玉米植物事件mon87460以及用于其检测的组合物和方法

专利名称：玉米植物事件mon87460以及用于其检测的组合物和方法
技术领域：
本文公开了包含表达冷休克蛋白质的重组DNA的转基因细胞、种子和植物，该冷 休克蛋白质使得植物具有提高的应激耐受性和/或提高的产率。本文还包括制备、使用和 检测这样的细胞、种子和植物的方法。具体而言，本发明涉及名为M0N87460的应激耐受的 玉米植物，以及检测样品中M0N87460DNA的存在的方法和组合物。
背景技术：
农场主和种子生产者渴望获得具有改良的农学性状的转基因植物，该农学性状例 如产率、环境压力耐受性、虫害抗性、除草剂耐受性、改良的种子组成等。尽管在植物育种中 的巨大努力已经在希望的性状上获得了重大进展，但将特定DNA引入植物基因组的能力还 能够为产生具有改良性状和/或独特性状的植物提供了进一步的可能性。

发明内容
本文提供了涉及名为M0N87460的转基因水分亏缺应激耐受的玉米植物、其后代 和种群的组合物和方法。一方面，本发明提供了名为M0N87460的转基因玉米植物和所述植物的种子，这样 的种子已通过2008年1月31日寄出的货品保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，被 指定保藏号PTA-8910。本发明的另一方面包括植物M0N87460的后代植物、种子或该植物和 种子的可再生部分。本文还提供了包含SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO -J或SEQ ID NO 24的后代植物或种子或者该植物和种子的可再生部分。本发明的另一方面提供了包含玉米植物M0N87460的转基因/基因组接合区的多 核苷酸。提供的多核苷酸包含至少一个选自SEQ IDNO=I-SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :25及 其互补序列的转基因/基因组接合核酸分子，其中所述接合分子跨越转基因插入位点。本 发明的一个方面是包含SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :4中的任一序列或SEQ IDNO :25的玉米 种子及其植物材料。本发明还涉及M0N87460事件的玉米细胞的细胞核，其中所述细胞核包含含有提 供改良的水分亏缺耐受性的异源多核苷酸插入片段的染色体，其中所述异源多核苷酸包含 SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :4中的任一序列。特别感兴趣的是其中异源多核苷酸包含表达cspB基因的截短的水稻肌动蛋白启动子和其中所述截短的水稻肌动蛋白启动子邻近玉米 基因组序列SEQ ID NO :5的染色体。在某些实施方式中，提供了包含SEQ ID N0:1和含有 与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的玉米染 色体。在某些实施方式中，异源转基因插入片段的5’末端可以重叠SEQ ID NO 1的3’末 端。在某些实施方式中，玉米染色体可以包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :24。在某些实施 方式中，本发明的染色体位于玉米细胞内，该玉米细胞还包含用于表达草甘膦抗性的5-烯 醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4EPSPS)蛋白质的第二种未连接的异源多核苷酸。本 发明还提供了包含本发明的任意玉米染色体的植物或种子。本发明还提供了从具有包含 SEQ ID NO :1和含与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因 插入片段的染色体的玉米种子制备的加工食物或饲料产品，其中该加工食物或饲料产品包 含可检测量的含有序列SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2或其互补序列的多核苷酸。在某些实 施方式中，食物或饲料产品包括玉米面、玉米粉、玉米麸、玉米油和玉米淀粉。在某些实施方 式中，多核苷酸可包含核苷酸序列SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4或其互补序列。在其它实施 方式中，多核苷酸还可包含 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO :24 中 含有的核苷酸序列。根据本发明的另一方面，核苷酸引物对被用在DNA检测方法中，其中当用在核酸 扩增方法中时，该引物对产生了包含SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :4中任一序列的扩增子。