发酵戊糖的细胞的制作方法

专利名称：发酵戊糖的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够将木糖异构化为木酮糖的细胞。本发明还涉及其中使用这类细胞 生产发酵产物例如乙醇的方法。
背景技术：
最近几十年，传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污 染。这与化石燃料的世界储备并非有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性 燃料(如乙醇)可行性的新动机，所述替代性燃料是以每升为基础比无铅汽油释放更少CO2 的无粒子燃烧燃料来源。尽管生物量衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产，但是， 典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此，燃料乙醇生产 的提高会需要使用更低成本的原料。目前，只有衍生自植物生物量的木质纤维素原料能够足量获得，用于代替目前用 于乙醇生产的作物。在大部分木质纤维素材料中，在葡萄糖之后第二常见的糖是木糖。 因此，对于经济上可行的燃料生产工艺而言，己糖和戊糖均必须被发酵形成乙醇。酵母 Saccharomyces cerevisia是有活力的并且充分适合乙醇生产，但是不能使用木糖作为碳 源生产乙醇。另外，没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产量以及高乙醇生产力 将木糖发酵成乙醇的。因此，对下述生物存在需要，所述生物具有这些特性从而能够在商业上有活力地 从木质纤维素原料生产乙醇。发明概述根据本发明，提供了能够发酵(例如醇发酵)和使用木糖作为碳源的细胞。这样 的细胞包含编码木糖异构酶的核苷酸序列，其中木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 3 中公开的氨基酸序列具有至少约70%的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主 来说是异源的。这样的细胞在使用木糖作为碳源时，与野生型丝状真菌相比生产更大量的乙醇。本发明还提供了-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明的细胞发酵含有木糖来源的培养 基，使得所述细胞将木糖发酵成所述发酵产物；-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明定义的还能够利用L-阿拉伯糖的 细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，使得细胞将木糖和L-阿拉伯糖 发酵成为所述发酵产物；和-生产发酵产物的方法，所述方法包括用本发明的细胞和能够使L-阿拉伯糖的细 胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，其中每种细胞将木糖和/或阿拉伯 糖发酵成为所述发酵产物。本发明还提供了本发明的细胞在生产发酵产物的方法中的用途。附图概述
m 1 ^JfTfflTi Saccharomyces cerevisiae 巾·； 白勺IS石马* 自 Bacteroides uniformis ATCC 8492 的木糖异构酶的 pHSIT4-XKSl-xylA(Baun CpO)的质粒图谱。CpO 表示经密码子对优化。图2公开了质粒pPWT080的物理图谱，其序列在SEQ ID no. 4中给出。图3公开了野生型GRE3-基因座的物理图谱(图a)和GRE3-基因座中PWT080的 1拷贝整合(展示引物在何处结合的图b，和展示RKIl-探针在何处结合的图c)。图4公开了放射自显影图，显示CEN. PKl 13-7D中1拷贝质粒pPWT080的正确整 合；图a 染色体DNA制剂的XcmI-消化，与RKIl-探针杂交。第1道CEN. PK113-7D ； 第 2 道:BIE104F1 ；第 3 道:BIE104P1图b 染色体DNA制剂的PsiI-消化，与RKIl-探针杂交。第1道CEN. PK113-7D ； 第 2 道:BIE104F1 ；第 3 道:BIE104P1AGRE3: :PPP代表用含有处于强组成型启动子控制下的基因TALI、TKLU RKIl和 RPEl 的盒代替 GRE3-基因的编码区，Δ GRE3 [TPIlp-TALl-ADHlp-TKLl-PGIlp-RPEl-EN01 p-RKIl]。图5公开了 GRE3-基因座的物理图谱，其中通过PPP-基因TALI、TKLU RKIl和 RPEl的整合代替GRE3-基因的编码区。图a展示SEQ ID5和6引物在何处结合，图b展示 RKIl-探针在何处结合。图6公开了质粒pYI#SIT4的物理图谱。图7公开了质粒pPWT007的物理图谱。图8公开了质粒pPWT042的物理图谱。图9公开了野生型SIT4-基因座(图a)和SIT4-基因座中PWT080的1拷贝整合 (图b，展示引物在何处结合)的物理图谱。

图10公开了 BIE104P1Y9在2%木糖作为唯一碳源上、在若干次预培养后的生长曲 线，和基因组中未整合1拷贝PPWT042的参照菌株的生长曲线。图中用数字表示事件(1) 转移至YNB 1%葡萄糖+1%木糖；(2)转移至YNB 0. 1 %葡萄糖+2%木糖；(3)转移至YNB 2%木糖；(4)转移至YNB 2%木糖(仅BIE104P1Y9)。图11公开了参照菌株BIE104P1和木糖代谢菌株BIE104P1Y9的生长曲线。图12公开了在葡萄糖上预培养的BIE104P1 (图a)、在葡萄糖上预培养的 BIE104P1Y9(图b)和在木糖上预培养的BIE104P1Y9(图c)菌株随时间的木糖和葡萄糖消
耗与乙醇生产。图13公开了质粒pPWT018的物理图谱。图14公开了质粒pPWT006的物理图谱。图15公开了 Southern印迹放射自显影图。用EcoRI以及HindIII 二者消化野生 型菌株CEN. PK113-7D (第1道)和BIE104A2(第2道)的染色体DNA。将所述印迹与特异 性SIT2-探针杂交。图16公开了野生型SIT2-基因座(图a)的物理图谱，和通过质粒pPWT018的整 合引入ara-基因后，之后的分子内重组导致载体和可选择标记物序列的丢失(图b)。标明 了探针的杂交。
图17公开了菌株BIE104A2P1Y9在不同培养基上的生长曲线的图示。图a 在半 乳糖上生长的菌株BIE104A2P1Y9，之后是图中通过以下数字标明的事件(1)转移至阿 拉伯糖+1%木糖，和(2)转移至2%木糖+0.2%阿拉伯糖。图b 在葡萄糖上生长的菌株 BIE104A2P1Y9，之后是(1)转移至1 %阿拉伯糖+1 %木糖和(2)转移至2%木糖+0. 2%阿 拉伯糖。
序列表简沭
SEQ ID NO :1 公开了来自 Bacteroides uniformis ATCC 8492 的野生型木糖异构 Genbank 登记号 AAYH02000036。
酶序列
基酸序列
SEQ ID NO 2公开了衍生自SEQ ID NO 1的经密码子优化的序列。
SEQ ID NO :3 公开了来自 Bacteroides uniformis ATCC 8492 的木糖异构酶的氨SEQIDNO4公开了质粒pPWT080的序列。
SEQIDNO:5公开了正向引物的序列。
SEQIDNO:6公开了反向引物的序列。
SEQIDNO7公开了用于诊断性PCR的多功能正向引物的序列。
SEQIDNO8公开了用于诊断性PCR的多功能反向引物的序列。
SEQIDNO:9公开了正向引物RKIl-探针的序列。
SEQIDNO10公开了反向引物RKI1-探针的序列。
SEQIDNO11公开了正向引物kanMX-盒的序列。
SEQIDNO12公开了反向引物kanMX-盒的序列。
SEQIDNO:13公开了正向引物的序列。
SEQIDNO:14公开了反向引物的序列。
SEQIDNO:15公开了用于诊断性PCR的正向多功能引物序列。
SEQIDNO:16公开了用于诊断性PCR的反向多功能引物序列。
SEQIDNO17公开了质粒pPWT018序列的序列。
SEQIDNO18公开了整合pPWT018的正向引物的序列。
SEQIDNO19公开了整合pPWT018的反向引物的序列。
SEQIDNO20公开了正向引物SIT2-探针的序列。
SEQIDNO21公开了反向引物SIT2-探针的序列。
发明详述
含”(〃
在本说明书和附带的权利要求书通篇中，词语“包含”和“包括”以及变形如“包 comprises"、〃 comprising")、“包括”(〃 includes〃和〃 including")应被 解释为包括性地。也就是说，这些词语旨在告知在上下文允许时可能包括未明确指出的其 它元件或者整数(integer)。本发明涉及包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨 基酸序列与SEQ ID NO :3中公开的氨基酸序列具有至少约70%的同一性，并且其中所述核 苷酸序列对所述宿主是异源的。编码木糖异构酶的核苷酸序列的存在向细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力。“木糖异构酶”(EC 5.3. 1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或反过来的酶。所述酶还已知为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶也可以能 够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(并因此可以被称作葡萄糖异构酶)。本文的木糖 异构酶可需要二价阳离子如镁、锰或钴作为辅因子。因此，本发明的细胞能够将木糖异构化为木酮糖。通过用下述核酸构建体转化宿 主细胞对所述宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力，所述核酸构建体包含编码确定 的木糖异构酶的核苷酸序列。本发明的细胞通过木糖到木酮糖的直接异构化将木糖异构化 为木酮糖。这被理解为表示在木糖异构酶催化的单个反应中木糖被异构化为木酮糖，与分 别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的、木糖通过木糖醇中间产物成为木酮糖的两步转化 相反。木糖异构酶活性单位(U)在本文中可以被定义为在Kuyper et al. (2003，FEMS Yeast Res.4 69-78)所述条件下，每分钟生产Inmol木酮糖的酶量。本发明的细胞参照具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列或与之具有至少约70%序列 同一性的序列来定义。类似地，本发明的细胞可以参照木糖异构酶和编码这类氨基酸序列 的核苷酸序列来定义。SEQ ID NO :3 公开了来自 Bacteroides uniformis ATCC 8492 的木糖异构酶的氨 基酸序列。本发明的细胞包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列，所述木糖异构酶具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列或与之具有至少约70%的序列同一性。