专利名称：：检测乙肝感染相关基因str位点的方法、试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法、所用的试剂盒以及在乙肝病毒感染的人群预防和控制、遗传咨询中的应用，属于乙肝病毒易感性的遗传学检测
技术领域：
。
背景技术：
：根据乙肝病毒(HBV)感染和发病特点的研究，乙型肝炎的发生、发展过程与宿主遗传因素相关，并且对乙肝防治的疗效和预后具有一定的影响作用，宿主对HBV感染的遗传易感性在HBV感染发病和疾病进展方面都发挥着重要作用。研究乙型肝炎的宿主遗传易感性具有十分重要的意义，不但能够为我们理解HBV感染种族性差异提供关键线索，也能够为我们以后的抗病毒治疗和疾病的预防提供新的思路。近年来在乙型肝炎的宿主遗传易感性方面的研究中主要关注于一些细胞因子的基因多态性与HBV感染的关系，其中一个重要的细胞因子即是IL-10。人类IL-10基因定位于1号染色体，其基因组包括5个外显子和4个内含子。IL-10整个基因均含有大量的SNP位点，其中以启动子区最多。IL-10基因的启动子区具有高度多态性，含多个单核苷酸多态性位点以及2个微卫星重复序列IL-10.G和IL-IO.R，分别是位于-1193-1151位点的IL-10G微卫星体(含有16个等位基因)和位于-4004-3987位点的IL-10R微卫星体(含有5个等位基因)。IL-10基因2个微卫星重复序列IL-10.G和IL-10.R有研究报道与肾移植排斥反应和系统性红斑狼疮相关，但尚无与HBV感染相关的研究报道。在人类基因组中，STRs是高度多态性标记的丰富来源，可采用PCR反应检测。STRs-PCR(短串联重复序列或微卫星DNA聚合酶链式反应)方法的基本原理是，针对待检测的微卫星(STR)多态性位点设计引物进行PC財广增，由于扩增的重复序列重复次数存在差异，使得扩增产物片段大小不同，STR基因座的等位基因分型也不同，在电泳分离后，荧光检测可区别不同的基因型。
发明内容本发明的目的在于，提供一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法、所用的试剂盒以及在乙肝病毒感染的人群预防和控制、遗传咨询中的应用。本发明人首次将IL-IO.G和IL-IO.R位点多态性与HBV感染联系起来探讨其相关性，首次在贵州少数民族中进行了IL-10基因IL-10.G和IL-IO.R位点多态性与乙肝病毒感染相关的大规模、高通量研究，并且结果显示IL-10.G与HBV感染存在相关性。经过一系列探讨研究之后，本发明采用STRs-PCR方法，通过对IL-10启动子区IL-10.G和IL-IO.R两个STR位点的基因型进行检测，从而可判断个体对乙肝病毒的易感性，确定了IL-10.G、IL-10.R是乙肝病毒感染的新型相关基因，为乙肝病毒感染的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。本发明的技术方案一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，所述方法为STRs-PCR，即短串联重复序列或微卫星DNA聚合酶链式反应，具体包括以下步骤(l)采取血样，红细胞悬液经过酚-氯仿抽提基因组DNA后，用TE缓冲液溶解制备模板DNA;(2)IL-10.G与IL-IO.R两个STR位点的引物设计IL-10.R微卫星PC財广增的引物序列为:5'-CCCTCCAAAATCTATTTGCATAAG-3'、5'-CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC-3';IL-10.G微卫星PC財广增的引物序列为5'-TTCCTCCCAGTTACAGTCT-3'、5'-CACCATCTCCAGCACATA-3';(3)PC財广增体系的组配IOXPCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、上游引物G/R、下游引物G/R、TaqDNA聚合酶、模板DNA和去离子水；(4)混匀反应体系，瞬时离心后上机，进行PCR循环反应；(5)ABI310测序仪自动荧光检测并分析PCR产物向PCR产物中加入去离子甲酰胺进行变性，然后置于ABI310测序仪中进行毛细管电泳及荧光检测，再用GeneScan软件对产物片段进行准确测定，后利用产物片段大小的数值进行基因分型。前述步骤(3)中的PC財广增试剂为10XPCR缓冲液、25mmol/L的MgCl2、2.5mol/L的dNTPs禾口5U/yl的TaqDNA聚合酶。步骤(4)中的PCR循环反应条件为变性温度9396。C、时间30s，退火温度6065。C、时间4050s，延伸温度7075。C、时间60s。优选的PCR循环反应条件为变性温度95。C、时间30s，退火温度6rC、时间45s，延伸温度72。C、时间60s。步骤(4)中模板DNA在变性之前于9395。C预变性35min;终末延伸温度7075r，维持515min。优选为模板DNA在变性之前于94。C预变性5min;终末延伸温度72。