用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒的制作方法

专利名称：用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法和试剂盒，具体讲 涉及一组利用多重荧光PCR对人甲型流感病毒进行检测的引物对和探针，以及检测方法的
试齐U盒。
背景技术：
流感是一种由流感病毒引起的、通过呼吸道传播的传染性疾病。流感病毒 (Influenzavirus)属正粘液病毒科，流感病毒属，根据病毒抗原特性及其基因特性的不同， 流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分 为15个亚型(HI H15)，N有9个亚型(附 N9)。其中仅H1、H3、H9主要感染人类，其它 许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外 的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5W人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全 球广泛关注。1997年以后，世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致 病性的H5W等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流 行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。历史上流感的大流行曾经给人类造 成过很严重的后果，例如1918年爆发的由Hmi亚型流感病毒引起的“西班牙流感”。它是 20世纪最具灾难性的流感病毒，在不到一年时间里感染了全世界一半的人口，导致数千万 人死亡。流感大流行通常是由一种新出现的或者以前人未曾感染过的病毒引起的，人体对 这种新病毒没有免疫力，再加上其传播范围广、速度快，而疫苗的研制和生产又很难立即跟 上，所以容易造成许多人感染甚至死亡。近年来，随着全球经济发展的一体化程度的不断加 深，世界各国之间的人员往来和流动日益频繁和密切，从而使流感病毒在全球的播散和蔓 延速率进一步加快，一旦某个国家或地区流感爆发，疫情将会在短时间内迅速播散至世界 各地。2009年发生的新型甲型Hmi型流感疫情正是如此。2009年4月，墨西哥确诊了首例新型甲型Hmi型流感病例。在随后的4月至5月 期间，新型甲型Hmi型流感疫情在世界范围内迅速蔓延，仅仅一个多月的时间内，全球多 个国家和地区均发生了新型甲型Hmi型流感疫情。以疫情最为严重的墨西哥和美国为例， 截至2009年5月14日，墨西哥全国确诊新型甲型Hmi流感病例上升至2720例，其中死亡 人数上升至64人；而在美国五十个州中，已有四十七个州宣布发现新型甲型Hmi流感病 例，患者总数也上升至4298人，比前一天增加946人。我国内地也于5月11日确诊了首例 新型甲型Hmi流感病例，截至2009年5月19日，已经出现4例新型甲型Hmi流感病例， 均为输入性流感病例。世界卫生组织已于2009年4月29日宣布全球流感大流行警告级别 为5级，并且随着新型甲型Hmi流感疫情在世界范围内的不断蔓延，爆发全球流感大流行 的风险日益提升，世界卫生组织已于5月初明确表示不排除把警告级别升至6级，即宣布流 感大流行到来的可能性。此次新型甲型Hmi型流感疫情发生后，世界各国的科学家们立即展开了相关的 科学研究工作。最新的调查和研究结果显示，每个感染新型甲型Hmi型流感的墨西哥患者
5都会导致增加1. 2至1. 6个新病例，证明流感病毒的人际传播在不断发生。这一流感病毒 的传染率，到目前为止是1/3，全球范围内可能会有20亿人受到这种流感病毒的感染，一场 全球性大流感现在已经初见端倪。但是由于目前尚不能确定新型甲型Hmi型流感病毒的 毒性、可传播性和病毒的起源，并且该病毒的潜伏期和传染期也不是很明确，因此科学家们 还无法判断其在世界范围内扩散的程度。尽管目前新型甲型Hmi流感病毒仍在扩散，而且如何演变尚不可预知，但只要全 球通力合作，充分做好疫情的监控和防范工作，就可以最大限度地减少流感病毒对人类的 危害。早期确诊新型甲型Hmi流感病毒感染病例，及时进行病例的隔离和治疗，是阻止流 感疫情蔓延的重要措施。然而，随着流感病毒不断地在人际之间传播，其发生变异以及毒力 由弱变强的可能性都是存在的，特别是病毒血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的具 有高度的变异性和变异的不确定性的特点，使得流感病毒的诊断和分型方法一直滞后于其 疫情的爆发。因此，在较短的时间内研制出快速、特异、灵敏的检测方法和诊断试剂，是对抗 新型甲型mm流感病毒的首要任务。由于单克隆抗体技术的普遍应用，许多以单抗为基础、针对甲型流感病毒的ELISA 和胶体金诊断试剂盒已研制成功，例如甲型流感病毒胶体金诊断试剂对来自疫区飞机的乘 客进行快速筛查，不失为一种有价值的方法。随着现代生物技术的发展，分子生物学技术已被大量应用于甲型流感病毒的快速 诊断。此次疫情爆发后世界卫生组织陆续公布的流感病毒快速检测方法，均是基于新型甲 型Him流感病毒核酸的荧光定量RT PCR检测技术。该技术设计的试剂易于制备，且具有快 速、灵敏、易于在基层推广的优点。但是这些方法还存在一定的缺陷，如所使用的引物和探 针的序列特异性低，难以对当前新型甲型Him流感病毒的基因组散在的多处变异进行特 异性诊断，易于与以往的季节性甲型Him流感病毒产生交叉反应或不能扩增出在引物或 探针位置出现变异的新型甲型Him流感病毒株，从而导致假阳性或假阴性结果。所以WHO 不将其作为确诊的诊断方法。因此，人们迫切需要一种准确、快速、易于操作的甲型流感病 毒的分型检测的检测方法，相关的确诊方法也成为各国争相研究的重点。