优选地，根据本发明的细胞是包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，所 述木糖异构酶的序列与SEQ ID NO 3的氨基酸序列具有至少约75%、优选地至少约80%、 至少约85%、至少约90%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约 96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%或至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少 99%的序列同一性。然而，根据本发明的细胞可包含编码下述木糖异构酶的核苷酸序列，所 述木糖异构酶的序列与SEQ ID NO 3中公开的氨基酸序列具有至少约50%、至少约55%、 至少约60%或至少约70%的序列同一性。序列同一性(或序列相似性)在本文中定义为两条或更多氨基酸(多肽或蛋白 质)序列或两条或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系，所述关系通过比较所述序列来 测定。通常，序列同一性或相似性典型地在被比较的序列的整个长度上比较。然而，可以在 更短的比较窗口中比较序列。在本领域中，“同一性”还表示根据情况通过氨基酸或核酸序 列字符串之间的匹配测定的氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度。测定同一性的优选的方法被设计为给出被测试序列之间的最大匹配。测定同一性 和相似性的方法在公众可获得的计算机程序中被编码。测定两条序列之间同一性和相似性 的优选的计算机程序方法包括例如BestFit、BLASTP, BLASTN和FASTA (Altschul，S. F. et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)，公众可从 NCBI 和其它来源获得(BLAST Manual, Altschul，S.，et al. ,NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)。使用 BLASTP 进行氨基酸序列 比较的优选的参数是缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。使用BLASTP进行核酸 序列比较的优选的参数是缺口开放11. 0、缺口延伸1、DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。任选地，在测定氨基酸相似性程度时，技术人员也可以考虑所谓的“保守性”氨基 酸取代，如本领域技术人员所明白的。
保守性氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的 氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族_羟基侧链的氨基 酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳 香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨 酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为缬氨酸_亮氨酸_异亮氨酸，苯丙氨酸_酪氨酸， 赖氨酸_精氨酸，丙氨酸_缬氨酸和天冬酰胺_谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代 变体是其中所公开的序列中至少一个残基被去除并在其位置中插入一个不同残基的变体。 优选地，氨基酸改变是保守性的。对每种天然存在的氨基酸而言优选的保守性取代如下 Ala 至Ij ser ；Arg 至Ij Iys ；Asn 至Ij gin 或 his ；Asp 至Ij glu ；Cys 至Ij ser 或 ala ；GIn 至Ij asn ；GIu 至Ij asp ；GIy 至Ij pro ；His 至Ij asn 或 gin ；He 至Ij Ieu 或 val ；Leu 至Ij ile 或 val ；Lys 至Ij arg ；gin 或 glu ；Met 至Ij Ieu 或 ile ；Phe 至Ij met, Ieu 或 tyr ；Ser 至Ij thr ；Thr 至Ij ser ；Trp 至Ij tyr ；Tyr 到 trp 或 phe ；和 Val 到 ile 或 leu。根据本发明编码催化木糖转化成木酮糖的酶的核苷酸序列也可以通过其在中度 或优选地在严格杂交条件下与编码下述酶的核苷酸序列杂交的能力来定义，所述酶具有 SEQ ID NO :3中公开的序列或与SEQ ID NO :3具有至少约70%序列同一性的序列。正式地，这类核苷酸序列与编码下述酶的核苷酸序列的反向互补链杂交，例如是 与SEQ ID NO :1或2的反向互补链杂交的序列，所述酶具有SEQ ID NO 3中公开的序列或 与SEQ ID NO 3具有至少约70%序列同一性的序列。严格杂交条件在本文中定义为下述条件，其允许至少约25个、优选地约50个核苷 酸、75或100个和最优选地约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65°C的温度下，在包 含约IM盐、优选地6x SSC(氯化钠、柠檬酸钠)的溶液或具有可比较的离子强度的任何其 它溶液中杂交，和在包含约0. IM盐或更少，优选地0.2x SSC的溶液或具有可比较的离子强 度的任何其它溶液中于65°C下洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地 至少进行1小时洗涤并将洗涤溶液更换至少两次。这些条件通常会允许具有约90%或更多 序列同一性的序列的特异性杂交。中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选地约 200个或更多个核苷酸在约45°C的温度下，于包含约IM盐、优选地6x SSC的溶液或具有可 比较的离子强度的任何其它溶液中杂交，并于室温下，在包含约IM盐、优选地6x SSC的溶 液或具有可比较的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10 小时，并优选地至少进行1小时洗涤并将洗涤溶液更换至少两次。这些条件通常会允许具 有至多50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能够修饰这些杂交条 件，从而特异性鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。为了提高被引入的酶在本发明的细胞中以活性形式表达的可能性，可以改造相应 的编码核苷酸序列，从而针对所选择的酵母细胞优化其密码子使用。密码子优化的若干方 法是本领域已知的。针对酵母的密码子使用来优化核苷酸序列密码子使用的一种优选的方 法是如W02006/077258和/或W02008/000632中公开的密码子对优化技术。W02008/000632 涉及密码子对优化。密码子对优化是这样一种方法，其中编码多肽的核苷酸序列关于其密 码子使用、尤其是使用的密码子对而被修饰，以获得编码所述多肽的核苷酸序列的改进的表达和/或所编码的多肽的改进的生产。密码子对被定义为编码序列中一组两个连续的三 联体(密码子)。作为基因表达和翻译效率的简单度量，本文中使用如Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics 2007，353_58 中所述的密码子适应指数(Codon Adaptation Index, CAI)。所述指数使用来自一个物种的高度表达基因的参照组来评价每种密码子的相对优点 (merits)，并从所述基因中所有密码子的使用频率计算基因的分值。指数评价选择在塑造 密码子使用模式中的有效程度。在这一方面中，预测基因的表达水平来评价病毒基因对其 宿主的适应和在不同生物中进行密码子使用比较是有用的。指数也可给出异源基因表达可 能成功的大致指示。在根据本发明的经密码子对优化的基因中，CAI为0. 6或更多、0. 7或 更多、0. 8或更多、0. 85或更多、0. 87或更多0. 90或更多、0. 95或更多或约1. O。在本发明的细胞中，木糖异构酶对细胞而言典型地是异源的。也就是说，木糖异构 酶具有下述序列，所述序列不作为其存在的生物、细胞、基因组DNA或RNA序列的一部分而 天然存在于所述细胞中。也就是说，木糖异构酶对所述细胞而言是外源的，或者不天然存在 于所述细胞中。因此，编码木糖异构酶的核苷酸序列在所述经转化的宿主细胞中典型地以 活性形式被表达或者能够以活性形式被表达。因此，本发明的细胞是包含下述核酸构建体(即用所述核酸构建体转化)的细胞， 所述核酸构建体包含如上文定义的编码木糖异构酶的核苷酸序列。包含木糖异构酶编码序 列的核酸构建体优选地能够在所述宿主细胞中表达木糖异构酶。用于在细胞中表达异源木糖异构酶序列的方法是本领域技术人员公知的。因此，本发明的细胞是重组细胞。也就是说，本发明的细胞包含下述核苷酸序列、 用下述核苷酸序列转化或用下述核苷酸序列遗传修饰，所述核苷酸序列不天然存在于所述 细胞中。在细胞中重组表达木糖异构酶以及对本发明细胞进行其它遗传修饰的技术是本 领域技术人员公知的。典型地，这类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。这类 方法例如从标准手册如 Sambrook and Russel (2001) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rd edition),Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press 或 F. Ausubel et al. , eds., " Current protocols in molecular biology", Green Publishing and ffileylnterscience,New York(1987)中已知。对真菌宿主细胞进 行转化和遗传修饰的方法从例如 EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102、W000/37671、 W090/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US 6，265，186 中已知。大部分附加体(印isomal)或2 μ质粒是相对不稳定的，在每个世代后在约10_2或 更多细胞中丢失。即便是在选择性生长的条件下，仅60%到95%的细胞保留附加体质粒。 大部分附加体质粒的拷贝数范围为每个cir+宿主细胞中10-40个。然而，质粒并非相等地 分布于细胞间，并且种群中每个细胞的拷贝数存在高度变化。用整合性质粒转化的菌株极 度稳定，即便是不存在选择性压力时也是如此。然而，质粒损失可通过随机重复的DNA之间 的同源重组以约10_3到10_4的频率发生，导致载体序列的成环离开(looping out)。优选 地，稳定整合情况下的载体设计是，在选择标记物基因丢失(也可以通过分子内、同源重组 发生)后，被整合的构建体的成环离开不再可能。优选地，所述基因因此被稳定整合。合适 的整合在本文中被定义为整合进基因组中，其中被整合的构建体的成环离开不再可能。优选地，不存在选择标记物。典型地，核酸构建体可以是质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。根据本发明的细 胞可包含单个或多个拷贝的编码木糖异构酶的核苷酸序列，例如通过使用多拷贝核苷酸构 建体或通过使用具有多拷贝木糖异构酶序列的构建体来实现。核酸构建体可以作为附加体维持，并因此包含用于自主复制的序列，如常染色体 复制序列序列。合适的附加体核酸构建体可以例如基于酵母2 μ或pKDl质粒(Gleer et al. , 1991,Biotechnology 9 :968_975)或AMA质粒(Fierro et al. , 1995,Curr Genet. 