以 该方式产生的扩增子中SEQID NO=I-SEQ ID NO :4中的任一序列的检测用于鉴别以该检测 方法分析的样品中来自玉米植物M0N87460中的核酸的存在。这些方法包括(a)将包含 M0N87460基因组DNA的样品与DNA引物对接触；和(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增 子；和(c)检测所述扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO I-SEQ ID NO :4。根据本发明的另一方面，提供了检测样品中特别地对应于玉米植物M0N87460DNA 的DNA存在的方法。这些方法包括(a)将含有M0N87460DNA的样品与包含SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 4中的任一序列的DNA探针、或在严格杂交条件下与来自玉米事件M0N87460的基因 组DNA杂交但在严格杂交条件下不与非M0N87460玉米植物DNA杂交的与SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 4基本同源的DNA分子接触；(b)使样品和探针经受严格杂交条件；和(c)检测探针 与玉米植物M0N87460DNA的杂交。根据本发明的另一方面，提供了产生水分亏缺应激耐受的玉米植物的方法，且该 方法包括将事件M0N87460的第一亲本纯合玉米植物与缺乏水分亏缺应激耐受性状的第二 亲本纯合玉米植物杂交的步骤，从而产生水分亏缺应激耐受的杂交后代植物。在某些实施 方式中，提供了产生干旱耐受的玉米植物的方法，该方法包括将包含SEQ IDNO 1和含可操 作地与cspB基因连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的第一亲本玉 米植物与第二亲本玉米植物杂交，从而产生多个干旱耐受的后代植物。在其他实施方式中， 插入片段可包含SEQ ID NO 7或SEQ ID NO :24。本发明的另一方面为通过使用DNA扩增反应和两个引物组确定玉米事件 M0N87460的后代的接合性的方法。第一引物组被用于扩增M0N87460玉米DNA，第二个引物 组被用于扩增包含M0N87460基因组DNA中的转基因插入位点的天然玉米序列。当用于扩 增的模板是M0N87460纯合的玉米植物DNA时，仅由第一引物组产生扩增子。当用于扩增的 模板是M0N87460杂合的玉米植物DNA时，第一和第二引物组均产生扩增子。
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本发明还包括其基因组中包含SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :4中任一序列的杂交玉米 种子，其中在用于产生所述杂交种子的杂交中至少一个亲本为M0N87460。下面具体描述了本发明的其他具体实施方式
。附图简述

图1提供了 pM0N73608的质粒图谱。图2表明了玉米植物M0N87460中转基因插入片段的基因组构成。图3提供了 M0N87460的转基因和基因组DNA接合区的序列(SEQ ID NO 24)。玉 米基因组侧翼DNA序列以小写字母显示。由pM0N73608插入的转基因序列以大写字母显示。
具体实施例方式本文称为“M0N87460”或"CspB-Zm事件M0N87460”的转基因玉米植物对水分亏缺 应激是耐受的，这是由于在所述转基因植物的细胞中表达来自大肠杆菌的cspB蛋白质的 结果。使用水分亏缺应激耐受的玉米将会给玉米生产者提供重要益处，例如在年平均降雨 量不足以支持野生型玉米植物的农业高效生产的西部干旱地区的耕地提供高5-10%的玉 米产量。此外，与野生型玉米植物相比，M0N87460玉米植物通过在干旱条件下提供较高玉 米产量为中部、东部和南部玉米带提供了干旱保障的益处。在玉米通常在灌溉下生长的区 域中，玉米生产者也能受益于节省的灌溉成本。如本文所使用的，“水分亏缺”是指当植物获得水分的速率不能补充植物消耗水分 的速率的时期。长时期的水分亏缺被俗称为干旱，其可导致作物损失，即使是具有本发明的 染色体的作物。对于植物的生长速率而言，如果存在地下水的储备，缺乏雨水或灌溉可能不 会立即产生水应激。生长在地下水充足的土壤中的植物在没有雨水或灌溉的情况下可以存 活数日，而不会对产量产生负面影响。而生长在干燥土壤中的植物容易在水缺乏的极短时 间内遭受负面影响。严重的水应激会导致枯萎和植物死亡；中等程度的干旱会导致产量降 低、生长阻碍或发育迟缓。植物可以从一定时期的水应激中恢复，而不会严重影响产量。