发明内容
本发明的发明目的在于提出一种检测人甲型流感病毒的引物和探针。本发明的又一发明目的在于提出一种检测人甲型流感病毒的方法。本发明的再一发明目的在于提出一种检测人甲型流感病毒的试剂盒。为了完成本发明的发明目的，本发明采用的技术方案为本发明涉及一种用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列，包含由SEQ ID NO 1至 SEQ IDN0 12所示的任一核苷酸序列的部分序列或全序列。本发明的第一优选方案为本发明的用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列选自 用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物对和探针和用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和 探针中的至少一组以及用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针，其中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQID NO :1所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的部分 序列或全序列；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列 为由SEQID NO :4所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO 5 所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的部 分序列或全序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序 列为由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :9所示核苷酸序列 的部分序列或全序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO 10所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO 11所示核 苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列的部分序列 或全序列。本发明的第二优选方案为本发明的用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列选自 用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物对和探针和用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和 探针中的至少一组以及用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针，其中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQID N0 :1所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列 的至少15个连续核苷酸；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列 为由SEQID NO :4所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO :6所示核苷酸 序列的至少15个连续核苷酸；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序 列为由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID NO 8所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO 9所示核苷酸 序列的至少15个连续核苷酸；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID N0:11所示 核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列的至 少15个连续核苷酸。本发明的第三优选方案为本发明的用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列选自 用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物对和探针和用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和 探针中的至少一组以及用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针，其中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为