C，维持10min。步骤(4)中PCR循环次数为2535;优选的循环次数为30。步骤(5)中PCR产物变性时以Genescan-500TEMRA为内标，置于PCR仪中95。C变性5min步骤(5)中PCR产物进行毛细管电泳及荧光检测时，变性凝胶温度为6(TC，电泳时间28min。一种通过检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型判断个体对乙肝病毒是否易感的方法携带IL-10.G459bp(19CA)、IL-10.G471bp(25CA)、IL-10.G473bp(26CA)的个体对乙肝病毒具有更低的易感性。检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的试剂盒，包括(1)PC財广增试剂:IOXPCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶；(2)DNA变性试剂去离子甲酰胺；(3)ABI310毛细管电泳试剂内标Genescan-500TEMRA、7310P0P4分离胶；(4)荧光引物以上所述的任一方法或试剂盒在乙肝病毒感染的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用本发明所用STRs-PCR(短串联重复序列或微卫星DNA聚合酶链式反应)方法的基本原理及操作是针对待检测的微卫星(STR)多态性位点设计引物进行PC財广增，由于扩增的重复序列重复次数存在差异，使得扩增产物片段大小不同，STR基因座的等位基因分型也不同，在电泳分离后，荧光检测可区别不同的基因型。目前STRs-PCR技术可行多位点检测方法，即可同时进行两个以上STR位点的检测，在进行多个位点的检测时，需要根据不同的STR序列设计不同的引物，在同一反应管中同时进行多个微卫星位点的扩增，引物采用不同颜色荧光染料标记，以区别每个位点的等位基因。本发明即采用STRs-PCR对IL-10启动子区IL-10.G和IL-10.R两个STR位点进行多态性分析。实验中首先针对IL-10启动子区IL-10.G和IL-10.R两个STR位点进行PC財广增，并在正链引物的5'端分别用荧光素标记。在PC財广增后，采用ABI310测序仪进行自动荧光检测，将扩增产物与内标同步进行毛细管电泳，最后用激光检测，GeneScan软件分析产物片段大小，即可对DNA片段进行准确测定，从而区别不同的基因型本发明人通过对贵州威宁彝族、黔西彝族、荔波瑶族、荔波汉族人群IL-IO.R和IL-10.G的检测，发现IL-IO.R有CA11次和12次重复两种基因型，IL-10.G有CA15次、17-26次重复的ll种基因型。将乙肝感染组和非感染组进行对比统计分析，发现IL-10.G(19CA)、(25CA)、(26CA)等位基因频率可能与HBV感染相关感染组的IL-10.G473bp(26CA)等位基因频率较非感染组降低；感染组IL-10.G459bp(19CA)等位基因频率较非感染组显著降低；感染组IL-10.G471bp(25CA)等位基因频率较非感染组降低。以下是本发明人对IL-IO.G与IL-IO.R进行STRs-PCR检测的主要实验结果扩增IL-10.G的引物序列在正链的5'端用荧光素HEX标记，在荧光信号转换为电泳图象时表现为黑色波峰；而扩增IL-IO.R位点的引物用6-FAM进行标记，在荧光信号转换为电泳图象时表现为蓝色波峰；Genescan-500TEMRA内标的荧光信号转换为电泳图象时表现为红色波峰，且每个波峰标示了该处片段大小的确切数值，相当于分子量标准。经毛细管电泳后的产物波峰图象，由GenescanAnalysis3.O软件将该处波峰图象转换为数值，可直接在图象上读出产物片段大小的准确数值。见图l。IL-IO.R的STRs-PCR结果见图2;IL-10.G的STRs-PCR结果见图3。部分IL-10.G与IL-10.R位点等位基因频率与HBV感染的相关分析1.IL-10.R等位基因频率与HBV感染的相关分析贵州威宁彝族、黔西彝族、荔波瑶族、荔波汉族总体IL-IO.R等位基因频率与HBV感染的相关分析IL-10.R.110bp(llCA)、IL-10.R.112bp(12CA)等位基因频率在民族总体感染组与非感染组间分布差异均无统计学意义(P〉0.05)。表1贵州威宁養族、乾西養族、泰波職、泰^KSlIL-10.R^S因频率[人数(tt^J)]与HBV^的相^析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.IL-10.G等位基因频率与HBV感染的相关分析2.l贵州威宁彝族、黔西彝族、荔波瑶族、荔波汉族总体IL-10.G等位基因频率与HBV感染的相关分析IL-10.G.473bp(26CA)等位基因频率在民族总体感染组与非感染组间分布差异有统计学意义(P<0.05):民族总体感染组的473bp(26CA)等位基因频率较非感染组降低。其余各等位基因频率在民族总体感染组与非感染组间分布差异无统计学意义(P〉0.05)。