但 是，授粉时期的水应激会对产量降低造成不可逆转的影响。因此，在玉米生长周期中用于观 察水应激耐受性的有用时期是抽穗之前的后营养生长阶段。水应激耐受性的测试通常是通 过与对照植物的对比完成的。例如，本发明的植物比对照植物在水分亏缺的情况下以更高 的产量存活。在实验室和田间试验中，可以通过给予本发明的植物和对照植物少于最佳施 水的对照植物的水和测量性状的差异来模拟干旱。通过自交玉米系用载体pM0N73608(图1)进行的土壤杆菌(Agrobacterium)介导 的转化来产生玉米植物M0N87460。该载体包含由水稻肌动蛋白启动子、水稻肌动蛋白内含 子和tr7 3’聚腺苷酸化序列调控的cspB编码区，和由CaMV 35S启动子和NOS 3’聚腺苷酸 化序列调控的nptll编码区。通过具体的分子分析来鉴定由载体PM0N73608产生的事件。当重组DNA插入到细胞核染色体中的位置上时，在植物中发生转基因事件。在统 计学上，任意两个独立的转基因事件相同是不可能的。由特定事件再生的植物通常具有性 状上的一致性。并不是所有的转基因事件都提供本发明的转基因植物的种子、植物或细胞 核，这是由于存在许多种因素，例如染色体中重组DNA的位置、拷贝数和完整性、其他DNA的 意外的插入等。因此，通过筛选转基因植物或其后代种子的增强的水分亏缺耐受性来识别 理想的转基因事件。
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已知植物中外源基因的表达受它们的染色体位置的影响，这有可能是由于染色质 的结构(例如异染色质)或转录调控元件(例如增强子)接近整合位点的邻近性(Weising 等人，Ann. Rev. Genet 22:421-477,1988)。出于该原因，为了识别具有导入的目的基因的 最佳表达的植物，通常需要筛选大量的植物。例如，已在植物和其他生物体中观察到，导入 的转基因的表达水平在植物中存在很大差别。在表达的空间或时间模式中也有可能存在差 异，例如在不同的植物组织中转基因的相对表达的差异，其可能与导入的基因构建体中存 在的转录调控元件所预期的模式不对应。具有理想的转基因表达水平或模式的植物可使用 常规的育种方法通过有性杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。这种杂交的后代维持了原 始转化体的转基因表达特性。该策略被用于确保在多种品种中的可靠的基因表达，这些品 种良好地适应于当地的生长条件和市场需求。使用Southern印迹分析对pM0N73608转化所产生的事件进行筛选，得到插入数 (玉米基因组内的整合位点的数目)、拷贝数(一个基因座内的T-DNA的拷贝数)、插入盒 的完整性和骨架序列的缺失。探针包括完整的cspB和nptll编码区，以及它们相应的启动 子、内含子和聚腺苷酸化序列和载体质粒骨架。从约140个初始转化体中，通过基于拷贝数 和用于表型分析的骨架分析以识别具有cspB表达的改良表型的植物对事件进行选择。基 于温室的水分亏缺耐受测试的结果确认具有水分亏缺耐受性的许多独立转化体。在田间生 长条件下，对22个选择的水分亏缺耐受的转化体进行的田间测试识别到10个改良的事件， 其被进一步测试它们的水分亏缺耐受性及产量提高和稳定性。这些进一步的分析的结果确 认M0N87460具有优良的改良表型。M0N87460的大量分子鉴定表明，该事件包含单个T-DNA 插入片段以及cspB和nptll盒的各一个拷贝。Northern印迹分析确认在M0N87460中产生 了预期大小的cspB和nptll的转录产物。该数据还令人意外地证明，在M0N87460中不存 在土壤杆菌的右边界片段，并出现调控cspB基因表达的水稻肌动蛋白启动子的截短，因而 仅存在启动子DNA的(pM0N73608中存在的844bp的)108bp。进行PCR和DNA序列分析来确定5’和3’插入片段与植物基因组的接合、确认插 入片段内元件的构成(图2)，和确定玉米植物M0N87460中插入片段的完整DNA序列(SEQ ID NO 5)。分析确认，在M0N87460中原位(in planta) T-DNA与来自pM0N73608的相应序 列相同。序列分析还识别到M0N87460插入片段的1060bp的5’和1260bp的3’侧翼序列。 与用于转化的自交系野生型DNA的序列进行对比显示，在M0N87460T-DNA的整合位点处出 现了玉米基因组DNA的22bp的缺失。为了确定有性杂交的后代是否包含感兴趣的转基因/基因组DNA，能够检测到 M0N87460转基因/基因组DNA的存在是有利的。此外，根据要求上市前批准和对源自重组 作物的食品进行标记的规定，检测M0N87460的方法是有用的。有可能通过任何公知的核酸 检测方法(例如聚合酶链反应(PCR)或使用多核苷酸探针的DNA杂交)来检测转基因的存 在。