29 482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进细胞的基因组中。进 入细胞基因组的整合可通过非同源重组随机发生，但优选地，核酸构建体可以通过同源 重组被整合进细胞的基因组中，如本领域所公知的(见例如W090/14423、EP-A-0481008、 EP-A-0635574 和 US 6，265，186)。典型地，木糖异构酶编码序列应当与能够提供或帮助木糖异构酶序列转录和/或 翻译的一条或多条核酸序列可操作地连接。术语“可操作地连接”是指下述并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它 们以期望的方式发挥作用的关系中。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，所述 启动子或增强子影响所述编码序列的转录。在本文中使用时，“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因转录 的功能，相对于基因转录起点的转录方向而言位于上游，并且在结构上通过DNA-依赖性 RNA聚合酶、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识别。“组成型” 启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调 节下有活性的启动子。能够用于实现编码本发明酶的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核 苷酸序列而言可以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异 源的启动子。然而，启动子对宿主细胞而言可以是同源的，即内源的。本文上下文中合适的启动子包括组成型和诱导型两种天然启动子以及经改造的 启动子，这是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是GAL7、GAL10或 GALl、CYC1、HIS3、ADHU PGL, PH05、GAPDH、ADCl、TRP1、URA3、LEU2、EN01TPI1 禾P AOXl0 其 它合适的启动子包括PDC1、GPD1、PGK1、TEFl和TDH3。在本发明的细胞中，编码木糖异构酶的核苷酸序列的3’ -端优选地与转录终止子 序列可操作地连接。优选地，终止子序列在选择的宿主细胞、如例如选择的酵母物种中是可 操作的。在任何情况下终止子的选择不是关键性的；其可以例如来自于任何酵母基因，尽管 如果来自于非酵母、真核基因时终止子有时可能发挥功能。通常，编码木糖异构酶的核苷酸 序列包含终止子。优选地，这类终止子与预防本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰变的突 变组合(参阅例如Shirley et al.，2002，Genetics 161 1465-1482)。转录终止序列还优选地包含多聚腺苷酸化信号。任选地，适用于本发明的核酸构建体中可存在可选择标记物。在本文中使用时， 术语“标记物”是指编码性状或表型的基因，所述性状或表型允许选择或筛选含有所述标记 物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因，从而可使用适当的抗生素从未经转化 的细胞中选择经转化的细胞。合适的抗生素抗性标记物包括例如二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶、3' -0-磷酸转移酶11(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。尽管对于多倍体 宿主细胞的转化而言抗生素抗性标记物可以是最为便利的，然而优选地使用非抗生素抗性 标记物,如营养缺陷型标记物(URA3、TRP1、LEU2)或S. pombe TPI基因(由Russell P R, 1985, Gene 40 125-130描述)。在一个优选的实施方案中，用核酸构建体转化的宿主细胞 是无标记物基因的。用于构建重组的无标记物基因的微生物宿主细胞的方法公开于EP-A-O 635 574中，并且基于双向标记物如A.nidulans amdS (乙酰胺酶)基因或酵母URA3和LYS2 基因的使用。或者，可以将可筛选的标记物如绿色荧光蛋白、lacL、萤光素酶、氯霉素乙酰转 移酶、葡萄糖苷酸酶并入本发明的核酸构建体中，允许筛选经转化的细胞。可存在于适用于本发明的核酸构建体中任选的其它元件包括但不限于，一条或多 条前导序列、增强子、整合因子、和/或报告基因、内含子序列、着丝点抗体(centromer)、调 聚物和/或基质附着(MAR)序列。本发明的核酸构建体可还包含用于自主复制的序列，如 ARS序列。优选地，木糖异构酶在胞质溶胶中表达。胞质溶胶表达可通过线粒体或过氧化物 酶体靶向信号的缺失或修饰来实现。本发明的细胞可以是任何合适的细胞，如原核细胞如细菌，或真核细胞。典型地， 细胞会是真核细胞，例如酵母或丝状真菌。酵母在本文中被定义为真核微生物，并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门 的所有物种(Alexopoulos, C.J. , 1962, In JntroductoryMycology, John Wiley & Sons, Inc. , New York)。酵母可以通过单细胞原植体的出芽生长，或可通过生物的裂变生长。作为本 发明细胞的一种优选的酵母可属于 Saccharomyces、Kluyveromyces, Candida、Pichia、 Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属。优选地， 酵母是能够厌氧发酵的酵母，更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物，其包括真菌亚门的所有丝状形式。 这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖组成的植物菌丝体。适合用作本发明细胞的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有 利地使用丝状真菌细胞，因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖，并且对噬菌体感染 敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性 需氧的。作为本发明宿主细胞的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma, Humicola、Acremoniurra、Fusarium或Penicillium属。更优选地，丝状真菌细胞可以是 Aspergillusniger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum 或 Rhizopus oryzae 细胞。许多年来，建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有 主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因 于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度酸_、乙醇-和渗 透-耐性，厌氧生长的能力，当然及其高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物 禾中包括 S. cerevisiae、S. bulderi、S. barnetti、S. exiguus、S. uvarum、S. diastaticus、 K. lactis、K. marxianus 或 K fragilis。本发明的细胞可以能够将植物生物量、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油转化成例 如可发酵的糖。因此，本发明的细胞可表达将纤维素转化为葡萄糖单体或将半纤维素转化 为木糖和阿拉伯糖单体所需的一种或多种酶，如纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素 酶)、半纤维素酶(内切或外切木聚糖酶或阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化成葡糖醛酸和半 乳糖醛酸的果胶酶，或能够将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。本发明的细胞优选地是能够进行木糖主动或被动转运进入细胞的宿主。优选地，本发明的细胞能够进行主动糖酵解；和/或显示经过戊糖磷酸通路的通量；和/或展示木酮糖激酶活性，使得由木糖异构化而来的木酮糖可以被代谢成丙酮酸。所述细胞还优选地包含将丙酮酸转化成期望的发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3_羟 基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、反丁烯二酸、苹果酸、衣康酸(itaconic acid)、氨 基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、内酰胺抗生素或头孢菌素所需的这些酶活性。本发明的一种优选的细胞是天然能够进行醇发酵、优选地进行厌氧醇发酵的细 胞。本发明的细胞优选地具有对乙醇的高度耐性、对低PH的高度耐性(即能够在低于约5、 约4、约3或约2. 5的ρΗ下生长)和对有机酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解产物如糠醛 和羟基-甲基糠醛的的高度耐性，和/或对提高的温度的高度耐性。本发明细胞的任何上述特征或活性可以天然存在于细胞中，或者可以通过遗传修 饰引入或修饰。编码木糖异构酶的核苷酸序列典型地被表达，或者能够在经转化的宿主中以活性 形式被表达。因此，宿主细胞中核苷酸序列的表达生产活性木糖异构酶，典型地其比活性在 约30°C下为每mg蛋白质至少约IOU木糖异构酶活性，在约30°C下每mg优选地至少约20、 至少约25、至少约30、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约500、至少约 750或至少约1000U。经转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶的比活性在本文中被定义为 宿主细胞无细胞裂解物(例如酵母无细胞裂解物)的每mg蛋白质的木糖异构酶活性单位 的量。木糖异构酶活性的测定、蛋白质量和无细胞裂解物的制备如本文所述。优选地，编 码木糖异构酶的核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生下述木糖异构酶，其对木糖的Km小于 50、40、30或25mM，更优选地，对木糖的Km约为20mM或更少。本发明的细胞可包含一种或多种提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。具体地，遗 传修饰可导致通过戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部 分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰，与除了引起通量提高的遗传修饰 之外遗传上相同的菌株中的通量相比，所述修饰将所述通量提高至约1. 