表2贵州威宁彝族、彭西彝族、蕴波瑶族、荒^族总体IL-10.G^t基因頻_率与HBV感染的相^析_^eaa非^s^x'值p值451bp(15CA)10(L5%)6(1.8%)。■l必O-TOO455bp(1TCA)4(0.3%)2(0.3%)0-0003LOOO45Tbp(18CA)25(3.7%)11(3.3%)。■101。■751459bp(19CA)393(58.7%)。■099。■753姐bp(20CA)76(11.3%)34(10.3%)0.2440-621(21CA)7(1、)6(1.8%)L031。■374站5bp(22CA)33(4.9%)14(4-2*)0-2300-6314fi7bp(23CA)71(10.6*)33(10%)。■085。■771469bp(24CA)39(5.8%)17(5.2%)CL187O.細471bp(25CA)11(1.6%)0.0410.839473bp(26CA)1(0.W)4(1.2%)5-021。■0432.2贵州黔西彝族IL-10.G等位基因频率与HBV感染的相关分析IL-10.G459bp(19CA)在黔西鼻族感染组与非感染组中分布差异有统计学意义(P<0.05):感染组IL-10.G459bp(19CA)等位基因频率较非感染组显著降低。其余各等位基因频率在黔西彝族感染组与非感染组间分布差异无统计学意义(P〉0.05)。表3贵州彭西舜族IL-10.G雜基因频率与HBV職的相粉析非^^X，值P值451bp(15CA)2(2.2%)1(0.8%)。■TO5。■578455bp(17CA)0(0%)o(os)45Tbp(18CA)6(6.7*)4(3.3%)1-2600.332459bp(19CA)43(47.8%)77(64.2*)5.641。■01S461bp(20CA)14(15.0%)10(8.3%)。■265。■104(21CA)2(2.2%)1(0.8%)0-TO50.578465bp(22CA)4(3-3%)。■173。■72T467bp(23CA)13(14-")14(11.7%)。■354。■552469!]p(24CA)5(5.6%)8(6.7%)0-1090.7414Tlbp(25CA)1(1.W)0(0%)1.340。■4294T3bp(26CA)0(0%)1(0.8*)L340。■4292.3贵州荔波汉族IL-10.G等位基因频率与HBV感染的相关分析IL-10.G471bp(25CA)在蒸波汉族感染组与非感染组中分布差异有统计学意义(P<0.05):感染组IL-10.G471bp(25CA)等位基因频率较非感染组降低。其余各等位基因频率在荔波汉族感染组与非感染组间分布差异无统计学意义(P〉0.05)。表4贵州泰波鄉IL-10.G報基因频率与HBV鹏的相效析x，但P值451bp(15CA)1(0.9%)0(0%)LOOO455bp(17CA)3(1.9%)0(0%)。■5661-000457bp(18CA)5(2.5%)3(7.9%)2-970。■114459bp(19CA)138(67-6%)23(60-5%)0.729。■393姐bp(20CA)3(7.9%)0-035LOOO463bp(21CA)1(0.9%)1(2.6%)1-792。■290465bp(22CA)6(2.9%)1(2-6%)0-011LOOO46Tbp(23CA)11(5-4，)1(2-6%)。■5180-柳469bp(24CA)21(10.3*)4(10.5%)。■002LOOO471bp(25CA)0(0%)2(5.3%)10.8620-0244T3bp(26CA)0(0%)0(0%)与现有技术相比，本发明将IL-10基因两个STR位点(IL-10.G、IL-10.R)与乙肝病毒感染的易感性联系起来，确定了IL-IO.G、IL-IO.R是乙肝病毒感染的新型相关基因；并采用STRs-PCR方法，通过对IL-10启动子区IL-10.G和IL-IO.R两个STR位点的基因型进行检测，从而可判断个体对乙肝病毒的易感性，为乙肝病毒感染的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。图1是ABI310GenescanAnalysis3.0所示IL-10.G与IL-10.R的STRs-PCR检测结果图；图中1号波峰为IL-10.R的产物片段，2号波峰为IL-10.G的产物片段，3号波峰为TEMRA内标片段。图2是ABI310GenescanAnalysis3.0所示IL-10.R的STRs-PCR检测结果图；图示IL-10.R为110bp(IICA重复)的纯合子；图中4号波峰为IL-IO.R的产物片段，5号波峰为TEMRA内标片段。图3是ABI310GenescanAnalysis3.0所示IL-10.G的STRs-PCR检测结果图；图示IL-IO.G为459bp(19CA)与465bp(22CA)的杂合子；图中6号波峰为IL-10.G的产物片段，7号波峰为TEMRA内标片段。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限制。