这些检测方法通常使用对作为DNA构建体的转基因部件的遗传元件(例如启动子、前 导序列、内含子、编码区、3’转录终止子、标记基因等)具有特异性的DNA引物和探针分子。 这样的方法对于区别不同的转基因事件(特别是使用相同的转基因DNA构建体产生的那些 转基因事件)可能是无用的，除非邻近插入的转基因DNA的基因组DNA序列是已知的。本 发明提供了用于检测M0N87460的新型转基因/基因组DNA边界接合的序列和测定。除非另外定义，所用所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域技术人员的通常理解的意义相同。通常，所用的命名法和下面所述的制备和实验室程序是本领域公知的 和常规使用的。在这些过程中使用常规方法，例如在现有技术和各种通用参考书中提供的 方法。除非另外说明，本说明书文字中的核酸序列是按照5’到3’的方向(从左向右读)给 出的。根据规定，提供的核酸序列可能是DNA或RNA;正如本领域技术人员公知的，公开其中 的一个必然限定了另一个。此外，如本领域技术人员公知的，公开了本文给出的核酸序列必 然限定了其互补序列。当术语是单数形式时，本发明人还设想了以该术语的复数形式描述 本发明的方面。所用的命名法和下面所述的实验室程序是本领域公知和常规使用的。当与 通过引用方式结合在本文中的参考文献中所用的术语和定义存在差异时，本发明所用的术 语以给出的定义为准。所用的其他技术术语具有它们在所属技术领域中使用的如众多技术 词典所示例的常规含义。分子生物学中常用术语的定义可参见Rieger等人，Glossary of Genetics !Classical and Molecular,5th edition,Springer-Verlag :New York,1991 ；禾口 Lewin, Genes V, Oxford University Press :New York,1994。如本文所用的，术语“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并包括可与玉米植物 M0N87460育种的所有植物品种。转基因“事件”是通过用异源DNA(即包含目的转基因的核酸构建体)转化植物细 胞、再生通过将转基因插入到植物的基因组中得到的植物群体、以及选择特征在于插入到 特定基因组位点的特定植物而产生的。具有重组DNA杂合或纯合的染色体的相同细胞核的 转基因后代被认为代表相同的转基因事件。一旦针对性状的转基因已被导入植物，该基因 就可通过杂交被导入与第一植物性相容的任何植物中，而无需直接转化第二植物。当在育 种程序中使用该事件时，异源DNA和邻近插入DNA的侧翼基因组序列将会被转入后代中，且 通过向植物基因组中导入异源DNA所产生的增强的性状会在接受该异源DNA的后代中维 持。术语“事件”还指由于包含插入的DNA(例如原始转化体和由自交产生的后代)的 一个亲本系与不包含插入的DNA的亲本系有性杂交，在接受插入DNA (包括目标转基因)的 后代中存在来自原始转化体的DNA (包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列)。 术语“后代”是指根据本发明制备的亲本植物的任一世代的后代。转基因“事件”因此可为 任何世代的。术语“事件”是指原始转化体和包含异源DNA的转化体的后代。术语“事件” 还指通过转化体与包含该异源DNA的另一品种之间的有性异交所产生的后代。即使在重复 的回交成回交亲本后，来自转化亲本的插入的DNA和侧翼DNA也存在于杂交后代的相同染 色体位置上。本发明涉及源自M0N87460的事件M0N87460DNA、植物细胞、组织、种子和加工产 品。M0N87460玉米植物可以自花授粉，以产生M0N87460多核苷酸纯合的自交系。纯合 种子可以生长以产生用于与其他自交玉米植物杂交而产生杂合杂交玉米种子的纯合后代 M0N87460事件玉米植物。M0N87460杂交玉米种子可生长成为与对照植物相比表现出水分 亏缺耐受性和在应激条件下具有增加的产量的杂交玉米植物。可以来自M0N87460的产品包括由玉米事件M0N87460产生的食品和商品。这样的 食品和商品预期包含(如果在充分水平检测的话)诊断该商品和食品中玉米事件M0N87460 物质的存在的多核苷酸。这样的食品或商品的例子包括但不限于玉米油、玉米面、玉米粉、 玉米麸、玉米蛋糕、玉米淀粉，以及意图作为动物或其它的食物源消费的任何其他食品、意图作为填充剂或意图作为化妆用途的化妆品组合物中的组分等。还可以理解的是，两种不同的转基因植物可进行交配，以产生包含两种独立地 隔离加入的外源基因的后代。适当后代的自交可产生对加入的两种外源基因纯合的植 物。或者，包含单个外源基因的自交系可以杂交，产生对各基因为杂合的且可用于产生 由于各外源基因的表达而表现出多种有益表型的杂交玉米植物的杂交种子。