专利名称：一种提高益生菌清除微囊藻毒素效率的方法
技术领域：
—种提高益生菌清除微囊藻毒素效率的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术：
微囊藻毒素(Microcystins， MCs)是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥 藻、念珠藻等蓝藻产生的一种环状七肽物质。微囊藻毒素以动物肝脏为作用靶器官，能够特 异性地抑制蛋白磷酸酶活性从而诱发癌症等一系列病变。流行病学调查显示，饮用水中的 微囊藻毒素的污染和人群中原发性肝癌的发病率有很大的相关性。 目前微囊藻毒素的清除方法主要有化学氧化清除、物理吸附法以及生物法，生物 法清除藻毒素利用的微生物主要集中于鞘氨醇单胞菌、铜绿假单胞菌以及食酸戴尔福特 菌，但是上述菌种均不适合应用于清除食品体系中的微囊藻毒素。 益生菌是人类肠道中重要的生理菌，具有抗肿瘤、缓解乳糖不耐症、增强免疫力、 降低胆固醇、调整肠道菌群等生理作用，本研究室将益生菌用于清除食品体系中的藻毒素 取得了不错的效果，但是与其它菌种相比，益生菌对微囊藻毒素的清除效率还较低，迫切需 要提高益生菌清除微囊藻毒素的效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高益生菌清除微囊藻毒素效率的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出如下技术方案 本发明采用益生菌作为生物催化剂，通过液体深层发酵制备富含益生菌的发酵液 或将发酵液精制得到菌泥，将所得益生菌发酵液或菌泥投入水体中，投入葡萄糖作为佐剂， 37°C 、 150rpm振荡培养24_30h。所述方法中，益生菌为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius ATCC 29602)或 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum ATCC 9338)。
所述方法中，益生菌的培养方法为 培养采用MRS培养基，MRS培养基组成为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g， K2HP04 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温801mL， MgS04 7H20 0. 58g， MnS04 4H20 0. 25g，蒸馏水lOOOmL ; 培养条件如下从生长良好的平板上取2-3环益生菌移入盛有0. 5ml无菌甘油
(甘油浓度为15%-20%)的小离心管中，盖上盖后用封口膜密封管口，放-8(TC冰箱保存。
将甘油管保藏的益生菌接入MRS液体培养基，在37t:静置培养20h至对数中后期。 所述方法中，菌泥的精制方法如下取对数生长期中后期的益生菌发酵液，4t:、
3200rpm离心10min收集菌泥，菌泥经过磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)洗涤离心2次，收集菌体。 所述方法中，葡萄糖的投入时间为葡萄糖与益生菌同步投入水体中。 所述方法中，益生菌计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂
布，计算菌落数。
所述方法中，微囊藻毒素的检测采用高效液相的方法色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB—C18 (4. 6 X 150mm， 5. 0 ii m) 流动相乙腈H20(0. 05% TFA) = 40 : 60 (v/v)进样量:20 ill ;流速:lmL/min ;柱温40。C检测器DAD 238nm ;MC-LR保留时间3. 48min 本发明采用添加葡萄糖的方法提高了益生菌清除微囊藻毒素的效率，提高了益生 菌在食品领域中的应用效果，解决了食品中残留微囊藻毒素对健康危害的问题。采用本发 明处理得到的产品，具有营养成分丰富、微囊藻毒素含量低等优点，特别适合用于清除水产 品中的微囊藻毒素。
具体实施例方式
实施例1 唾液乳杆菌的发酵生产 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius ATCC 29602)采用MRS培养基蛋白胨 10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，iyiP04 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 lmL， MgS04 7H20 0. 58g， MnS04 4H20 0. 25g，蒸馏水lOOOmL。 唾液乳杆菌的培养方法如下从生长良好的平板上取2-3环唾液乳杆菌移入盛有 0.5ml无菌甘油(甘油浓度为15% -20% )的小离心管中，盖上盖后用封口膜密封管口， 放-2(TC冰箱保存。将甘油管保藏的唾液乳杆菌接入MRS液体培养基，在37t:静置培养20h 至对数中后期。 唾液乳杆菌菌泥的精制 取对数生长期中后期的唾液乳杆菌发酵液，4t:、3200rpm离心10min收集菌泥，菌 泥经过磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，得到唾液乳杆菌菌泥。
葡萄糖提高唾液乳杆菌清除藻毒素效率的方法 唾液乳杆菌的计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂布，计算 菌落数。 将109CFU/mL的发酵乳杆菌投入含有150 y g/L的微囊藻毒素的水体中(pH 7. 0)，
添加10% (w/v)的葡萄糖，37t:、150rpm振荡放置30h，微囊藻毒素清除率100X。 实施例2 唾液乳杆菌的发酵生产 同实施例1 唾液乳杆菌菌泥的精制 同实施例1 葡萄糖提高唾液乳杆菌清除藻毒素效率的方法 唾液乳杆菌的计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂布，计算 菌落数。 将10，FU/mL的发酵乳杆菌投入含有1800 y g/L的微囊藻毒素的水体中(pH 7.0)，添加10% (w/v)的葡萄糖，37t:、150rpm振荡培养24h，微囊藻毒素清除率84.8X。
