专利名称：一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白及其编码基因和伴孢晶体蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一个具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白及其编码基因和伴孢晶体蛋白的
制备方法。
背景技术：
肝癌是目前对人类健康威胁三大疾病之一，现行肝癌治疗药物以阿霉素和氟尿嘧 啶等最为常用，但这些药物对晚期肝癌治疗有效率低，且无明显延命效果，因此，目前肝癌 治疗药物远未满足临床需求。为此，各大制药公司竞相从天然存在的自然资源(植物、微生 物、海洋生物、昆虫、矿物等)中开发高效低毒的肝癌治疗药物。统计表明抗肿瘤药物市场 规模2003年较1999年翻了一番，达到70亿元人民币，每年用药金额增长速度超过25% ，其 中2001年的增长速度高于50%，可见其市场潜力巨大。 国际统计表明，我国迄今仍属肝癌高发区域。近几年，我国研究结果也认为，由于 我国幅员广阔，各地生活环境及习惯均有差异，肝癌发病率又与甚为流行的乙型和丙型肝 炎病毒感染密切相关，而现有治疗手段却极有限，迄今尚无正式获准有效治疗药物，加之某 些区域尚有嗜好烈酒风俗，有些地区饮食(霉变谷物中含有强力肝癌致病物质黄曲毒霉 素)和饮水不太卫生，所以预期国内肝癌发病率有上升趋向。据我国有关统计报告表明，我 国肝癌发病率较西方国家高10倍以上。 天然药物是以现代科学理论为基础，以天然存在的自然资源(植物、微生物、海洋 生物、昆虫、矿物等)为原料，应用现代生物技术获得其有效结构和活性成分物质并研制开 发为人类有益的产品。天然药物在制药工业中占有重要的地位，由天然物质制成的药品已 占30%，为全世界医药总销售额的35%左右，2000年约1100亿美元。世界各国各大制药公 司都投入巨资研究天然药物，以生物资源为基础的天然药物将成为未来全球制药业实现繁 荣的直接动因。 相对于化学合成的药物来说，来源于天然的具有抗肿瘤活性的化合物，具有许多 不可替代的优越性，但也有大量的不确定性。首先，尽管其抗肿瘤活性较强，往往在生物体 内含量甚微，使得提取制备的成本很高，所以制约了其在临床上的应用；其次，有一些活性 成分的抗肿瘤活性较高，在生物体内含量也不低，但因其毒性和副作用较大，同样制约了其 在临床上的应用。 芽孢杆菌属的一些成员，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis， Bt)、 球形芽孢杆菌(B. sphaericus)、日本甲虫芽孢杆菌(B. popilliae)、缓病芽孢杆菌 (Paenibacillus lentimorbus)、以及厌氧的双酶梭菌(Clostridium bifermentans)在芽 孢形成的同时产生蛋白质结晶内含物，称为伴孢晶体蛋白。1999年，日本学者Mizuki等首 先发现苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)菌株A1190所含的81kDa大小的伴孢晶 体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞(人白血病T细胞M0LT-4、人子宫颈癌 细胞)具有杀伤力，而且不表现溶血作用。苏云金杆菌伴孢晶体蛋白有望被开发成为一类新型广谱高效低毒的抗癌药物。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白及其编码基因和伴 孢晶体蛋白的制备方法。本发明制备的蛋白能识别肝癌细胞并将其杀死，效果显著；对正常 肝细胞安全性高；蛋白表达条件简单，易于纯化，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是 —种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列的蛋白或 其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一种。 —种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的编码基因，它具有序列表2所示的核苷酸序 列。 —种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，采用序列表2所示核苷酸序列的 编码基因融合表达之后经亲和层析的方法进行分离制备具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白。
所述的利用编码基因融合表达之后经亲和层析的方法进行分离制备具有抗癌活 性的伴孢晶体蛋白的方法采用序列表2所示的编码基因插入到高效表达载体pET-21b，用 热击法转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中(BL21(DE3)pLysS感受态细胞，为商业化菌株， 可直接从公司购买，购买厂商为上海超研生物科技有限公司或上海沪峰生物科技有限公 司)。其基因型F_omp T hsd SB (rB_mB_) dcm gal (DE3) pLysS Cam r，特点该菌株带有质 粒pLysS，具有氯霉素抗性。该质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因 的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。该菌适合毒性蛋白和非毒性蛋白的表达)，经 过质粒酶切分析、PCR鉴定，筛选出阳性转化子，阳性转化子经异丙基_ 13 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导使编码基因获得高效表达，用Ni-Agarose柱(镍柱)对表达的蛋白进行纯化。