通常用 于不同性状和作物的育种方法的描述可参见各种参考文献，例如Allard，“Principles of Plant Breeding, "John Wiley & Sons， NY， U. of CA, Davis, CA, 50-98,1960 ； Simmonds, "Principles of Crop Improvement,，，Longman, Inc. , NY, 369-399,1979 ； Sneep 禾口 Hendriksen, "Plant Breeding Perspectives,，，Wageningen(ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation，1979。本发明特别感兴趣的是开发表 达cspB蛋白质和来自土壤杆菌菌株CP4的草甘膦抗性5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸 合成酶(CP4EPSPS)蛋白质(其使植物具有草甘膦的耐药性)(美国专利5633435)的 M0N87460事件玉米植物。“草甘膦”是指N-膦酰甲基甘氨酸及其盐。N-膦酰甲基甘 氨酸是对广谱植物物种具有活性的公知的除草剂。草甘膦是Roundup (Monsanto Co.)的活性成分，Roundup 是在环境中具有相当短的半衰期的安全的除草剂。草 甘膦是Roundup 除草剂(Monsanto Co.)的活性成分。使用“草甘膦除草剂”处理 是指使用Roundup 、Roundup Ultra 、Roundup pro 除草剂或任何其他含草甘 膦的除草剂制剂。市售的草甘膦制剂的例子包括但不限于Monsanto Company销售的 ROUNDUP 、ROUNDUP ultra、ROUNDUP ultramax、ROUNDUP weathermax, ROUNDUP CT、ROUNDUP extra、ROUNDUP biactive、 ROUNDUP B ι ο F ο R c E、RODEO 、POLARIS 、SPARK 和 ACCORD 除草剂，它们均包含异丙基铵盐形式的草甘膦；Monsanto Company销售 的ROUNDUP DRY和RIVAL 除草剂，它们包含铵盐形式的草甘膦；Monsanto Company销售的ROUNDUP GE0F0RCE，其包含钠盐形式的草甘膦；和Syngenta Crop Protection销售的TOUCHDOWN 除草剂，其包含三甲基锍盐形式的草甘膦。当应用 到植物表面上时，草甘膦在整个植物系统中移动。草甘膦由于其抑制莽草酸途径(该途径 提供了芳香氨基酸合成的前体)而具有植物毒性。草甘膦抑制植物中发现的5-烯醇丙酮 酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)。通过表达细菌EPSPS变体和植物EPSPS变体(这些变 体对草甘膦具有较低的亲和力，因而在草甘膦的存在下可以保持它们的催化活性)，可以获 得草甘膦耐受性(美国专利 No. 5，633，435、5，094，945、4，535，060 和 6，040，497)。如本文所用的，当提到“分离的DNA分子”时，是指单独或与其他组成组合存在的、 但不处于其天然环境中的DNA分子。例如，在玉米基因组DNA内天然发现的编码序列、内含 子序列、未翻译的前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要它们还在玉米基因组中，就 不认为是与玉米基因组分离的。但是，这些组件中的各个和这些组件的亚部分，只要该结构 和组件不是在玉米基因组内，在本发明的范围内就被认为是“分离的”。出于本发明的目的，无论其是否存在于用来转化产生M0N87460事件的玉米细胞 的质粒内、存在于事件M0N87460的基因组内，或以可检测的量存在于源自事件M0N87460的 组织、后代、生物样品或商品中，任何转基因核苷酸序列(即插入到玉米植物事件M0N87460 的细胞基因组中的DNA的核苷酸序列)将会被认为是分离的核苷酸序列。如果DNA分子可从来自植物或种子或植物器官的细胞、组织，或勻浆提取的话，或如果DNA分子可作为来自 植物或种子或植物器官的细胞、组织或勻浆提取的DNA或RNA的扩增子产生的话(以上任 一种均源自从事件M0N87460获得的这类材料)，核苷酸序列或由此获得的任何片段将会被 认为是分离的或可分离的。对于该问题，如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的交接序列 以及也包含这些交接序列的源自事件M0N87460的核苷酸序列也被认为是分离的或可分离 的，无论这些序列是否存在于事件M0N87460的细胞的基因组内或以可检测的量存在于源 自事件M0N87460的组织、后代、生物样品或商品中。