1、约1. 2、约1. 5、 约2、约5、约10或约20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量在木糖 作为唯一碳源时培养经修饰的宿主，测定木糖消耗的比速率，并在产生任何木糖醇时从木 糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而，戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木 糖作为唯一碳源时的生长速率成比例，优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比 例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μΜΧ)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在 线性相关。木糖消耗的比速率(Qs)等于生长速率(μ)除以在糖上的生物量产率(Yxs)，因 为在糖上的生物量产率是恒定的(在给定的一组条件下厌氧、生长培养基、ΡΗ、菌株的遗传背景等；即Qs = μ /YJ。因此，戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条 件下最大生产速率的提高，除非转运(摄取收到限制)。可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的一种或多种遗传 修饰。这些方式包括例如，实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多 种酶更高的稳态活性水平，和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性 水平的这些改变可以通过(自发或化学或辐射诱导的)突变体的选择和/或编码酶的基因 或调节这些基因的因子的重组DNA技术(例如过表达或失活)来实现。在一种优选的宿主细胞中，遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一 种酶的过表达。优选地，所述酶选自由编码核酮糖-5-磷酸异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构 酶、转酮酶和转醛酶的酶组成的组。可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种 组合。例如可以被过表达的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和5-磷酸核酮糖差向异 构酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转酮酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转 醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶；或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异 构酶和转醛酶；或至少是酶转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮 酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、转酮酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮 糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转醛酶；或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸 核酮糖差向异构酶和转酮酶。在本发明的一个实施方案中，酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷 酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下 述宿主细胞，其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达，因为这样的宿主细 胞已经能够在木糖上厌氧生长。实际上，在一些条件下，仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细 胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率，所述宿主细胞过表达所有四种 酶，即5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外，过表达酶 5_磷酸核酮糖异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞 而被优选的，所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶，因为这些酶中仅一种 的过表达可产生代谢失衡。酶“核酮糖-5-磷酸差向异构酶”(EC 5. 1.3. 1)在本文中被定义为催化D-木酮 糖5-磷酸差向异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸核酮 糖(phosphoribulose)异构酶；赤藓糖_4_磷酸异构酶；磷酸酮戊糖3-差向异构酶；木酮 糖磷酸3-差向异构酶；磷酸酮戊糖向异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖磷 酸-3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶；D-木酮 糖-5-磷酸3-差向异构酶；戊糖-5-磷酸3-差向异构酶；或D-核酮糖-5-磷酸3-差向异 构酶。核酮糖5-磷酸差向异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸差 向异构酶可以通过编码酶的核苷酸序列或者通过与编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的参照 核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列在本 文中称作RPE1。酶“核酮糖5-磷酸异构酶”(EC 5.3. 1.6)在本文中被定义为催化D-核糖5_磷酸 直接异构化为D-核酮糖5-磷酸并且反之亦然的酶。所述酶也已知为磷酸戊糖异构酶；磷酸 核糖异构酶；核糖磷酸异构酶；5-磷酸核糖异构酶；D-核糖5-磷酸异构酶；D-核糖-5-磷 酸酮醇_异构酶；或D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-异构酶。核酮糖5-磷酸异构酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，核酮糖5-磷酸异构酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以 及与编码核酮糖5-磷酸异构酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码核酮糖 5_磷酸异构酶的核苷酸序列在本文中称作RPI1。酶“转酮酶” (EC 2. 2. 1. 1)在本文中被定义为催化下述反应的酶D_核糖5_磷酸 +D-木酮糖5-磷酸 <-> 景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸且反之亦然。所述酶也已知 为羟乙醛转移酶或景天庚酮糖-7-磷酸D-甘油醛-3-磷酸羟乙醛转移酶。转酮酶还可通 过其氨基酸定义。类似地，转酮酶可以通过编码酶的核苷酸序列以及与编码转酮酶的参照 核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编码转酮酶的核苷酸序列在本文中称作TKL1。酶“转醛酶”(EC 2. 2. 1. 2)在本文中被定义为催化下述反应的酶景天庚酮糖 7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸<->D-赤藓糖4-磷酸+D-岩藻糖6-磷酸且反之亦然。所述酶 还已知为二羟基丙酮转移酶；二羟基丙酮合酶；甲醛转酮酶；或景天庚酮糖-7-磷酸D-甘 油醛-3-磷酸甘油酮转移酶。转醛酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，转醛酶可以通 过编码酶的核苷酸序列以及与编码转醛酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。编 码转醛酶的核苷酸序列在本文中称作TALI。本领域技术人员已知用于在本发明的细胞中表达和过表达酶的多种手段。具体 地，可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整 合额外的基因拷贝，通过表达来自附加体多拷贝表达载体的基因，或通过引入包含多拷贝 基因的附加体表达载体)来过表达酶。或者，可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与 之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现本发明宿主细胞中酶的过表达。 尽管启动子优选地对与之可操作地连接的编码序列而言是异源的，但是还优选启动子是同 源的，即对宿主细胞而言是内源的。优选地，与对编码序列而言天然的启动子相比，异源启 动子能够生产更高稳态水平的包含所述编码序列的转录本(或者每单位时间能够生产更 多转录本分子，即mRNA分子)，优选地在可获得木糖或木糖与葡萄糖作为碳源、更优选地作 为主要碳源(即多于50%可获得的碳源由木糖和木糖与葡萄糖组成)、最优选地作为唯一 碳源的条件下。在本文上下文中，合适的启动子包括组成型和诱导型启动子二者，以及经改 造的启动子。用于本发明中的一种优选的启动子还应当对代谢产物(葡萄糖)阻抑不敏感， 和/或应当优选地不需要木糖来诱导。具有这些特征的启动子是可广泛获得的，并是技术 人员已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子，如来自酵母或丝 状真菌的果糖磷酸激酶(ΡΠ0、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3 或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；关于这类启动子的更多细节 可在(W0 93/03159)中找到。其它有用的启动子是编码核糖体蛋白的基因启动子，乳糖酶 基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等等)和烯醇化酶启动子(ENO)。其它 (组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本 发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰，来影响它们的控制特征。用于上述酶过表达的编码序列可优选地对本发明的宿主细胞而言是同源的。然 而，可以使用对本发明宿主细胞而言异源的编码序列。涉及经遗传修饰的宿主细胞中酶的生产时，酶的过表达表示与相同条件下未经修 饰的宿主细胞相比，所述酶以更高水平的酶比活性被生产。