实施例l:采用STRs-PCR方法，按以下步骤检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点(IL-IO.G、IL-10.R)的基因型(1)模板DNA制备采取血样，红细胞悬液经过酚(Tris-饱和苯酚)-氯仿抽提基因组DNA后，用TE缓冲液(由10mmol/LTris-HCL(pH8.0)与lmmol/LEDTA(pH8.O)组成)溶解，DU640核酸定量仪测定，计算DNA的含量，同时检观^DNA样品的纯度，将每个标本稀释成约100ng/yl的应用液。(2)IL-10.G与IL-IO.R两个STR位点的引物设计根据Genbank报道的人类IL-10DNA序列，利用PrimerPremier5软件自行设计IL-10.G位点引物序列以及参照相关文献选取扩增IL-IO.R位点的引物序列，并在正链引物的5'端分别用荧光素HEX与6-FAM标记，并交送上海基康生物公司合成。IL-10.G与IL-10.R微卫星PCR扩增引物序列微卫星引物糊长度IL-10.R5VCCCTOCAAAATaATTTGCATAAG3'24bpHEX5'CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC3'23bpIL-10.G5VTTOCTCOCAGTTACAGTCT3v19bpWAI5'CACCATCTCCAGCACATA3v18bp(3)PCR扩增体系(25y1):IL-10.G与IL-10.R微卫星PCRr^体系10XPCR缓冲液2.5IgCl，(25,1/L)1.5tudMTPsC2-5mol/02.0tu上游引物G/R(10，加1/L)1.0tu下游引物G/R(10.0li加l/L)1.0tuTaqD他(5U旭)0.3Pl微腿0.5Pl去离子水16.2HlTotal25(4)混匀反应体系，瞬时离心后上机，进行PCR循环反应，条件如鄉％t:火6it;延伸721;终末延伸T21;5min30s—60s—30个頃环10min_^4G保温(5)ABI310测序仪自动荧光检测并分析PCR产物①PCR产物变性取lylPCR产物，加入15yl去离子甲酰胺及O.5y1Genescan-500TEMRA内标，混匀离心后，置于PCR仪中95。C变性5min，后迅速转移至冰盒中以保持产物单链结构。②ABI310测序仪毛细管电泳PCR产物变性后，剪去管盖置入ABI310测序仪中(灌有7310P0P4分离胶)进行自动毛11细管电泳(电泳时P0P4分离胶自动灌入毛细管)及荧光检测，变性凝胶温度设为6(TC，电泳时间28min。③GeneScan软件分析产物大小PCR产物经毛细管电泳后，采用ABI310DataCollection软件收集荧光信号，将信号转换为电泳图象，并用ABI310GenescanAnalysis3.O软件将图象信号转换为数值(表示扩增的片段长度大小)，对产物片段进行准确测定，然后根据片段长度大小推算CA重复的次数，从而确定其基因型(所检测的STR位点的基因全序列是可以在NCBI上査出的，也就是说包括引物在内的扩增出的片段其序列是已知的，而扩增出的产物长度差异来自于CA重复的次数，因此根据扩增出的片段长度大小结合已知序列，可以得出CA重复的次数)。检测结果及个体对乙肝病毒是否易感的判断IL-10.R位点有11CA、12CA两种基因型，IL-10.G位点有15CA、(17-26)CA^^—种基因型，其中IL-10.G(19CA)、(25CA)、(26CA)等位基因频率与HBV感染相关携带IL-10.G459bp(19CA)、IL-10.G471bp(25CA)、IL-10.G473bp(26CA)的个体对乙肝病毒具有更低的易感性。实施例2:采用STRs-PCR方法，按以下步骤检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点(IL-IO.G、IL-10.R)的基因型(1)模板DNA制备采取血样，红细胞悬液经过酚(Tris-饱和苯酚)-氯仿抽提基因组DNA后，用TE缓冲液(由10mmol/LTris-HCL(pH8.0)与lmmol/LEDTA(pH8.O)组成)溶解，DU640核酸定量仪测定，将每个标本稀释成约100ng/yl的应用液。(2)IL-10.G与IL-IO.R两个STR位点的引物设计利用PrimerPremier5软件设计IL-10.G位点引物序列，参照相关文献选取扩增IL-10.R位点的引物序列，并在正链引物的5'端分别用荧光素HEX与6-FAM标记，并交送上海基康生物公司合成。