如本文所用的，转基因/基因组接合区是被插入到基因组中的转化载体的异源 DNA与玉米植物基因组DNA连接的点。接合多核苷酸跨越转基因/基因组接合区，且在任何 特定的转基因植物事件中都是新颖的。因此，在生物样品中检测接合多核苷酸可鉴别特定 植物事件的存在。在本发明中，样品中SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :4接合多核苷酸的存在可 鉴别样品中M0N87460DNA的存在。“探针”是其上连接常规可检测的标记或报告分子(例如放射性同位素、配体、 化学发光剂或酶)的多核苷酸。探针与目标核酸链互补，在本发明的情况中，探针与来自 M0N87460的基因组DNA链(无论是来自M0N87460植物还是来自包含M0N87460DNA的样品) 互补。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括聚酰胺和其他特异性 地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的探针物质。DNA引物是通过核酸杂交与互补目标DNA链退火以在引物和目标DNA链之间形成 杂化物，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下沿着目标DNA链延伸的分离的多核苷 酸。本发明的DNA引物对或DNA引物组是指用于例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规 多核苷酸扩增方法扩增目标核酸序列的两个DNA引物。DNA探针和DNA引物通常是11多核苷酸或更长，通常是18多核苷酸或更长、24多 核苷酸或更长、30多核苷酸或更长。选择具有足够的长度的探针或引物，以在高严格性杂交 条件下与目标序列特异性地杂交。尽管可以通过常规方法设计保留与目标序列杂交能力的 不同于目标序列的探针，优选地本发明的探针和引物与目标序列具有完全的序列相似性。制备和使用多核苷酸探针和引物的方法描述在例如Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol. 1-3, ed. Sambrook 等 人’ Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989(hereinafter, " Sambrook 等 Α 1989 “ ) ；Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel 等人’ Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York，1992 (定期更新)(下文称为〃 Ausubel 等人，1992”)；禾口 Innis 等人，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press =San Diego, 1990。例如，通过使用用于该目的的计算机程序(例 如 Primer(Version 0. 5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA))可从如已知序列获得PCR DNA引物对。本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA分子杂交。任何常规核酸杂交 或扩增方法均可用于鉴别样品中来自转基因植物的DNA的存在。也被称为核酸部分的多核 酸分子或其片段在某些情况下能够特异性地与其他核酸分子杂交。如本文所用的，如果两 个分子能够形成反平行双链核酸结构，则这两个核酸分子被称为能够特异性地相互杂交。 如果核酸分子具有完全互补性，则一个核酸分子被称为是另一核酸分子的“互补序列”。如
10本文所用的，当一个分子的每个核苷酸均与另一个分子的核苷酸互补时，分子被称为具有 “完全互补性”。如果两个分子在至少常规的“低严格性”条件下能够以允许它们彼此保持退 火的稳定性相互杂交的话，则这两个分子被称为“最低互补的”。类似地，如果两个分子在常 规的“高严格性”条件下能够以足以允许它们保持彼此退火的稳定性相互杂交的话，这两个 分子被称为“互补的”。常规的严格性条件描述在Sambrook等人，1989，和Haymes等人，In Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach, IRL Press, Washington,DC(1985) 中。因此，偏离完全互补性是允许的，只要该偏离不会完全排除分子形成双链结构的能力即 可。