热带奸类。随着对奸养殖业的发展和集约化程度的提高，各种病害频繁发生，严重制约对虾养殖业的发展。大量抗生素和化学药物的滥用不仅使动物本身的免疫力下降，肠道正常菌群遭到破坏，而且造成生态环境的污染。近些年，备受关注的生态养殖无疑成为突破海水养殖的关键方式，其中益生菌开发成为生态养殖中的重要手段。目前，有关益生菌的基础研究比较薄弱，尤其缺乏系统性的深层次研究。因此，对水产动物肠道微生物多样性和可定植菌群的研究是益生菌开发和应用的首要条件。
[0003]传统的病害防治手段主要是使用抗生素及化学药物，不仅会破坏动物机体正常的菌群平衡，导致动物机体免疫功能下降，而且会导致动物体内耐药菌株的增加，进一步加大病害防治的难度。由于缺乏明确的使用准则，长期以来，抗生素及化学药物的滥用，对生态环境和人类健康构成了很大的威胁，药物残留带来的食品安全问题也层出不穷。在保障食品安全、追求绿色生态养殖呼声越来越高的今天，益生菌作为一种高效安全的病害防治手段受到越来越多的关注。益生菌在抑制病原菌、调节肠道菌群平衡、帮助消化和增强机体免疫力、改良水质等方面发挥着显著作用。同抗生素和化学药物相比，益生菌取材于动物体内或其养殖环境，具有高效安全、天然无污染等优点。
[0004]目前在国内水产养殖中应用的益生菌主要有光合细菌，拮抗菌，营养和产消化酶微生物群(乳酸菌、酵母菌等)，改善水质菌群(硝化细菌、反硝化菌等)。这些细菌大多源自陆生动物或借鉴陆生动物思路研制，应用于水产中存在难以在养殖环境中存活及在动物体内难以定植的不足，其功效难以发挥。益生菌的筛选原则在国际上已经被广泛接受:必须对宿主无害；能够在宿主体内定植并繁殖；能够到达需要其发挥功能的部位；在体外和体内的实际效果要一致；不含有致病基因及耐药基因。益生菌种的内源和外源是影响益生菌效果的重要因素，从生物体内或其生存的天然环境中筛选益生菌是最好同时也是最有效的途径，Gate认为健康动物中正常的优势菌或次优势菌可以作为益生菌的来源。优势菌群具有可以定植并对宿主及环境无害的优点，极具开发为高效可定植益生菌的潜力。而长期以来，水产动物专业益生菌的筛选研究多集中于肠道菌群鉴定及一些已知的常见益生菌(乳酸菌、芽孢杆菌等)的筛选，筛选具有优异性能的益生菌添加到对虾饲料中从而促进对虾的健康生长具有重大的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够促进对虾健康生长的鲍鱼希瓦氏菌及其用途以及含有该鲍鱼希瓦氏菌的饲料及其用途。
[0006]为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的筛选实验，结果筛选到一株性能较佳的鲍鱼希瓦氏菌，因此，第一方面，本发明提供了一种鲍鱼希瓦氏菌，该鲍鱼希瓦氏菌的保藏号为CGMCC N0.9138。
[0007]第二方面，本发明提供了一种饲料，该饲料含有第一方面所述的鲍鱼希瓦氏菌和基础营养物质。
[0008]第三方面，本发明提供了第一方面所述的鲍鱼希瓦氏菌和/或第二方面所述的饲料在对虾培养中的用途。
[0009]第四方面，本发明提供了第一方面所述的鲍鱼希瓦氏菌在制备对虾饲料中的用途。
[0010]本发明的鲍鱼希瓦氏菌能够分泌淀粉酶，能够改善对虾的消化吸收能力，显著提高对虾的生长性能，缩短养殖周期，安全不会对对虾产生不良作用。而且，将本发明的鲍鱼希瓦氏菌添加到对虾饲料中喂养对虾能明显地增强对虾的免疫力。
[0011]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0012]生物保藏
[0013]本发明的鲍鱼希瓦氏菌于2014年5月9日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)，保藏编号为CGMCC N0.9138。
【具体实施方式】
[0014]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0015]本发明提供的鲍鱼希瓦氏菌的保藏号为CGMCC N0.9138。将本发明的鲍鱼希瓦氏菌在2216E培养基上培养，其培养特征如下表1所示。
[0016]表1
[0017]
ME [H[S I边缘I透明度~I光滑度~I直径(Mn)~I革兰氏染色 红棕色面凸起状全缘透明光滑湿润?~
[0018]本发明提供的饲料含有上述鲍鱼希瓦氏菌和基础营养物质。
[0019]根据本发明，对鲍鱼希瓦氏菌的在饲料中的含量没有特别的要求，优选情况下，以鲍鱼希瓦氏菌的活菌体计，所述鲍鱼希瓦氏菌在饲料中的含量为106-108cfu/g。“cfu”为菌落形成单位，可以通过平板菌落计数法测得。