通常，这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生 产，或者以更高的稳态水平被生产。类似地，这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞 相比，编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产，或者也以更高的稳态水平被生产。因此， 优选地使用本文所述的适当酶测定法，通过测量宿主细胞中的酶比活性水平，来测定酶的 过表达。或者，可以例如使用酶的特异性抗体，通过量化酶蛋白质的比稳态水平，或者通过 定量编码所述酶的mRNA的比稳态水平，来间接测定酶的过表达。后者可尤其适用于戊糖磷 酸通路，对所述戊糖磷酸通路而言酶测定法不是容易可行的，因为所述酶的底物不可商业 获得。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的 菌株相比时，要过表达的酶被过表达至至少约1. 1、约1. 2、约1. 5、约2、约5、约10或约20 的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及 编码酶的转录本的稳态水平。本发明的细胞可包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰。优选 地，所述一种或多种遗传修饰引起木酮糖激酶的过表达，例如通过编码木酮糖激酶的核苷 酸序列的过表达来实现。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的，或者可以 是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的核苷酸序列 是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。酶“木酮糖激酶”(EC 2.7.1.17)在本文中被定义为催化反应ATP+D-木酮糖 =ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。所述酶还已知为磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或 ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。本发明的木酮糖激酶还可以通过其氨基酸序列定义。类似 地，木酮糖激酶可以通过编码所述酶的核苷酸序列以及与编码木酮糖激酶的参照核苷酸序 列杂交的核苷酸序列来定义。在本发明的细胞中，提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传修饰可以与上 文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰组合。然而，这不是必需的。因此，本发明的宿主细胞可仅包含提高特异性木酮糖激酶活性的一种或多种遗传 修饰。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的本领域可获得的多种手段与 上文针对戊糖磷酸通路酶所述相同。优选地，在本发明的宿主细胞中，与除了引起过表达 的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比，要过表达的木酮糖激酶被过表达至少约1.1、约 1. 2、约1. 5、约2、约5、约10或约20的倍数。还应当理解这些过表达水平可适用于酶活性 的稳态水平，酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。本发明的细胞可包含降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的一种或多种遗 传修饰。优选地，通过一种或多种下述遗传修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活 性，所述遗传修饰降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活。优选地，所述遗 传修饰降低宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的每种内源拷贝或使其表达失活。 宿主细胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基 因，和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶，所述酶氨基酸序 列不同并且鸽子由不同基因编码。还在这类情况下，优选地编码非特异性醛糖还原酶的每 种基因的表达被降低或失活。优选地，通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基 因失活，其中在该语境中，术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列，其(部 分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。
编码要在本发明宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有 醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列。在本发明的宿主细胞中，降低宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰可 以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰和/或提高上述宿主细胞中特异性木酮 糖激酶活性的任何修饰组合。然而，这不是必需的。因此，仅包含下述一种或多种遗传修饰的本发明的宿主细胞明确地包括在本发明 中，所述修饰降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性。酶“醛糖还原酶”(EC 1. 1. 1. 21)在本文中被定义为能够将木糖或木酮糖还原为木 糖醇的任何酶。在本发明的语境中，醛糖还原酶可以是对本发明宿主细胞而言天然(内源) 的并且能够将木糖或木酮糖还原为木糖醇的任何非特异性醛糖还原酶。非特异性醛糖还原 酶催化反应
醛糖 + NAD(P)H + H+^ 糖醇 + NAD(P)+所述酶具有广泛特异性并且也已知为醛糖还原酶；多元醇脱氢酶(NADP+)；糖 醇NADP氧化还原酶；糖醇NADP+I-氧化还原酶；NADPH-戊醛糖还原酶；或NADPH-醛糖还 原酶。这类非特异性醛糖还原酶的一个具体的例子是对S. cerevisiae内源并且由GRE3 基因编码的醛糖还原酶(Traff et al. , 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67 5668-74) 因 此，本发明的醛糖还原酶还可通过其氨基酸序列定义。类似地，醛糖还原酶可以通过编码酶 的核苷酸序列以及与编码醛糖还原酶的参照核苷酸序列杂交的核苷酸序列来定义。可以针对在木糖上、优选地木糖作为唯一碳源上、更优选地在厌氧条件下的生长 来选择自发或(例如通过辐射或化学品)诱导的突变体，使本发明的细胞适应木糖使用。突 变体的选择可以通过包括例如Kuyper et al. (2004，FEMS Yeast Res. 4 :655_664)所述的 培养物连续传代在内的技术来进行，或者通过在恒化器培养中的选择压力下培养来进行。 在本发明的一种优选的宿主细胞中，至少一种上述遗传修饰(包括通过突变体选择获得的 修饰)赋予宿主细胞在木糖作为碳源、优选地作为唯一碳源时、并且优选地在厌氧条件下 生长的能力。优选地，经修饰的宿主细胞基本上不生产木糖醇，例如生产的木糖醇低于检出 界限，或者例如以摩尔为基础少于消耗的碳的约5%、约2%、约1%、约0.5%或约0.3%。本发明的细胞可具有在木糖作为唯一碳源时在需氧条件下以至少约0.05、约 0. 1、约0. 2、约0. 25或约0. 31Γ1的速率，在厌氧条件下以至少约0. 03、约0. 05、约0. 07、约 0. 08、约0. 09、约0. 1、约0. 12、约0. 15或约0. 21Γ1的速率生长的能力。优选地，经修饰的 宿主细胞具有在葡萄糖和木糖(重量比1 1)混合物作为唯一碳源时在需氧条件下以至 少约0. 05、约0. 1、约0. 2、约0. 25或约0. 31Γ1的速率，可行时在厌氧条件下以至少约0. 03、 约0. 05、约0. 1、约0. 12、约0. 15或约0. 21Γ1的速率生长的能力。本发明的细胞可具有至少约200、约250、约300、约346、约350、约400、约500、约 600、约750或约IOOOmg木糖/g细胞/h的木糖比消耗速率。本发明的细胞在木糖上发酵 产物(如乙醇)的产率至少是宿主细胞在葡萄糖上发酵产物(如乙醇)产率的约40、约50、 约55、约60、约70、约80、约85、约90、约95、约98或约99%。更优选地，细胞在木糖上的
生物量产率可等于宿主细胞在葡萄糖上的生物量产率。应当理解，在葡萄糖和木糖上产率的比较中，两种产率均在需氧条件下比较或均在厌氧条件下比较。本发明的细胞可以能够使用阿拉伯糖。因此，本发明的细胞可以能够将L-阿拉伯 糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或需要的发酵产物，例如本文提到的发酵产 物之一。能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物例如S. cerevisiae菌株可以通过修饰细胞， 引入来自合适来源的araA(L_阿拉伯糖异构酶)、araB(L_核酮糖激酶)和araD(L-核酮 糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。这类基因可被引入本发明的细胞中，使其能够使用阿 拉伯糖。这样的通路描述于W02003/095627中。本发明的细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而，本发明的细胞可适用于生产除 乙醇以外的发酵产物。这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌 生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。这类发酵产物可以是例如丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬 酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素或 头孢菌素。用于生产非乙醇发酵产物的一种优选的本发明经修饰的宿主细胞是下述宿主细 胞，所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。在又一个方面中，本发明涉及多种发酵方法，其中使用本发明经修饰的宿主细胞 来发酵包含木糖来源的碳源，如木糖。除了木糖来源以外，发酵培养基中的碳源还可包含葡 萄糖来源。木糖或葡萄糖来源可以是原样的木糖或葡萄糖，或者可以是包含木糖或葡萄糖 单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，如例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉等等。