为了使核酸分子用作引物或探针，仅需要在所用的特定的溶剂和盐浓度下在序列中具 有能够形成稳定的双链结构的足够互补性即可。如本文所用的，基本同源序列为在高严格性条件下特异性地与其所对比的核酸序 列的互补序列杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适的严格性条件(例如在约45°C下使 用6. Ox氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在50°C下再使用2. Ox SSC洗涤)是本领域技术 人员已知的，或可参见 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50°C下约2. Ox SSC的低严格 性条件到50°C下约0.2x SSC的高严格性条件。此外，洗涤步骤中的温度可从室温下(约 22°C)的低严格性条件上升至约65°C的高严格性条件。温度和盐均可以变化，或者温度或 盐浓度中的任一个可以维持恒定而另一个变量改变。在优选的实施方式中，本发明的多核苷酸将与SEQ ID NO :1_7所示的一个或多个 核酸分子或其互补序列或片段在中等严格条件下(例如约2. Ox SSC和约65°C)杂交。在 特别优选的实施方式中，本发明的核酸将与SEQ ID N0:1-7所示的一个或多个核酸分子或 其互补序列或片段在高严格性条件下杂交。如本文所用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指使用扩增技术(例如PCR)合成的 多核苷酸。本文所用的术语“扩增子”特别排除可能在DNA扩增反应中形成的引物二聚体。对于使用特定的扩增引物对扩增目标核酸序列(例如通过PCR)，“严格条件”为 允许引物对仅与目标核酸序列(具有对应的野生型序列(或其互补序列)的引物将与其结 合)杂交并优选在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物(扩增子)的条件。术语“(目 标序列)特异性的”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标 序列杂交。源自邻近转基因插入DNA的植物基因组序列的引物对的成员位置与插入的DNA序 列间隔一定距离，该距离可为一个核苷酸碱基对至多达约两万个核苷酸碱基对。同样，源自 转基因插入DNA的引物对的成员位置与植物基因组序列接合区间隔一定距离，该距离可为 一个核苷酸碱基对至约转基因插入片段的全长。扩增子的长度可为引物对加上一个核苷酸 碱基对，但优选为约50个碱基对或更长，例如多达500个或甚至于1000个核苷酸长度的总 长度。通常，在PCR反应中较小尺寸的扩增子更加可靠地产生，允许使用较短的循环时间， 且可以容易在琼脂糖凝胶上分离和显色或适应于TaqMan测定，例如末端和实时Taqman。或 者，引物对可源自插入的异源DNA两侧的基因组序列，以产生包含完整的插入多核苷酸序 列(例如从SEQ ID NO :5分离的正向引物和从SEQ ID NO :6分离的反向引物)的扩增子， 其扩增了包含被插入到M0N87460基因组中的pM0N73608DNA片段的DNA分子，该插入片段 包含约3309个核苷酸(SEQ ID NO 7)，如图3中的大写字母所示。
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为了确定来自有性杂交的玉米植物是否包含来自本发明的玉米植物M0N87460植 物的转基因植物基因组DNA，对从玉米植物组织样品中提取的DNA使用包括源自M0N87460 植物基因组中邻近插入的异源DNA (转基因DNA)插入位点的DNA序列的第一引物和源自插 入的异源DNA的第二引物的引物对进行多核苷酸扩增方法，以产生用于鉴别M0N87460植物 DNA的存在的扩增子。用于鉴别的扩增子取决于引物位置具有特定的长度，并包含用于鉴 别特定的植物事件基因组DNA的特定的接合多核苷酸序列。可以通过例如测序扩增子DNA 或通过与特定探针杂交来确定扩增子中接合多核苷酸序列的存在。在本发明中，用于鉴别 M0N87460的存在的扩增子的DNA序列包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2。更具体而言，在本 发明的实施方式中，用于鉴别M0N87460的存在的扩增子的长度为68nt并包含SEQ ID NO 2，并可通过与包含SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 16中任一序列的标记探针 杂交进行检测。可以通过本领域已知的各种扩增方法中的任何方法(包括聚合酶链反应 (PCR))来实现多核苷酸的扩增。