所述的高效表达为低温诱导表达，包括如下步骤l)提取质粒，转化BL21(DE3)， 挑取转化子即单克隆，于5mlLB培养基中，LB培养基配方如下胰蛋白胨(Tryptone) 10g/ L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 10g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使 其达到7. 4 ;然后在37。C，230rpm，活化12-14h ;2)按1% _2%接种量转接于100ml LB中。 中，37。C，230rpm，培养至光密度0D600 = 0. 5-0. 8，需2-3h ;3)加入终溶度为0. 5mM的异丙 基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG) ， 18°C ， 150rpm，培养10-12h。
所述的LB培养基中含有终溶度100 ii g/ml的Amp (氨苄青霉素)。
所述的纯化采用镍柱分离纯化蛋白，包括如下步骤1) 8000rpm，离心2min，于 50ml无菌离心管中收集菌体；2)收集细胞后，将细胞重悬于Binding Buffer中，裂解细 胞；3)将Ni-NTA-Agarose灌柱，依次使用3倍柱体积的去离子水和8倍柱体积的Binding Buffer(结合缓冲液)平衡；4)将细胞裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时； 5)使用4倍柱体积的Washing Buffer (洗涤缓冲液)冲洗柱子；6)使用2倍柱体积的 ElutionBuffer(洗脱缓冲液)洗脱；7)收集洗脱液，透析后冻干保存。
所述的Binding Buffer溶液由20mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲 液)，5mM imidazole (咪唑)和0. 5M NaCl组成的混合溶液。 所述的Washing Buffer溶液由20mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲 液)，60mM imidazole (咪唑)，0. 5M NaCl组成的混合溶液。
所述的Elution Buffer溶液由20mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲 液)，500mM imidazole (咪唑)，0. 5M NaCl组成的混合溶液。 本发明的有益效果为本发明的蛋白具有以下特点1)能识别肝癌细胞并将其杀 死，效果显著；2)对正常肝细胞安全性高；3)蛋白表达条件简单，易于纯化，生产成本低廉， 因而适宜进行工业化生产。本发明为抗肝癌提供了一条新途径，在医药学领域具有广阔的 应用前景。
具体实施例方式
本实施例的一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序 列的蛋白或其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一种。以及此种具有抗癌活 性的伴孢晶体蛋白的编码基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列。本实施例还提供了一 种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，本方法采用序列表2所示核苷酸序列的编码 基因融合表达之后经亲和层析的方法进行分离制备具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白。本实 施例采用序列表2所示的编码基因插入到高效表达载体pET-21b，用热击法转化到大肠杆 菌BL21(DE3)菌株中，(BL21(DE3)pLysS感受态细胞，为商业化菌株，可直接从公司购买，
购买厂商为上海超研生物科技有限公司或上海沪峰生物科技有限公司)。经过质粒酶切分 析、PCR鉴定，筛选出阳性转化子，阳性转化子经IPTG诱导使编码基因获得高效表达高效 表达为低温诱导表达，包括如下步骤1)提取质粒，转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(简 称BL21)，挑取转化子即单克隆，于5ml含有终溶度100ii g/ml的Amp， 37°C ， 230rpm，活化 12-14h ;2)按1% _2%接种量转接于100ml LB培养基中(含有终溶度100 y g/ml的Amp)， 37°C ， 230rpm，培养至光密度0D600 = 0. 5-0. 8，需2_3h ;3)加入终溶度为0. 5mM(mmo1/1)的 IPTG， 18°C ， 150rpm，培养10-12h。 然后用Ni-Agarose柱(镍柱)对表达的蛋白进行纯化采用镍柱分离纯化蛋白， 包括如下步骤l)8000rpm，离心2min，于50ml无菌离心管中收集菌体；2)收集细胞后，将 细胞重悬于Binding Buffer(20mM Tris-HCl，5mM imidazole,0. 5M(mol/l)NaCl)中，裂解 细胞；3)将Ni-NTA-Agarose灌柱，依次使用3倍柱体积的去离子水和8倍柱体积的Binding Buffer平衡；4)将细胞裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时；5)使用4倍柱体积的 Washing Buffer(20mM Tris-HCl，60mM imidazole,0. 5M NaCl)冲洗柱子；6)使用2倍柱体 积的Elution Buffer (20mM Tris-HCl， 500mM imidazole, 0. 5M NaCl)洗脱；7)收集洗脱液，