为 了从这类碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可以向发酵培养基中添加或者由经修饰的宿 主细胞生产适当的糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)。在后一情况下，经修饰 的宿主细胞可以被遗传改造为生产和分泌这类碳水化合物。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体 来源的一种额外的优点是其例如通过使用限速量的碳水化合物，使得能够在发酵期间维持 (更)低的游离葡萄糖浓度。这随即会预防阻抑非葡萄糖的糖(如木糖)代谢和转运所需 的系统。在一种优选的方法中，经修饰的宿主细胞发酵木糖以及葡萄糖，优选地同时发酵， 在这种情况下优选地使用下述经修饰的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖阻抑不敏感从而 防止两阶段生长。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含经修饰 的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如酵母)生长的发酵培养基的组成是本领 域公知的。发酵方法是用于生产以下发酵产物的方法，如例如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙 酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、 丙三醇、β -内酰胺抗生素如青霉素G或青霉素V及其发酵衍生物，和头孢菌素。发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存 在氧时运行的发酵方法，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2. 5或约lmmol/ L/h，更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出)，并且其中有机分子发挥电子供体和电 子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能够被氧化磷酸化 氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而 再生NAD+。因此，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3_羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反 丁烯二酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。发酵方法优选地在对经修饰的宿主细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分 酵母或真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约42°C、优选地低于约38°C的温度下进行。对 酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28°C的温度 且高于约20、约22或约25 °C的温度下进行。—种优选的方法是用于生产乙醇的方法，其中所述方法包括步骤(a)用上文定 义的经修饰的宿主细胞发酵含有木糖来源的培养基，其中所述宿主细胞将木糖发酵成乙 醇；和任选地(b)回收乙醇。所述发酵培养基可还包含也被发酵成乙醇的葡萄糖来源。在 所述方法中，体积乙醇生产力优选地为至少约0. 5、约1. 0、约1. 5、约2. 0、约2. 5、约3. 0、约 5. 0或约10. Og乙醇/升/小时。所述方法中的木糖和/或葡萄糖上的乙醇产率至少约50、 约60、约70、约80、约90、约95或约98%。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百 分比。本发明还涉及用于生产发酵产物、如选自下组的产物的方法，所述组由丁醇、乳 酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1， 3-丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成。所述方法优选地包含用上文 定义的经修饰的宿主细胞发酵含有木糖来源的培养基，其中所述宿主细胞将木糖发酵成所 述发酵产物。本发明还提供了用于生产发酵产物、如选自下组的产物的方法，所述组由乙醇、丁 醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基 酸、1，3_丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成。所述方法优选地包含用 上文定义的能够使用木糖以及L-阿拉伯糖二者的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯 糖来源的培养基，从而所述细胞将木糖和L-阿拉伯糖发酵成所述发酵产物。本发明还提供了用于生产发酵产物、如选自下组的产物的方法，所述组由乙醇、丁 醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基 酸、1，3_丙二醇、乙烯、丙三醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成。所述方法优选地包含用 上文定义的细胞和能够使用L-阿拉伯糖的细胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源 的培养基，其中每种细胞将木糖和/或L-阿拉伯糖发酵成所述发酵产物。本发明的方法还可包含发酵产物的回收。进行所述方法的培养基也可含有葡萄糖 来源。根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。优选地，所述方法在微需气 (aerophilic)或氧受限的条件下进行。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时进行的发酵方法，或其中基本不消 耗氧，优选地消耗少于约5、约2. 5或约lmmol/L/h，并且其中有机分子发挥电子供体和电子 受体两种作用。氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。 氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决 定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5. 5、更优选地至少约6、如至 少 7mmol/L/h。
18
以下实施例阐述本发明 实施例除非另有说明，使用的方法是标准生物化学技术。合适的一般方法教科书的例子 ^llf舌 Sambrook et al.，Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989)禾口 Ausubel et al. , CurrentProtocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons，Inc0木糖异构酶活件(如实施例1和2中所测定)可以在37°C下，在含50mM磷酸缓冲液(pH 7. 0)、IOmM木糖、IOmM MgCl2和适 量无细胞提取物的反应混合物中测定木糖异构酶活性。可以通过半胱氨酸-咔唑方法 (Goldstein and McCusker，Yeast 边，1541-1553，1999)测定形成的木酮糖量。或者， 在 30 °C 下使用 Kersters-Hildersson etal. (Kinetic characterization of D-xylose isomerases by enzymatic assays usingD—sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Technol. 9 (1987) 145-148)的酶测定法测定木糖异构酶活性。经转化的S. cerevisiae菌株 的无细胞提取物中木糖异构酶的体外活性取决于二价阳离子(Mg2+或Co2+)。S. cerevisiae 白勺胃ih如 Gietz and Woods (2002 ；Transformation of the yeast by the LiAc/S Scarrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350:87-96)所述进行 S. cerevisiae 的转化。菌落PCR用塑料牙签挑取单个菌落隔离群，并重悬于50μ1 milliQ水中。将样品在 99°C下孵育10分钟。使用5μ 1经孵育的样品作为PCR反应的模板，所述PCR反应使用 Phusion DNA聚合酶(Firmzymes)根据供应商提供的说明书进行。
PCR反应条件 第1步 H
98 °C
”
第2步 10 第3步 15” 第4步 迎 第5步 4’ 第6步 30
”
98 0C
58°C将第2到4步重复30个循环 72 0C
”
72 0C 20 0C
用于木勾舌件测丨定他样品予页处理(^^Π^ΜΜ 3 Φ1ΙΜ ) 向过夜培养物的细胞沉淀物中添加0. 5ml的0. IM MOPS缓冲液(pH7. 5)。将细 胞重悬并转移至已含有0. 5g直径0. 4-0. 5mm玻璃珠的2mlEppendorf管。将所有样品在 Eppendorf管振荡器(IKA VIBRAX-VXR)中于4°C下以最高速剧烈振荡20分钟。将提取物 在HOOOrpm和4°C下离心5分钟。将上清液(是无细胞提取物)转移进新鲜的Eppendorf 管中。用于木糖异构酶活性测定的测定条件(本文通用和如实施例3中测定)以下方法是 Dische-Borenfreud(J. Biol. Chem. (1951) 192，2，583-587)所述方法 的经修饰的版本。将一(l.O)ml底物混合物(IOOmM MOPS pH7. 5、10mM MgCl2UOmM D-木 糖)与50 μ 1 (稀释的)无细胞提取物一式两份在冰上混合。随后将反应管至于50°C水浴