实施例3
发酵乳杆菌的发酵生产 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum ATCC 9338)采用MRS培养基蛋白胨 10g，牛肉膏10g，酵母粉5g， K2HP04 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温801mL， MgS04 7H20 0. 58g， MnS04 4H20 0. 25g，蒸馏水lOOOrnL。 发酵乳杆菌的培养方法如下从生长良好的平板上取2-3环发酵乳杆菌移入盛有 0.5ml无菌甘油(甘油浓度为15% -20% )的小离心管中，盖上盖后用封口膜密封管口， 放-2(TC冰箱保存。将甘油管保藏的发酵乳杆菌接入MRS液体培养基，在37t:静置培养20h 至对数中后期。 发酵乳杆菌菌泥的精制 取对数生长期中后期的发酵乳杆菌发酵液，4t:、3200rpm离心10min收集菌泥，菌 泥经过磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，得到发酵乳杆菌菌泥。
葡萄糖提高发酵乳杆菌清除藻毒素效率的方法 发酵乳杆菌的计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂布，计算 菌落数。 将109CFU/mL的发酵乳杆菌投入含有150 y g/L的微囊藻毒素的水体中(pH 7. 0)，
添加10% (w/v)的葡萄糖，37t:、150rpm振荡放置30h，微囊藻毒素清除率100X。 实施例4 发酵乳杆菌的发酵生产 同实施例3 发酵乳杆菌菌泥的精制 同实施例3 葡萄糖提高发酵乳杆菌清除藻毒素效率的方法 发酵乳杆菌的计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂布，计算 菌落数。 将10，FU/mL的发酵乳杆菌投入含有1800 y g/L的微囊藻毒素的水体中(pH
7.0)，添加10% (w/v)的葡萄糖，37t:、150rpm振荡放置24h，微囊藻毒素清除率79.9X。 对比实施例1 唾液乳杆菌的发酵生产 同实施例1 唾液乳杆菌菌泥的精制 同实施例1 唾液乳杆菌菌泥的应用 唾液乳杆菌的计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂布，计算 菌落数。 将109CFU/mL的唾液乳杆菌投入含有150 y g/L的微囊藻毒素的水体中(pH 7. 0)，
37 °C 、 150rpm振荡放置30h，微囊藻毒素清除率41 % 。 对比实施例2 发酵乳杆菌的发酵生产 同实施例3
发酵乳杆菌菌泥的精制 同实施例3 发酵乳杆菌菌泥的应用 发酵乳杆菌的计数采用活菌计数法，将菌悬液稀释一定倍数，在平板上涂布，计算 菌落数。 将109CFU/mL的发酵乳杆菌投入含有150 y g/L的微囊藻毒素的水中(pH 7. 0)， 37 °C 、 150rpm振荡放置30h，微囊藻毒素清除率41 % 。 可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发 明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保 护范围。
权利要求
一种提高微囊藻毒素清除效率的方法，其特征在于，采用益生菌作为生物催化剂，通过液体深层发酵制备富含益生菌的发酵液或将发酵液精制得到菌泥，将所得益生菌发酵液或菌泥投入水体中，投入葡萄糖作为佐剂，37℃、150rpm振荡培养24-30h。
2. 根据权利要求1所述的益生菌，其特征在于，采用商品化的唾液乳杆菌 (Lactobacillussalivarius ATCC 29602)或发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum ATCC 9338)作为出发菌株。
3. 根据权利要求l所述的菌泥，其特征在于，精制方法为取对数生长期中后期的益生 菌发酵液，室温下3200rpm离心10min收集菌泥，菌泥经过磷酸盐缓冲液(pH 7. 0)洗涤离 心2次，收集菌体。
4. 根据权利要求1或2所述的益生菌发酵方法，其特征在于，益生菌培养方法如下1) 益生菌发酵所用培养基组成为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g， 1(2昍0428，柠檬 酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温801mL， MgS04. 7H20 0. 58g， MnS044H20 0. 25g，蒸馏水 lOOOmL ;2) 益生菌培养条件如下从生长良好的平板上取2-3环益生菌移入盛有0. 5ml无菌甘 油(甘油浓度为15% -20% )的小离心管中，盖上盖后用封口膜密封管口，放-2(TC冰箱保 存。将甘油管保藏的益生菌接入MRS液体培养基，在37t:静置培养20h至对数中后期。
5. 根据权利要求1所述的葡萄糖投入方法，其特征在于，葡萄糖与益生菌同步投入水 体中。
全文摘要
一种提高益生菌清除微囊藻毒素效率的方法，属于食品生物技术领域。本发明采用益生菌作为生物催化剂，通过液体深层发酵制备富含益生菌的发酵液或将发酵液精制得到菌泥，将所得益生菌发酵液或菌泥投入水体中，同时投入葡萄糖作为外源添加物，37℃、150rpm振荡培养24-30h，益生菌对微囊藻毒素的清除效率明显提高。由于葡萄糖和益生菌对人畜安全无害并有益生功效，本发明可广泛应用于食品领域，得到营养成分丰富、健康安全的产品。
文档编号C12N1/20GK101715908SQ20091025061
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者堵国成, 张娟, 张茜, 毕洁, 王松, 王淼, 陈坚 申请人:江南大学