透析后冻干保存。 附录1 :序列表 〈no〉华侨大学 林毅 〈120〉 一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白及其制备方法与编码基因 〈160>2 〈210>1 〈211>288 〈212>PRT 〈213〉苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 〈400〉具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的氨基酸序列
MetAspVallieArgGluTyrLeuMETPheAsnGluLeuSerAla1611LeuSerSerSerProGluSerValArgSerArgPheSerSerlie162126TyrGlyThrAsnProAspGlylieAlaLeuAsnAsnGluThrTyr313641PheAsnAlaValLysProProlieThrAlaGinTyrGlyTyrTyr465156CysTyrLysAsnValGlyThrValGinTyrValAsnArgProThr616671AsplieAsnProAsnVallieLeuAlaGinAspThrLeuThrAsn768186AsnThrAsnGluProPheThrThrThrlieThrMETThrGlySer9196101PheThrAsnThrSerThrValThrSerSerThrThrThrGlyPhe106111116LysPheThrSerLysLeuSerlieLysLysAlaPheGlulieGly121126131GlyGluValSerPheSerThrThrlieGlyThrSerGluThrThr136141146ThrGluThrlieThrValSerLysSerValThrValThrValPro151156161AlaGinSerArgArgThrlieGinLeuThrAlaLyslieAlaLys166171176GluSerAlaAspPheSerAlaProlieThrValAspGlyTyrPhe181186191GlyAlaAsnPheProLysArgValGlyProGlyGlyHisTyrPhe196201206TrpPheAsnProAlaArgGlyValLeuAsnThrThrSerGlyThr211216221LeuArgGlyThrValThrAsnValSerSerPheAspPheGinThr226231236lieValGinProAlaArgSerLeuLeuAspGluGinGinGluThr241246251LeuGluTyrAlalieProGlyAspProSerGlyGluGinLeuGin256261266GinMETGluGinArgMETPhePheSerLysCysGinCysProLys271276281TrpGlyAsnStop
286 〈210>2 〈211>867 〈212>DNA 〈213〉苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 〈400〉具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白其编码基因的核苷酸序列ATGGATGTGATTCGTGAATATCTGATGTTTAACGAACTGAGCGCGCTGAGCAGCAGCCCG60GAAAGCGTGCGTAGCCGTTTTAGCAGCATTTATGGCACCAACCCGGATGGCATTGCGCTG120AACAACGAAACCTATTTTAACGCGGTGAAACCGCCGATTACCGCGCAGTATGGCTATTAT180TGCTATMAAACGTGGGCACCGTGCAGTATGTGAACCGTCCGACCGATATTAACCCGAAC240GTGATTCTGGCGCAGGATACCCTGACCAACAACACCAACGAACCGTTTACCACCACCATT300ACCATGACCGGCAGCTTTACCAACACCAGCACCGTGACCAGCAGCACCACCACCGGCTTT360AMTTTACCAGCAAACTGAGCATTAMAAAGCGTTTGAAATTGGCGGCGAAGTGAGCTTT420AGCACCACCATTGGCACCAGCGAAACCACCACCGMACCATTACCGTGAGCAAMGCGTG480ACCGTGACCGTGCCGGCGCAGAGCCGTCGTACCATTCAGCTGACCGCGAAAATTGCGAAA540GMAGCGCGGATTTTAGCGCGCCGATTACCGTGGATGGCTATTTTGGCGCGAACTTTCCG600AMCGTGTGGGCCCGGGCGGCCATTATTTTTGGTTTAACCCGGCGCGTGGCGTGCTGAAC660ACCACCAGCGGCACCCTGCGTGGCACCGTGACCAACGTGAGCAGCTTTGATTTTCAGACC720ATTGTGCAGCCGGCGCGTAGCCTGCTGGATGAACAGCAGGAAACCCTGGAATATGCGATT780CCGGGCGATCCGAGCGGCGAACAGCTGCAGCAGATGGAACAGCGTATGTTTTTTAGCAAA840TGCCAGTGCCCGAAATGGGGCAACTAG86权利要求