7由SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，探针 的序列为由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列 为由SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探 针的序列为由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序 列为由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列， 探针的序列为由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探针的序列 为由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。本发明的第四优选方案为本发明的用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列选自 用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增甲型HI流感病毒靶 核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和 探针和用于扩增人内参基因核酸序列的弓I物对和探针，其中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQID N0 1所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，探针 的序列为由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列 为由SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探 针的序列为由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序 列为由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列， 探针的序列为由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探针的序列 为由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。本发明的第五优选方案为本发明的用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列选自 用于扩增甲型Hi流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增新型甲型mm流感 病毒靶核酸序列的引物对和探针和用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针，其中用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列 为由SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探 针的序列为由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序 列为由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列， 探针的序列为由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO :10所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探针的序列 为由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。
本发明的引物和探针的核苷酸序列为
SEQ ID NO 1GACCRATCYTGTCACCTCTGACSEQ ID NO 2AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTASEQ ID NO 3R0X II GCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ2SEQ ID NO 4TGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCSEQ ID NO 5TTTGTAGAAGCTTTTTGCTCCAGSEQ ID NO 6FAM-TCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGG-BHQ1SEQ ID NO 7CAGATYYTGGCGATCTATTCAACSEQ ID NO 8CCCATTRGARCACATCCAGAASEQ ID NO 9HEX-TCTCCCTGGGGGCAATC-BHQ1SEQ ID NO 10AGATTTGGACCTGCGAGCGSEQ ID NO 11GAGCGGCTGTCTCCACAAGTSEQ ID NO 12CY5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ3本发明还涉及一种检测人甲型流感病毒的方法，包括以下步骤(1)提取核酸样本；(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用本发明所述的为引物对和探针，多重荧光 PCR扩增病原体的靶核酸序列；(3)采用荧光检测仪对扩增产物进行分析，并分析结果。其中，本发明检测方法采用的多重荧光PCR的反应体系为50mL反应体系中含有