19中30分钟。另外，反应在30°C下也一式两份地进行。通过将反应管至于冰水上，然后添加 0. 2mll. 67% L-半胱氨酸一水合物氢氯化物(Merck)溶液来终止反应。然后通过振荡将所 述混合物充分混合。随后添加6ml H2SO4溶液(190ml水加450ml95-97%&H2SO4),之后立 即添加溶于乙醇中的0.2ml 0. 12% (w/v)咔唑(Merck)。通过振荡将该最终混合物充分混 合，并在室温下静置60分钟。使用塑料杯在560nm下测量吸光度。使用也为酮糖的D(+)_果糖作为参照。为此，精确称重约IOOOmg D-果糖并溶于 50ml体积烧瓶中0. IM MOPs缓冲液，pH 7. 5中。制造范围大致从2到20 μ mole/ml的一系 列稀释。在如上文所述的测定法中使用50 μ 1这些果糖溶液并使用560nm处的吸光度制造 校准曲线。通过将560nm处的吸光度与校准曲线相关联来计算样品的活性。使用 Coomassie Plus Protein Assay (Thermo Scientific)，根据 Bradford 方 法的经修饰的方案测定样品的蛋白质浓度。木糖异构酶的比活性被表述为nmol/mg蛋白 质.mirio实施例1j Bacteroides uniformis ATCC 8492 ^ ^ % ^ ^ Sl ^h Saccharomycescerevisiae 中的表达1. 1木糖异构酶表达载体的构建分析来自Bacteroides uniformis ATCC 8492 的木糖异构酶[E. C. 4. 2. 1. 2]、 GenBank 登记号 AAYH02000036 (SEQ ID NO 1)的密码子使用。如 W02006/077258 和 W02008/000632中所述优化密码子使用(SEQ ID NO :2)。将根据SEQ ID NO :2的基因克隆在S. cerevisiae的TPIl-启动子之前。为了预 防木糖异构酶可能的无效表达，将以下序列至于编码序列之前 ACTAGTAAAAACACATACATAAACTAAAAATG,其中起始密码子加有下划线。在强组成型TPIl-启动子中引入SpeI限制性位点ACTAGT，将序列TCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAAACACATACATAAACTAAAAATG(原始TPI1启动子)改变成TCTTGCTTAAATCTATAACTAGTAAAAACACATACATAAACTAAAAATG。这允许将经密码子优化的木糖异构酶编码序列连接至TPIl-启动子。另外，将终止密码子TAA改变为TAAG，这是酵母中最有效的终止密码子。添加便利 的限制性位点来促进克隆。序列由GeneArt AG(Regensburg，德国)合成。最终的酵母表达构建体pYISIT4-XKSl_xylA(Baun CpO)公开于图1中。1.2酵母转化用构建体pYISIT4-XKSl-xylA(Baun CpO)转化 S. cerevisiae 菌株 CEN. PK113-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRPl MAL2-8 SUC2)和 CEN. PK113-7D 的衍生物，所述衍生 物中GRE3-基因被戊糖磷酸通路非氧化部分的基因(见上文)代替(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRPl MAL2-8SUC2GRE3 [TPIlp-TALl_ADHlp_TKLl_PGIlp-RPEl_EN01p-RKIl])。将转化混 合物涂布于含/不含硫酸铵(Difco)、40mM KPi (pH 6.8)和5mM乙酰胺的酵母碳基(YCB) 上。未经转化的细胞不能在该培养基上生长。使用PCR技术和/或Southern印迹技术表征转化体。实施例2
经转化的酵母菌株在木糖上的牛长2.1培养基组成培养实验在具有以下组成的培养基上培养Saccharomyces cerevisiae菌株 0. 67% (w/v)酵母氮基和葡萄糖、半乳糖或木糖任一，或这些底物的组合(见下文)。对琼 脂平板而言对培养基补充2% (w/v)细菌琼脂。乙醇生产在合成培养基中于30°C下进行摇瓶培养(Verduyn et al.，Yeast8 501-517,1992)。用2M KOH将培养基的pH调节至6. 0之后灭菌。对固体合成培养基而言， 添加1.5%的琼脂。通过用冷冻储存培养物接种500-ml摇瓶中IOOml含适当琼脂的培养基，来制备预 培养物。在30°C下于轨道摇床(200rpm)中孵育后，使用该培养物接种任一摇瓶培养物。用 溶于乙醇中的0.42g I-ITween 80和0. Olg 1_1麦角固醇补充用于厌氧培养的合成培养基 (Andreasen and Stier. J. CellPhysiol.丛23_36,1953 ；禾口Andreasen and Stier. J. Cell Physiol. 43 :271_281，1954)。2. 2培养实验在含2%葡萄糖作为碳源的琼脂平板上培养用pYISIT4-XKSl-XylA(Baun CpO)转 化的Saccharomyces cerevisiae菌株CEN. PK113-7D或组成型表达PPP的其衍生物(见实 施例1)。菌落可见时，使用单个菌落接种含IOOmM木糖、IOOmM葡萄糖和IOOmM半乳糖作为 碳源或其组合的液体培养基。通过在LKB Ultrospec K分光光度计上测量600nm处的光密 度提高来监测生长。2. 3乙醇生产在含2%葡萄糖作为碳源的琼脂平板上培养用pYISIT4-XKSl-XylA(Baun CpO)转 化的Saccharomyces cerevisiae菌株CEN. PK113-7D或组成型表达PPP的其衍生物(见实 施例1)。菌落可见时，使用单个菌落接种合成培养基(Verduyn et al.，上文)。向培养基 中添加葡萄糖、木糖和/或半乳糖作为碳源，范围从每升0到50克。通过在LKB Ultrospec K分光光度计上测量600nm处的光密度提高来监测生长。通过HPLC和/或NMR分析监测随 时间的乙醇生产和糖消耗。实施例33. 1引入非氧化性戊糖磷酸通路的四种组成型表达的基因通过用质粒pPWT080 (图 2)转化 CEN. PKl 1 3-7D (MATa URA3HIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2)，获得组成型表达基因 TALI、TKLl、RKIl 和 RPEl 的 Saccharomyces cerevisiae BIE104P1。在大的禾呈度上，通过使用 GeneArt AG (Regensburg, 德国)合成的合成DNA构建质粒pPWT080。质粒pPWT080的序列在SEQ ID 4中公开。简言 之，质粒PPWT080由GRE3-基因的启动子区组成，之后是位于强组成型启动子控制下的四个 PPP-基因TALI、TKLU RKIl和RPE1，和GRE3-基因的3，非编码序列，如图2中所公开的。 作为可选择标记物，该质粒中存在赋予G418抗性的kanMX-基因和允许转化体在乙酰胺作 为氮源时生长的Aspergillus amdS-基因。整合之后进行分子内重组后，标记物丢失，并且 所述构建体的整合导致GRE3-基因编码区的失活和基因TALI、TKLU RPEl和RKIl的过表 达。转化CEN. PK113-7D 之前，使用限制性酶 SfiI (New EnglandBiolabs)，根据供应
21商提供的说明书线性化PPWT080。将转化混合物涂布于每ml含有IOOyg G418 (Sigma Aldrich)的YPD(每升10克酵母提取物、20克/升胨、20克/升葡萄糖、20克琼脂)上。2到4天后，平板上出现菌落，而阴性对照(即转化实验中不添加DNA)导致空白的 YPD/G418-平板。质粒pPWT080的整合被导向至GRE3-基因座。使用PCR和Southern印迹技术表 征转化体。用SEQ ID 5和6、6和7所示引物进行下述PCR反应，所述PCR反应指示1拷贝质 粒pPWT080的正确整合(见图3)。使用SEQ ID 5和6的引物对检验GRE3-基因座上的正 确整合。如果以多个拷贝整合质粒PPWT080 (头到尾整合)，则SEQ ID 6和7的引物对会给 予PCR-产物。如果不存在后一 PCR产物，则指示1拷贝整合。为了验证使用上述PCR技术鉴定为正确1拷贝整合的转化体中的正确1拷贝整 合，进行Southern印迹分析。为此，使用标准分子生物学技术从野生型菌株CEN. PK113-7D 和转化体中分离染色体DNA。用限制性酶XcmI和PsiI消化染色体DNA，在0. 7%琼脂糖 凝胶上电泳(electroforesed)，并根据制造商的说明书将DNA转移至尼龙膜(Hybond N+, Amersham Pharmacia Biotech)。作为检测质粒pPWT080正确整合的探针，使用衍生自存在于质粒PPWT080中的 RKIl-基因的探针。通过使用SEQ ID 9和10的引物和质粒pPWTOSO作为模板，制造探针。 探针的标记和随后的杂交和洗涤步骤如ECL Direct Labeling and Detection System(GE Life Sciences)的供应商所提议的进行。根据可从图3(图C)演绎的预期的杂交模式，如图4所示的该放射自显影图显示 1拷贝质粒PPWT080的正确整合。所述菌株被命名为BIE104F1。为了能够引入编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因(第3. 2部分)，必须去除通过 质粒PPWT080的整合引入的选择标记物。质粒pPWT080的设计如下通过染色体中pPWT080 的整合，同源序列彼此密切接近。所述设计允许可选择标记物通过这些同源区的自发分子 内重组而丢失。从菌株中去除标记物得到无标记物的菌株，所述无标记物的菌株比含有标 记物的菌株在使用时更加稳定。更特定地，S. cerevisiae的GRE-3基因座上1拷贝pPWT080 的整合后GRE3-基因的启动子区和GRE3-基因的3’非编码区被重复。营养性生长后会发 生分子内重组，尽管以低频率发生。所述重组的频率取决于基因组中同源性和基因座的长 度(未公开的结果)。将培养物的亚级分相继转移至新鲜培养基后，分子内重组会随时间而 累积。为此，从菌落隔离群开始在YPD-2%葡萄糖中培养菌株BIE104F1。使用25μ 1过夜 培养物接种新鲜的YPD-2%葡萄糖培养基。五次系列转移后，测定培养物的光密度并将细胞 稀释至大致5000个/ml的浓度。将100μ 1细胞悬浮液涂布于含30mM KPi (pH 6. 8) ,0. 1% (NH4)2S04、40mM氟-乙酰胺(Amersham)和1.8%琼脂(Difco)的酵母碳基培养基(Difco) 上。与菌株BIE104F1的细胞相同(即无细胞内重组)的细胞仍然含有amdS-基因。对这 些基因而言，氟-乙酰胺是有毒的。这些细胞在含有氟_乙酰胺的培养基上将不能生长并 且不会形成菌落。然而，如果发生了分子内重组，则丢失了可选择标记物的BIE104F1-变体 应当能够在氟_乙酰胺培养基上生长，因为它们不能将氟_乙酰胺转化成抑制生长的化合 物。这些细胞会在所述琼脂培养基上形成菌落。
使用SEQ ID 5和6、7和8对由此获得的氟-乙酰胺抗性菌落进行PCR分析。如 果可选择标记物的重组如所预期地(如图5中公开)发生，SEQID 5和6的引物会给出条 带。结果是GRE3-基因的编码区被四个基因TKL1、TALI、RKIl和RPEl代替。在这种情况 下，使用SEQ ID 7和8引物的PCR反应不应得到PCR产物，因为引物7在应当在外重组 (out-recombined)的区域中发挥引物作用(见图3，图b)。如果用这些引物获得了条带，则 表示基因组中完整质粒PPWT080的存在，因此未发生重组。如果SEQ ID 5和6的引物不产生PCR产物，则已发生重组，但是其方式是完整的 质粒PPWT080已在基因组外重组。不仅可选择标记物丢失，而且四个PPP基因也丢失。事 实上已恢复野生型酵母。对显示期望的PCR结果的隔离群进行Southern印迹分析(参阅上文)。结果展示 于图4中。在Southern印迹中展示(如能够从图3演绎而来的)正确条带模式的菌株之 一是命名为BIE104P1的菌株。3. 2引入组成型表达的编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因改进如图1中公开的质粒pYISIT4-XKSl_xylA(Baun CpO)，从而允许转化体的 G418选择。为此，使用限制性酶MluI和SacII从质粒pYISIT4-XKSl_xylA (Baun)(图1)上 切下含有位于TPIl-启动子控制下的xylA-基因和位于TDHl-启动子控制下的XKSl-基因 的4630bp插入物。用限制性酶Acc65I消化如图6中公开的质粒pYI#SIT4。使用SEQ ID 11 和 12 的引物，通过 PCR 分离质粒 p427TEF (Dualsystems Biotech AG)上存在的允许在Ε. coli (卡那霉素)和S. cerevisiae (G418)中选择的卡那霉素-抗性 标记物(kanMX)。以如下方式设计SEQ ID 12的引物序列，使得kanMX-片段中的MluI-位 点丢失，这保持得到的质粒(PPWT007，见下文)中的MluI-位点是独特的。使用用于亚克 隆的 Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒(Invitrogen)，将 PCR 产物亚克隆进 pCRII-TOPO 载体中。使用正确的克隆，用限制性酶Acc65I切割kanMX-抗性标记物。该片段与经消化 的质粒pYI#SIT4的连接得到图7中公开的pPWT007。用限制性酶MluI和SacII切割质粒pPWT007。纯化所述载体后，连接 ρYISIT4-XKS1 -xy 1A (Baun)的上述 4630bp MluI-SacII 片段。得到的质粒被称作 pPWT042， 公开于图8中。用质粒pPWT042 转化菌株 BIE104Pl(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1MAL2-8SUC2GRE3 [TPI lp-TALl-ADHlp-TKLl-PGI lp-RPEl-EN01p-RKI 1])(见 3· 1 部分)。转化 ΒΙΕ104Ρ1 之 前，根据供应商提供的说明书，使用限制性酶SfiI线性化PPWT042。将转化混合物涂布于每 ml含有100 μ g G418 (Sigma Aldrich)的YPD (每升10克酵母提取物、20克/升胨、20克