[0020]根据本发明，所述基础营养物质可以为常规的用于水产养殖(特别是对虾养殖)的营养物质，包括蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质等。基础营养物质的含量可以根据对虾的营养需求进行适当的选择，优选情况下，以所述饲料的总重量为基准，蛋白质的含量为20-55重量％、脂类的含量为15-20重量％、碳水化合物的含量为20-35重量％、维生素的含量为1-1.5重量％且矿物质的含量为0.2-3重量％。基础营养物质可以由常规的用于配制水产动物饲料的原料提供，例如，所述基础营养物质可以由动物性饲料原料(如鱼粉、肝脏粉、虾粉、虾壳粉、蟹粉、蟹壳粉、鸡肉粉、血粉、蚕蛹等)，植物性饲料原料(如豆柏、花生柏、面粉、棉柏、菜柏、单细胞蛋白(酵母)、酒糟柏、玉米蛋白粉等)，油脂原料(如鱼油、磷脂油、豆油、乌贼膏、玉米油、棕榈油、亚麻籽油等)，维生素(如V。和Ve等)等配合提供，例如，由“鱼粉、大豆粉、花生柏、酵母、大豆卵磷脂、虾壳粉、小麦粉、种子脂肪、乳酸钙和磷酸二氢钙”的混合物提供，采用何种配比进行混合得到所述混合物是本领域技术人员能够很容易确定的，在此不再赘述。
[0021]—般地，所述饲料含有一定量的水，例如，饲料中水分含量一般为8-12%重量。此外，为了进一步提高对虾的品质并促进培养，所述饲料中还可以含有添加剂，如诱食剂、免疫增强剂、生长促进剂、 耐高温酶制剂、抗氧化剂等。添加剂的含量通常为5-10重量％。
[0022]本发明还提供了上述鲍鱼希瓦氏菌和/或饲料在对虾培养中的用途。
[0023]此外，本发明还提供了上述鲍鱼希瓦氏菌在制备对虾饲料中的用途。
[0024]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0025]实施例1
[0026]本实施例用来说明本发明的鲍鱼希瓦氏菌的产酶能力。
[0027]将本发明的鲍鱼希瓦氏菌点种于淀粉酶选择培养基上，28°C培养48h。若菌落周围产生透明环，说明菌株具有相应产酶活力，测量并记录菌落周围透明环与菌落直径比值。相关培养基配方如下:
[0028]淀粉酶选择培养基:可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母膏lg，琼脂16g，人工海水1000mL ;调 pH 至 7.4，121.5°C灭菌 20min 备用。
[0029]测得产酶水解圈与菌落直径比(Η/D)为3.00，说明本发明的鲍鱼希瓦氏菌能分泌淀粉酶，从而具有一定的促进消化吸收的能力，能够提高对虾养殖过程中饲料的利用率，促进对奸的健康生长。
[0030]实施例2
[0031]本实施例用来说明本发明的鲍鱼希瓦氏菌的安全性。
[0032](I)溶血性试验
[0033]将无菌的山羊血平板复温至25°C，再将活化的鲍鱼希瓦氏菌接种于山羊血平板上，25°C恒温培养箱中培养48h后，观察发现菌落周围并未出现溶血环，表明该细菌无溶血能力。
[0034](2)饲料饲喂
[0035]饲料的营养成分为:38重量％的鱼粉、19重量％的大豆粉、6重量％的花生柏、4重量％的酵母、5重量％的大豆卵磷脂、10重量％的奸壳粉、10.5重量％的小麦粉、1.5重量％的种子脂肪、0.4重量％的乳酸钙、2.6重量％的磷酸二氢钙、3重量％的预混合组分(具体成分为:每千克饲料含有肌醇:3000.0mg ;烟酰胺:2000.0mg ;生物素:20.0mg ;胆碱:4% ;泛酸钙:1200.0mg ;叶酸:150.0mg ;维生素 A:300000IU ;维生素 D: 150000IU ;维生素 E:5000.0mg ;维生素 K3:150.0mg ;维生素 B:200.0mg ;维生素 B2:200.0mg ;维生素 B6:200.0mg ;维生素 C:6000.0mg ；Cu:220mg ；Fe:8000mg ；Zn:400 ；Mn: 1200mg ；Mg: 12000mg ；Se:20mg ；I:25mg；Co:5000mg)。
[0036]选用健康南美白对虾的仔虾(购自海南南疆板桥养殖厂)进行细菌安全性实验，试验用虾暂养三天。选用大小一致，容积约为50L的泡沫箱6个，各桶盛无菌海水32L，并准确计数南美白对虾100尾放入泡沫箱，暂养一天后随机分为2组，I个处理组和I个对照组，每组三个重复。处理组加入含有本发明的鲍鱼希瓦氏菌(浓度为107cfu/g)的饲料。人工投喂至饱食状态，每天投喂4次，投喂时间:早上6:00，中午10:00，傍晚17:00，晚上22:00。对照组使用的饲料不含本发明的鲍鱼希瓦氏菌，其它步骤一致，实验持续七天，实验期间连续充气。试验组和对照组的对虾均未出现大量死亡且无显著差异，解剖试验组也没有病理现象。
[0037]本实施例的结果说明本发明的鲍鱼希瓦氏菌对对虾没有毒性，可安全使用。
[0038]实施例3