9 本发明的检测方法中的PCR扩增条件为48 53°C 25 35分钟、90 92°C 3 分钟预变性；90 92°C 10秒、58 60°C 30秒、重复35 40个循环；最后37°C保温。本发明检测方法的PCR扩增条件优选为50°C 30分钟、92°C 3分钟预变性； 92°C 10秒、60°C 30秒、重复40个循环；最后37°C保温。本发明还涉及一种检测人甲型流感病毒的试剂盒，含有本发明所述的引物对和探针。本发明的试剂盒包括逆转录PCR反应液800 1000重量份，体积比为1 3的逆转录酶和热启动DNA聚合 酶的混合物40 50重量份，阳性对照15重量份，阴性对照500 600重量份，DEPC水500 600 重量份，半数组织培养感染量(TCID5Q)为1X10—4的新型甲型H1N1定量参比品15重量份，半数组 织培养感染量为1X10—3的新型甲型H1N1定量参比品15重量份，半数组织培养感染量为1X10_2 的新型甲型H1N1定量参比品15重量份和半数组织培养感染量为1X10—1的新型甲型H1N1定量 参比品15重量份；其中，逆转录-PCR反应液的组成为10X逆转录-PCR反应液100重量份，10mM dNTP 40重量份，5 X逆转录增强液200重量份，RNA酶抑制剂10重量份，20 y M弓丨物和探针20重 量份，水430重量份；阳性对照品为含有质粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型 H1N1定量参比品为含有质粒PMD19H1N1的溶液，阴性对照品为正常人的口腔分泌物。本发明的试剂盒优选为逆转录PCR反应液800重量份，体积比为1 3的逆转录酶和热启动DNA聚合酶的 混合物40重量份，阳性对照15重量份，阴性对照500重量份，DEPC水500重量份，半数组织 培养感染量为1X 10_4的新型甲型Hmi定量参比品15重量份，半数组织培养感染量为1X 10_3 的新型甲型Hmi定量参比品15重量份，半数组织培养感染量为1X 10_2的新型甲型Hmi定量 参比品15重量份和半数组织培养感染量为1X1CT1的新型甲型Hmi定量参比品15重量份； 其中，逆转录-PCR反应液的组成为10 X逆转录-PCR反应液100重量份，lOmM dNTP 40重量 份，5X逆转录增强液200重量份，RNA酶抑制剂10重量份，20 u M引物和探针20重量份，水 430重量份；阳性对照品为含有质粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型Hmi 定量参比品为含有质粒pMD19Hmi的溶液，阴性对照品为正常人的口腔分泌物。疫情爆发后世界卫生组织陆续公布的流感病毒快速检测方法，就是基于新型甲型
10H1N1流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测技术。但由于当时所获得的新型甲型Hmi流 感病毒的序列有限，所以WHO推荐的引物和探针与当前新型甲型mm流感病毒的基因组相 比，出现几处变异，造成扩增敏感度低，甚至漏诊。基于这些实际问题，我们根据以往的流感 病毒和最新公布的新型Hmi流感病毒基因组序列，设计特异的引物和探针，以区别甲型流 感、甲型HI型流感及此次流行的新型甲型Hmi流感病毒。从而可以在一个体系内区分并 鉴定这三类病毒。与世界卫生组织提供的探针引物相比，我们的灵敏度提高了 一个数量级。 我们对WHO设计的和本发明设计的针对新型甲型Hmi流感病毒的引物探针扩增体系比较。 我们选取了此次流行的新型甲型Hmi流感病毒的CDNA为模板，对WHO设计的(图1)和本 发明设计的(图2)针对新型甲型Hmi流感病毒的引物探针扩增体系进行比较，结果显示， 用WHO设计的引物和探针，获得的灵敏度是l(T3TCID50(Tissue culture infective dose, 半数组织培养感染剂量)，而本发明设计的弓I物和探针，其灵敏度可达到10_4TCID50。此外，该发明的整个检测体系采用多重荧光PCR系统，即采用多重荧光PCR检测技 术，在同一个荧光PCR反应体系中分别检测甲型流感、甲型HI型流感及此次流行的新型甲 型Hmi流感病毒，同时使用内标，以质控核酸抽提及PCR反应过程，消除假阴性的产生，使 整个检测过程实验准确可靠，对于提高早期检出率，减少医务人员的操作时间，降低成本， 减轻病人经济负担等都具有重要的影响。


图1为WHO设计的引物和探针在比较实验结果中的实验结果；图2为本发明设计的引物和探针(SEQ ID NO 4 6)在比较实验中的实验结果；图3为多重荧光PCR检测仪“R0X”通道分析结果，其中1为猪HI型流感病毒样本， 2为新型甲型Hmi型流感病毒样本，3为季节性甲型HI型流感病毒样本，4季节性甲型H3 型流感病毒样本，5为季节性甲型H9型流感病毒样本，6为高致病性H5W禽流感病毒样本， 7为高致病性H5W禽流感样本；图4为多重荧光PCR检测仪“HEX/VIC”通道分析结果，其中1为猪HI型流感病毒 样本，2为新型甲型Hmi型流感病毒样本，3为季节性甲型HI型流感病毒样本；图5为多重荧光PCR检测仪“FAM”通道分析结果:3为季节性甲型HI型流感病毒样本；图6为多重荧光PCR检测仪“CY5”通道分析结果1为猪HI型流感，2为新型甲型 H1N1型流感，3为季节性甲型HI型流感，4为季节性甲型H3型流感，5为季节性甲型H9型 流感，6为高致病性H5W禽流感病毒。
具体实施例方式本发明提出的具体实施方式
，仅限于对本发明的技术方案做进一步的解释和说 明，并不对本发明的技术方案做出限制。实施例1甲型流感病毒、季节性甲型流感病毒和新型甲型Hmi流感病毒分型检 测方法和试剂盒1 材料1. 1病毒标本1份甲型猪流感病毒样本(病毒样本来自中国农业科学院上海兽医研究所)；