一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白，其特征在于它具有序列表1所示的氨基酸序列的蛋白或其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一种。
2. —种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的编码基因，其特征在于它具有序列表2所示 的核苷酸序列。
3. —种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于采用序列表2所示核 苷酸序列的编码基因融合表达之后经亲和层析的方法进行分离制备具有抗癌活性的伴孢 晶体蛋白。
4. 根据权利要求3所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所 述的利用编码基因融合表达之后经亲和层析的方法进行分离制备具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的方法采用序列表2所示的编码基因插入到高效表达载体pET-21b，用热击法转化 到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，经过质粒酶切分析、PCR鉴定，筛选出阳性转化子，阳性转化 子经异丙基_ P -D-硫代半乳糖苷诱导使编码基因获得高效表达，用Ni-NTA-Agarose柱对 表达的蛋白进行纯化。
5. 根据权利要求4所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所述 的高效表达为低温诱导表达，包括如下步骤1)提取质粒，转化BL21(DE 3)菌株，挑取转化 子即单克隆，于5ml LB培养基中，37。C，230rpm，活化12-14h ;2)按1%_2%接种量转接于 100ml LB中，37。C，230rpm，培养至光密度0D600 = 0. 5-0. 8，2_3h ;3)加入终溶度为0. 5mM 的异丙基_ P -D-硫代半乳糖苷，18°C ， 150rpm，培养10-12h。
6. 根据权利要求4所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所述 的LB培养基中含有终溶度100 ii g/ml的Amp。
7. 根据权利要求4所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所述 的纯化采用镍柱分离纯化蛋白，包括如下步骤1)8000rpm，离心2min，于50ml无菌离心管中收集菌体；2)收集细胞后，将细胞重悬于 Binding Buffer中，裂解细胞；3)将Ni-NTA-Agarose灌柱，依次使用3倍柱体积的去离子 水和8倍柱体积的Binding Buffer平衡；4)将细胞裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积 /小时；5)使用4倍柱体积的Washing Buffer冲洗柱子；6)使用2倍柱体积的Elution Buffer洗脱；7)收集洗脱液，透析后冻干保存得到具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白。
8. 根据权利要求7所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所述 的Binding Buffer溶液由20mM Tris -HCl，5mM imidazole和O. 5M NaCl组成的混合溶液。
9. 根据权利要求7所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所述 的Washing Buffer溶液由20mM Tris-HCl， 60mM imidazole, 0. 5M NaCl组成的混合溶液。
10. 根据权利要求7所述的具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，其特征在于所 述的Elution Buffer溶液由20mM Tris-HCl， 500mMimidazole， 0. 5M NaCl组成的混合溶液。
全文摘要
本发明公开一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列的蛋白或其融合蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物中的一种；一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的编码基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列；一种具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白的制备方法，采用序列表2所示核苷酸序列的编码基因融合表达之后经亲和层析的方法进行分离制备具有抗癌活性的伴孢晶体蛋白。本发明制备的蛋白能识别肝癌细胞并将其杀死，效果显著；对正常肝细胞安全性高；蛋白表达条件简单，易于纯化，生产成本低廉，因而适宜进行工业化生产。
文档编号C12N15/32GK101724028SQ200910266679
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者林毅 申请人:华侨大学