IL-10.G与IL-10.R微卫星PCR扩増引物序列微卫星引物序列长度荧^ifiIL-10.R5VCOCTCCMAATCTATTTGCATMG3'24bpHEX5JCTCDGCOCAGTMGTTTCATCAC3'23bpIL-10.G5;TTCCTCOCAGTTACAGTCT3'l%p5'CACCATCTOCAGCACATA3'18bp(3)PC財广增体系(25y1):IL-10.G与IL-10.R微卫星PGRJTWt系10XPCR缓冲液2.5tUIgCl，(25,1/L)1.5Pl2.0Pl上游引物G/R(10.0Pido1/L)1.0tu下游引物G/R(10.0P加l/L)1.0tuTaqD貼|^S|(5U/tU)0.3Pl驟DNA0.5Pl去离子水16.2kllTotal25Pl(4)混匀反应体系，瞬时离心后上机，进行PCR循环反应，条件如下3min鹏mr:30s退火601;42s32顿环延伸721;60s终末延伸72r;12ndn(5)ABI310测序仪自动荧光检测并分析PCR产物①PCR产物变性取PCR产物，加入去离子甲酰胺及Genescan-500TEMRA内标，混匀离心后，置于PCR仪中95。C变性5min，后迅速转移至冰盒中以保持产物单链结构。②ABI310测序仪毛细管电泳PCR产物变性后，剪去管盖置入ABI310测序仪中进行自动毛细管电泳及荧光检测，变性凝胶温度设为6(TC，电泳时间28min。③GeneScan软件分析产物大小PCR产物经毛细管电泳后，采用ABI310DataCollection软件收集荧光信号，将信号转换为电泳图象，并用ABI310GenescanAnalysis3.O软件将图象信号转换为数值(表示扩增的片段长度大小)，对产物片段进行准确测定，然后根据片段长度大小推算CA重复的次数，从而确定其基因型。检测结果及个体对乙肝病毒是否易感的判断同实施例l。实施例3:采用STRs-PCR方法，按以下步骤检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点(IL-IO.G、IL-10.R)的基因型(1)模板DNA制备采取血样，红细胞悬液经过酚-氯仿抽提基因组DNA后，用TE缓冲液溶解制备模板DNA。(2)IL-10.G与IL-IO.R两个STR位点的引物设计利用PrimerPremier5软件、参照文献设计IL-10.G和IL-10.R位点的引物序列IL-10.G与IL-10.R微卫星PCR扩增引物序列微卫星引物序列长度荧&^￡IL-10.K5JCCCTCCAAAATCTATTTGCMAAG3'24bpHEX5'CTOXCCCAGTAAGTTTCATCAC3'23bPIL-10.G5JTTCCTCCCAGTTACAGTCT3'19bp5'CADCATCTCCACCACATA3'18bp(3)PC財广增体系的组配10XPCR缓冲液、MgCl2(25mmol/L)、dNTPs(2.5mol/L)、上游引物G/R(10.0ymol/L)、下游引物G/R(10.0ymol/L)、TaqDNA聚合酶(5U/yl)、模板DNA和去离子水(4)混匀反应体系，瞬时离心后上机，进行PCR循环反应，条件如下IS3et493t:4ndn3ti96t:30s-退火64C48s延伸74t:60s—终末延伸74t:8min29^HI环(5)ABI310测序仪自动荧光检测并分析PCR产物①PCR产物变性取PCR产物，加入去离子甲酰胺及Genescan-500TEMRA内标，混匀离心后，置于PCR仪中变性，后迅速转移至冰盒中以保持产物单链结构。②ABI310测序仪毛细管电泳PCR产物变性后，置入ABI310测序仪中进行自动毛细管电泳及荧光检测。③GeneScan软件分析产物大小PCR产物经毛细管电泳后，收集荧光信号，将信号转换为电泳图象，并用GenescanAnalysis3.O软件将图象信号转换为数值(表示扩增的片段长度大小)，对产物片段进行准确测定，然后根据片段长度大小推算CA重复的次数，从而确定其基因型。检测结果及个体对乙肝病毒是否易感的判断同实施例l。实施例4:用于检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的试剂盒，包括(1)PC財广增试剂IOXPCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；(2)DNA变性试剂去离子甲酰胺(ABI公司)；(3)ABI310毛细管电泳试剂内标Genescan-500TEMRA(ABI公司)、7310P0P4分离胶(ABI公司)；(4)荧光引物(上海基康生物公司合成)。权利要求1.一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，所述方法为STRs-PCR，即短串联重复序列或微卫星DNA聚合酶链式反应，其特征在于包括以下步骤(1)采取血样，红细胞悬液经过酚-氯仿抽提基因组DNA后，用TE缓冲液溶解制备模板DNA；(2)IL-10.G与IL-10.R两个STR位点的引物设计IL-10.R微卫星PCR扩增的引物序列为5′-CCCTCCAAAATCTATTTGCATAAG-3′、5′-CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC-3′；IL-10.G微卫星PCR扩增的引物序列为5′-TTCCTCCCAGTTACAGTCT-3′、5′-CACCATCTCCAGCACATA-3′；(3)PCR扩增体系的组配10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、上游引物G/R、下游引物G/R、TaqDNA聚合酶、模板DNA和去离子水；(4)混匀反应体系，瞬时离心后上机，进行PCR循环反应；(5)ABI310测序仪自动荧光检测并分析PCR产物向PCR产物中加入去离子甲酰胺进行变性，然后置于ABI310测序仪中进行毛细管电泳及荧光检测，再用GeneScan软件对产物片段进行准确测定，后利用产物片段大小的数值进行基因分型。