1份此次新型流行的甲型Hmi流感病毒样本(病毒样本来自香港玛丽医院)；3份甲型季节性流感病毒样本1份季节性甲型HI型流感、1份季节性甲型H3型 流感、1份季节性甲型H9型流感(病毒样本来自广州疾病预防控制中心)；1份高致病性H5W禽流感病毒样(病毒样本来自香港玛丽医院)；1份乙型流感病毒(病毒样本来自中国农业科学院上海兽医研究所)。2.方法2. 1毒株总RNA的获取采用Qiagen公司的RNA试剂盒，处理样本，抽提并纯化总RNA，整个操作步骤按照 厂家的说明书进行。2. 2引物合成由上海超世生物科技有限公司完成(合成方法参考现代分子生物 学实验技术(第二版)卢圣栋主编)2. 3本发明应用多重PCR荧光原理，采用多重荧光PCR检测技术，在同一反应管内 加入各自的引物与探针，由于四种探针的5’端分别标记不同波长的报告荧光(Fam，Hex, Rox, Cy5)，PCR反应进行时，不同的报告荧光基团释放荧光，荧光测定仪器分别读取四种波 长的荧光信号进行分析，可在同一个荧光PCR反应体系中分别检测甲型流感、甲型HI型流 感及此次流行的新型甲型Hmi流感病毒。对反应的条件进行优化，最终确定的反应体系及反应条件如下(1)多重荧光PCR反应体系(50mL反应体系)50mL反应体系中含有 其中，引物和探针中包含SEQ ID 1-12。
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(2)多重荧光PCR扩增条件本发明采用的PCR荧光检测仪型号ABI系列多重荧光PCR扩增条件50°C 30分钟、92°C 3分钟预变性；92°C 10秒、60°C 30 秒重复40个循环；最后37°C保温。在PCR循环第二步60°C时收集荧光信号。检测通道为、HEX(VIC)、R0X*CY5。参 比荧光定为none。3.实验结果3. 1选择检测通道“R0X”对甲型流感病毒样本进行分析，如图3所示，可检测到猪 Hl型流感(1)、新型甲型Hmi型流感(2)、季节性甲型Hl型流感(3)、季节性甲型H3型流 感(4)、季节性甲型H9型流感(5)、高致病性H5W禽流感病毒(6)。3. 2选择检测通道“HEX/VIC”对季节性甲型Hl流感病毒样本进行分析，如图4所 示，可检测到猪Hl型流感(1)、新型甲型Hmi型流感(2)、季节性甲型Hl型流感(3)；3. 3选择检测通道“FAM”对新型甲型流感病毒样本进行分析，如图5所示，可检测 到新型甲型Hmi型流感⑵；3. 4选择检测通道“CY5”对内参品进行分析，如图6所示，可检测到猪Hl型流感 (1)、新型甲型Hmi型流感(2)、季节性甲型Hl型流感(3)、季节性甲型H3型流感(4)、季节 性甲型H9型流感(5)、高致病性H5W禽流感病毒(6)。实施例2试剂盒 本试剂盒规格为20人份，试剂盒组成
其中，RT-PCR反应液取 10X 逆转录 PCR 反应液 100 μ 1，IOmMWdNTP 40 μ 1,5Χ 逆转录增强液200ml，RNA酶抑制剂10 μ 1，20 μ M的引物和探针20 μ 1(SEQ ID NO: 1-12)， 至800ml，充分混勻。混合酶液10 μ 1的逆转录酶和30 μ 1的热启动DNA聚合酶。阳性对照品为含有质粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型Hmi定量参比品为含有质粒pMD19Hmi的溶液，阴性对照品为正常人的口腔分泌物。实施例3试剂盒的使用方法试剂准备1. 1试剂开管前完全解冻后充分混勻并短暂离心1. 2配制按每个反应取RT PCR反应液43ml、混合酶2ml计算，乘以所需的反应管 数(建议酌情可多配一个反应量)，加于一总的无菌离心管中，振荡混勻。1. 3分装用微量加样器在每一 PCR反应管内加入45ml上述混勻的反应液，存于 4°C。注意最好在RNA提取结束后配制反应液。2.标本RNA提取采用Qiagen公司的RNA试剂盒，处理样本，抽提并纯化总RNA， 溶解在50ulDEPC水中，整个操作步骤按照厂家的说明书进行。3.加样在上述准备的装有RT-PCR混合反应液的PCR反应管中加入标本5ul、阴 性对照RNA或阳性对照DNA 5ml。4. PCR 反应PCR荧光检测仪型号ABI系列在PCR荧光检测仪上设定程序为 在PCR循环第二步60°C时收集荧光信号。检测通道为FAM、HEX(VIC)、R0X和CY5。 参比荧光定为none。5.反应完毕，存储结果以便进行数据处理。6.实验结果计算(1)基线设定根据实验的具体情况，调节基线的起止点。一般选择曲线波动较小，较稳定的那段 作为基线，用户可根据实际情况自行调整。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号 增高，设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有 明显增长的地方。依据实验曲线走势的不同，一般start值可选择在3-12之间；stop值选 择以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则，以更好满足统计基线标准偏差的数 学要求。(2)阈值设定以高于无扩增增长曲线的最高点，且阴性对照品未检出为原则，确定起始阈值。(3)荧光检测仪根据输入的基线和阈值自动计算出定量结果。7.分析检验结果7. 1结果分析在进行RT-PCR反应检测中，选择“FAM”对新型甲型Hmi流感进行 分析。选择“HEX/VIC”对季节性甲型Hl流感进行分析。选择“R0X”对A型流感进行分析。 选择“ CY5 ”对内参品进行分析。
7. 2结果判定(1)当标本检测中的CT值小于或等于36.00，则判为阳性。(2)当标本检测中的CT值大于或等于38. 00，则判为低于最低检出极限或阴性。(3)当标本检测中的CT值在36. 00 38. 00之间，可能是被检标本的DNA滴度较 低，或由于荧光的不稳定，易造成漏检，因此需重新测定以获得可靠结果。重新测定后，若结 果小于38. 00，则判为阳性，大于或等于38，则判为低于最低检出极限或阴性。 3.实验有效条件(I)PCR 扩增实验a.阴性对照的0￥5通道(^值必须<36，？411、昍乂作10和ROX通道CT值必须彡38 或显示“Undet”。b.阳性对照的FAM通道CT值必须< 36，HEX (VIC)、ROX和CY5通道CT值必须彡38 或显示“Undet”。c.对在RT PCR扩增反应中其检测的四个通道CT值均彡38或显示“Undet”的标 本，建议重新进行检测实验，并且在原来的标本液中加入本试剂盒中的阴性对照100ml，进 行RNA的抽提和相关的PCR实验。