/升葡萄糖、20克琼脂)上。2到4天后，平板上出现菌落，而阴性对照(即转化实验中不添加DNA)得到空白的 YPD/G418-平板。用SfiI消化质粒pPWT042后，其整合被指向基因组中的SIT4-基因座 (Gottlin-Ninfa and Kaback(1986)Molecular and Cellular Biology Vol. 6, No. 6, 2185-2197)。使用PCR和Southern印迹技术表征转化体。使用SEQ IDs 13与14和14与15所示引物、使用Phusion DNA聚合酶
23(Finnzymes)进行PCR反应，所述PCR反应指示1拷贝质粒pPWT042的正确整合。如图9中所公开的，使用引物对SEQ ID 13和14，检验SIT4-基因座上的正确整 合。也可以用引物对SEQ ID 15和16检验SIT4-基因座中质粒的正确整合(图9)。如果质 粒pPWT042以多个拷贝被整合(头到尾整合)，则SEQ ID 14和15的引物对会给予PCR-产 物。如果不存在后一 PCR产物，则指示质粒pPWT042的1拷贝整合。基因组中整合了 1拷贝质粒pPWT042的菌株被命名为BIE104P1Y9。3. 3培养实验使用菌株BIE104P1和BIE104P1Y9的单菌落隔离群接种补充有2 %葡萄糖的 YNB-培养基(Difco)。将接种的烧瓶在30°C和280rpm下孵育约16小时。在600nm下测定 过夜培养物的光密度。以0. 2的起始0D600，用过夜培养物接种补充有葡萄糖和木 糖的YNB-培养基。将细胞于30°C和280rpm下培养过夜。随后以0. 2的0D600接种含2% 木糖和0. 葡萄糖的YNB培养基。存在于后一培养基中的葡萄糖的分钟量被两种菌株迅速消耗。以0. 2的0D600转 移至含2%木糖作为唯一碳源的YNB后，仅BIE104P1Y9能够在约4周的非常长的lag期后 在所述培养基上生长。当600nm处的光密度达到至少2. 0的数值时，以0. 2的起始0D600 将细胞转移至含有含2%木糖的新鲜YNB培养基的烧瓶中。如图10所示将其重复多次。图片清楚地展示了菌株BIE104P1Y9在含2%木糖作 为唯一碳源的矿物培养基上迅速并有效地生长，而丢失了整合的质粒PPWT042的参照菌株 则不能。3. 4木糖异构酶活性使用菌株BIE104P1和BIE104P1Y9的单菌落隔离群接种YPD_2%葡萄糖。将接种 的烧瓶在30°C和280rpm下大约孵育16小时。测定过夜培养物在600nm下的光密度。通过 离心收获细胞。将沉淀物用0. IM MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸；Sigma)缓冲液，pH 7. 5洗 涤一次并储存于-20°C下，直至进行分析。分析结果概括于下表中。
权利要求
包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO3中示出的氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主来说是异源的。
2.根据权利要求1的细胞，其为真核细胞。
3.根据权利要求1或2的细胞，其为酵母细胞。
4.I^igtX^lJ^3 ^iMM, ^] Saccharomyces> Kluyveromyces> Candida^ Pichia> Schizosaccharomyces、Hansenula、Klockera、Schwanniomyces 或 Yarrowia 属的酵母细 胞。、
5.根据权利要求4的细胞，其中所述酵母细胞是物种S.cerevisiae、S.bulderi、 S. barnetti> S. exiguus>S. uvarum> S. diastaticus、K. lactis、K. marxianus 或 K. fragilis 的细胞。
6.根据权利要求1或2的细胞，其为丝状真菌细胞。
7.根据权利要求6的细胞，其中所述丝状真菌细胞是Aspergillus、Penicillium、 Rhizopus、Trichoderma、Humicola、Acremonium 或 Fusarium 属的。
8.根据权利要求7的细胞，其中所述丝状真菌细胞是物种Aspergillusniger、 Aspergillus oryzae> Penicillium chrysogenum 或 Rhizopus oryzae 白勺细胞。
9.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞包含一种或多种遗传修饰，所述 遗传修饰导致a.所述细胞中木糖转运提高；b.木酮糖激酶活性提高；c.通过戊糖磷酸途径的通量提高；d.醛糖还原酶活性降低；e.对分解代谢物阻遏的敏感性降低；f.对乙醇、渗量或有机分子的耐性提高；或g.副产物的生产减少。
10.根据权利要求9的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致编码戊糖磷酸通路的 非氧化部分的酶至少一种下述基因的过表达，所述基因。
11.根据权利要求10的细胞，其中所述基因是编码5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮 糖差向异构酶、转酮酶或转醛酶的基因。
12.根据权利要求10或11的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致至少编码转酮酶 和转醛酶的基因过表达。
13.根据权利要求9到12中任一项的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致编码木 酮糖激酶的基因过表达。
14.根据权利要求8到13中任一项的细胞，其中被过表达的所述基因是对所述细胞来 说内源的基因。
15.根据权利要求9到14中任一项的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰导致所述细 胞中非特异性醛糖还原酶活性的降低。
16.根据权利要求15的细胞，其中所述一种或多种遗传修饰降低编码非特异性醛糖还 原酶的内源基因的表达，或降低所述非特异性醛糖还原酶的活性。
17.根据权利要求16的细胞，其中通过缺失所述基因的至少部分或通过破坏所述基因 使所述基因失活。
18.根据权利要求16或17的细胞，其中所述细胞中编码非特异性醛糖还原酶的每种基 因的表达被降低。
19.根据前述权利要求中任一项的细胞，所述细胞具有使用L-阿拉伯糖的能力。
20.根据权利要求9到19中任一项的细胞，其中基因TAL1、TKL1、RPE1和RKIl被过表达。
21.根据权利要求9到20中任一项的细胞，其中GRE3-基因的编码区通过用包含基因 TALI、TKLl、RPEl和RKIl的核苷酸序列来代替所述编码区而被失活。
22.根据权利要求9到21中任一项的细胞，其中来自Lactobacillusplantarum的基因 araA> araB #口 araD ,Lii。
23.根据权利要求9到22中任一项的细胞，其中所有被表达的基因被组成型表达或组 成型过表达。
24.根据权利要求23的细胞，其中一种或多种组成型表达或组成型过表达的基因被稳 定整合进所述细胞的基因组中。
25.根据权利要求24的细胞，其中所有组成型表达或组成型过表达的基因被稳定整合 进所述细胞的基因组中。
26.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用根据前述权利要求中任一项的细胞发 酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成为所述发酵产物。
27.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用权利要求19到23中任一项定义的细胞 发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖和L-阿拉伯糖 发酵成为所述发酵产物。
28.用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用权利要求1到18中任一项中定义的细 胞发酵至少含有木糖来源和L-阿拉伯糖来源的培养基，其中每种细胞将木糖和/或阿拉伯 糖发酵成为所述发酵产物。
29.根据权利要求26到28中任一项的方法，所述方法包括回收所述发酵产物。
30.根据权利要求26到29中任一项的方法，其中所述培养基还含有葡萄糖来源。
31.根据权利要求28到30中任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、 3_羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1，3-丙 二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、β -内酰胺抗生素和头孢菌素。
32.根据权利要求26到31中任一项的方法，其中所述方法是厌氧的。
33.根据权利要求26到32中任一项的方法，其中所述方法是需氧的，优选地在氧受限 的条件下进行。
34.本发明的细胞在用于生产发酵产物的方法中的用途。全文摘要
本发明涉及包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的细胞，其中所述木糖异构酶的氨基酸序列与SEQ ID NO3中示出的氨基酸序列具有至少约70％的序列同一性，并且其中所述核苷酸序列对所述宿主是异源的。本发明的细胞可用于生产发酵产物如乙醇的方法中。这类方法可包含用本发明的细胞发酵含有木糖来源的培养基，使得所述细胞将木糖发酵成为所述发酵产物。
文档编号C12P7/10GK101965401SQ200980108010
公开日2011年2月2日 申请日期2009年3月5日 优先权日2008年3月7日
发明者保罗·克莱斯森, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·苏勒库姆·范, 比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森, 简·米特斯卡·拉恩·范德 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司