[0039]本实施例用来说明本发明的鲍鱼希瓦氏菌对对虾免疫机能的影响。
[0040]统一规格的南美白对虾(购自海南南疆板桥养殖厂)生长于底为3mX3m，水位高为0.7m的养殖池中，海水直接从海洋中抽取，经过沙滤后调整水温至15-18°C后为培养所用海水，持续曝气。试验用南美白对虾暂养3天后分组，试验分为2组，处理组和对照组。处理组投喂含本发明的鲍鱼希瓦氏菌的饲料(其他成分与实施例2中相同)，对照组饲喂不添加本发明的鲍鱼希瓦氏菌的饲料。养殖过程中水温保持在16.8-18°C，盐度20-23，PH7.5-7.9，溶解氧不低于7.5mg/L ;人工投喂至饱食状态，每天投喂4次，投喂时间:早上6:00，中午10:00，傍晚17:00，晚上22:00。每两天换水一次以维持水质，饲养期为28天。分别在每周末早7点，即第7、14、21、28天。从免疫指标测定实验各组的每个重复中随机选取5-10只南美白对虾，用一次性无菌注射器从南美白对虾腹血窦中取血，每次取血1.5mL。将血淋巴置于冰浴中混合均匀后，从血淋巴混合液中吸取ImL置于1.5mL的Eppendorf管中立即用于血细胞计数、吞噬活力和呼吸爆发检测。余下的血淋巴用低温超速离心机4°C下3000g离心10min得到血清。保存于_20°C用于检测其它免疫指标；取血后的南美白对虾在无菌条件下解剖获得肠道用于肠道菌群分析。所有指标在取血后I天内测完。各个指标的测定方法和结果如下所示:
[0041](I)氧呼吸爆发活力:呼吸爆发活力测定采取NBT还原法。首先，用RPMI1640培养基将血淋巴稀释至IX IO5CelVmL的浓度；将0.5mL稀释的血淋巴、0.5mL NBTUl μ L佛波醇-12-肉豆蘧酯-13-乙酯(PMA)、89 μ L培养基一起加入无菌的1.5mL离心管中；25°C放置Ih后，540g低温离心10min后倾去上清。加入lmL70%甲醇终止反应后,使反应生成的月甲替(NBT氧化产物)溶解于600 μ L2M KOH和700 μ L DMSO中，并于630nm波长下测定OD值。
[0042](2)血清溶菌酶活性:血清溶菌酶活性的测定。该指标测量采用南京建成生物工程研究所生产的溶菌酶检测试剂盒进行，操作过程按照试剂盒的使用说明进行。
[0043](3)酸性磷酸酶:酸性磷酸酶(ACP)活性的测定。该指标测量采用南京建成生物工程研究所生产的酸性磷酸酶检测试剂盒进行，操作过程按照试剂盒的使用说明进行。
[0044](4)血清超氧化物歧化酶(SOD):血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定。该指标测量采用南京建成生物工程研究所生产的SOD检测试剂盒进行，操作过程按照试剂盒的使用说明进行。
[0045](5 )免疫相关基因(酚氧化酶原、脂多糖结合蛋白和抗菌肽基因)测定:用TRIZOL法对保存于-80°C中的血细胞进行总RNA的提取，将纯度检测合格的RNA样品进行反转录合成cDNA，将反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测，实时定量PCR数据结果采用2-Δ ACt方法计算目的基因的相对表达量。
[0046]试验数据采用SPSS18.0中的单因素方差分析(ONE-WAY ANV0A)进行统计分析，均值采用Tukey法进行多重比较，试验结果见表2。
[0047]表2
[0048]
【权利要求】
1.一种鲍鱼希瓦氏菌(Shewanella haliotis),该鲍鱼希瓦氏菌的保藏号为CGMCCN0.9138。
2.一种饲料，其特征在于，该饲料含有权利要求1所述的鲍鱼希瓦氏菌和基础营养物质。
3.根据权利要求2所述的饲料，其中，以鲍鱼希瓦氏菌的活菌体计，所述鲍鱼希瓦氏菌在饲料中的含量为106-108cfu/g。
4.根据权利要求2或3所述的饲料，其中，所述基础营养物质包括蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质；以所述饲料的总重量为基准，蛋白质的含量为20-55重量％、脂类的含量为15-20重量％、碳水化合物的含量为20-35重量％、维生素的含量为1-1.5重量％且矿物质的含量为0.2-3重量％。
5.权利要求1所述的鲍鱼希瓦氏菌和/或权利要求2-4中任意一项所述的饲料在对虾培养中的用途。
6.权利要求1所述的鲍鱼希瓦氏菌在制备对虾饲料中的用途。
【文档编号】A23K1/16GK103966137SQ201410203709
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】夏磊, 张洪玉, 赵明军, 唐夏, 杨仲明, 王高学, 郝凯 申请人:北京鑫洋水产高新技术有限公司, 中国水产科学研究院