1权利要求
一种用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于，包含由SEQ ID NO1至SEQ ID NO12所示的任一核苷酸序列的部分序列或全序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于，所述 核苷酸序列选自用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增甲型 HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针和用于扩增新型甲型mm流感病毒靶核酸 序列的引物对和探针中的至少一组以及用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针，其 中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由 SEQID NO :1所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID N0:2所示 核苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的部分序 列或全序列；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由 SEQID NO :4所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID N0:5所示 核苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的部分序 列或全序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO 8 所示核苷酸序列的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的部 分序列或全序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列的部分序列或全序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列 的部分序列或全序列，探针的序列为由SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的部分序列或全序 列。
3.根据权利要求2所述的检测人甲型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于，其中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由SEQID NO :1所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID NO 2 所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的 至少15个连续核苷酸；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由 SEQID NO :4所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID NO 5 所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的 至少15个连续核苷酸；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQ ID N0:7所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID NO 8所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO :9所示核苷酸序列 的至少15个连续核苷酸；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，第二引物的序列为由SEQ ID N0:11所示核苷酸 序列的至少15个连续核苷酸，探针的序列为由SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
4.根据权利要求3所述的检测人甲型流感病毒引物和探针，其特征在于，用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由 SEQ ID N0:1所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，探针的 序列为由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对为第一引物的序列为由SEQ IDN0:4所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探针的序列 为由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列，探针 的序列为由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :11所示核苷酸序列，探针的序列为由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的用于检测人甲型流感病毒核苷酸序列，其特征在于，所述引 