2.根据权利要求1所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于步骤(3)中的PC財广增试剂为10XPCR缓冲液、25mmol/L的MgC12、2.5mol/L的dNTPs禾口5U/y1的TaqDNA聚合酶。3.根据权利要求1所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于步骤(4)中的PCR循环反应条件为变性温度9396°C、时间30s，退火温度6065。C、时间4050s，延伸温度7075。C、时间60s。4.根据权利要求3所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于PCR循环反应条件为变性温度95'C、时间30s，退火温度61。C、时间45s，延伸温度72。C、时间60s。5.根据权利要求1或3所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于步骤(4)中模板DNA在变性之前于9395'C预变性35min;终末延伸温度7075。C，维持515min。6.根据权利要求5所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于模板DNA在变性之前于94'C预变性5min;终末延伸温度72°C，维持10min。7.根据权利要求1或3所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于步骤(4)中PCR循环次数为2535。8.根据权利要求7所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于PCR循环次数为30。9.根据权利要求1所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于步骤(5)中PCR产物变性时以Genescan-500TEMRA为内标，置于PCR仪中95。C变性5min。10.根据权利要求1所述检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，其特征在于步骤(5)中PCR产物进行毛细管电泳及荧光检测时，变性凝胶温度为6(TC，电泳时间28min。11.一种通过检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型判断个体对乙肝病毒是否易感的方法，其特征在于携带IL-10.G459bp(19CA)、IL-10.G471bp(25CA)、IL-10.G473bp(26CA)的个体对乙肝病毒具有更低的易感性。12.检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括(1)PC財广增试剂IOXPCR缓冲液、MgC12、dNTPs、TaqDNA聚合酶；(2)DNA变性试剂去离子甲酰胺；(3)ABI310毛细管电泳试剂内标Genescan-500TEMRA、7310P0P4分离胶;(4)荧光引物。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法或试剂盒在乙肝病毒感染的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。全文摘要本发明公开了一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法、试剂盒及应用。所述方法为STRs-PCR，包括模板DNA的制备，两个STR位点的引物设计，PCR扩增体系的组配，PCR循环反应，毛细管电泳及荧光检测并分析PCR产物。与现有技术相比，本发明将IL-10基因两个STR位点与乙肝病毒感染的易感性联系起来，确定了IL-10.G、IL-10.R是乙肝病毒感染的新型相关基因；并采用STRs-PCR方法，通过对IL-10基因IL-10.G和IL-10.R两个STR位点的基因型进行检测，从而可判断个体对乙肝病毒的易感性，为乙肝病毒感染的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。文档编号C12Q1/68GK101597651SQ20091030368公开日2009年12月9日申请日期2009年6月25日优先权日2009年6月25日发明者燕何,单可人,王婵娟申请人:贵阳医学院