物选自用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增甲型HI流感 病毒靶核酸序列的通用引物对和探针、用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引 物对和探针和用于扩增人内参基因核酸序列的引物对和探针，其中用于扩增人甲型流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由 SEQID NO :1所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，探针的 序列为由SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；用于扩增甲型HI流感病毒靶核酸序列的通用引物对和探针为第一引物的序列为由 SEQID NO :4所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :5所示核苷酸序列，探针的 序列为由SEQ ID NO 6所示核苷酸序列；用于扩增新型甲型Hmi流感病毒靶核酸序列的引物对和探针为第一引物的序列为 由SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO :8所示核苷酸序列，探针 的序列为由SEQ ID NO 9所示核苷酸序列；用于扩增人内参基因核酸序列的引物对为和探针第一引物的序列为由SEQ ID NO 10 所示核苷酸序列，第二引物的序列为由SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列，探针的序列为由SEQ ID NO 12所示核苷酸序列。
6.一种检测人甲型流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)提取核酸样本；(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用权利要求1至5任意一项所述的引物和探针序 列，多重荧光PCR扩增病原体的靶核酸序列；(3)采用荧光检测仪对扩增产物进行分析，并分析结果。
7.根据权利要求6所述的检测人甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述的多重荧光 PCR的反应体系为50mL反应体系中含有提取的RNA样本5 yl ；10 X逆转录-PCR反应液5 ill ；引物和探针(20iiM)liil ； dNTPs(10mM)2u 1 ； 5X逆转录增强液10ml ； 逆转录酶0. ； 热启动DNA聚合酶2iU ； RNA酶抑制剂0. 5 ill ； 水 24 ii 1。
8.根据权利要求6所述的检测人甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述的PCR扩增 条件为48 53°C 25 35分钟、90 92°C 3分钟预变性；90 92°C 10秒、58 60°C 30 秒，重复35 40个循环；最后37°C保温。
9.根据权利要求8所述的检测人甲型流感病毒的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条 件为50°C 30分钟、92°C 3分钟预变性；92°C 10秒、60°C 30秒，重复40个循环；最后37°C保
10.一种检测人甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1 5任一所述的 引物和探针。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成为逆转录-PCR 反应液800重量份，体积比为1 3的逆转录酶和热启动DNA聚合酶的混合物40重量份， 阳性对照15重量份，阴性对照500重量份，DEPC水500重量份，半数组织培养感染量为 IX 10-4的新型甲型Hmi定量参比品15重量份，半数组织培养感染量为IX 10-3的新型甲 型Hmi定量参比品15重量份，半数组织培养感染量为1X10-2的新型甲型Hmi定量参比 品15重量份，和半数组织培养感染量为IX 10-1的新型甲型Hmi定量参比品15重量份；其中，逆转录-PCR反应液的组成为10X逆转录-PCR反应液100重量份，10mM dNTP40 重量份，5 X逆转录增强液200重量份，RNA酶抑制剂10重量份，20 u M引物和探针20重量 份，水430重量份；阳性对照品为含有质粒pMD19A、pMD19Hl和pMD19RnaseP的溶液，新型甲型Hmi定量 参比品为含有质粒pMD19Hmi的溶液，阴性对照品为正常人的口腔分泌物。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法以及试剂盒，本发明可分型检测人甲型流感病毒、甲型H1流感和新型甲型H1N1流感病毒，其引物和探针包含由SEQID NO1至SEQ ID NO12所示的任一核苷酸序列。本发明可在同一个荧光PCR反应体系中分别检测甲型流感、甲型H1型流感及新型甲型H1N1流感病毒，同时使用内标以质控核酸抽提及PCR反应过程，消除假阴性的产生，使整个检测过程实验准确可靠，可提高早期检出率，减少医务人员的操作时间，降低成本，减轻病人经济负担。
文档编号C12Q1/68GK101921870SQ200910303328
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者丁国徽, 严安, 李辉, 熊慧, 董辉, 袁国勇, 谢立群, 赵国屏, 车小燕, 金维荣, 陈嘉铮 申请人:上海人类基因组研究中心;上海生物芯片有限公司;铭源医疗发展有限公司