扩增方法是本领域已知的，并描述在特别是美国专利 No. 4, 683, 195和 4，683，202 中和PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications, ed. Innis等人，Academic Press, San Diego, 1990中。已经发展了 PCR扩增方法来扩增多 达22kb (千碱基对)的基因组DNA和多达42kb的噬菌体DNA (Cheng等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91 :5695-5699，1994)。这些方法和DNA扩增领域中已知的其他方法可用于实施本 发明。可以通过使用源自本发明提供的序列的引物扩增来自M0N87460种子或从已经保藏 在ATCC中(保藏号PTA-8910)的种子生长的植物的这类DNA分子，然后使用PCR扩增子或 其克隆的DNA片段的标准DNA测序确认来自M0N87460的异源DNA插入片段或侧翼基因组 DNA序列(如果需要的话进行校正)。基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒包含在合适的反应条件下特异性地与目标 DNA杂交并扩增用于鉴别的扩增子的DNA引物分子。其中扩增子包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的由M0N87460DNA产生的任何长度的扩增子是本发明的一个方面。本领域技术人 员将会认识到第一和第二DNA引物分子并不要求仅由DNA构成，还可以仅由RNA、DNA和RNA 的混合物，或DNA、RNA或不作为一个或多个聚合酶的模板的其他核苷酸或其类似物的组合 构成。此外，本领域技术人员将会认识到，本文所示的探针或引物应该具有至少约11、12、 13、14、15、16、17、18、19和20个连续核苷酸的长度，且选自如SEQ ID NO :1和SEQ ID N0: 3 (随意地命名为5，接合区)、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :4(随意地命名为3，接合区)、 SEQ ID NO :5(随意地命名为5，侧翼序列)、SEQ ID NO :6(随意地命名为3，侧翼序列)和 SEQ ID NO :7(插入的转基因序列)所示的核苷酸序列。当选自SEQ ID NO :5_SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列时，具有至少约21-约50或更多连续核苷酸的长度的探针和引物也是 可能的。试剂盒可以提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或许多本领域已知的用于鉴别的扩 增子的检测方法。本发明的一个目的为包含与SEQID NO :5或SEQ ID NO :6的玉米基因组 区域的任何部分和与SEQ IDNO 7的转基因插入区域的任何部分同源或互补的DNA引物的 试剂盒。特异性地确认为可用于DNA扩增方法中的引物对的是扩增与M0N87460的5’转 基因/基因组区域的一部分同源的用于鉴别的扩增子的SEQ ID NO :8和SEQ ID N0:9，其 中该扩增子包含SEQ ID NO :2。可作为DNA引物的其他DNA分子可通过DNA扩增领域的技术人员从公开的M0N87460转基因/基因组DNA序列中进行选择。可以通过多种技术来检测通过这些方法产生的用于鉴别的扩增子。这样的一种方 法为 Genetic Bit 分析(Nikiforov 等人，Nucleic Acid Res. 22 :4167_4175，1994)，其中设 计了与邻近的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸 固定在微量滴定板的孔内。在进行目标区的PCR后(使用插入序列中的一个引物和邻近侧 翼基因组序列中的一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸杂交，并作为使用DNA聚 合酶和对预期的下一碱基特异性的标记二脱氧核苷三磷酸(ddNTP)的单碱基延伸反应的 模板。读数可以是基于荧光或ELISA的。信号由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而表示 存在转基因/基因组序列。另一方法为如Winge (Innov. Pharma. Tech. 00 =18-24,2000)描述的焦磷酸测序 (Pyrosequencing)技术。该方法中，设计了与邻近基因组DNA和插入的DNA接合区重叠的 寡核苷酸。该寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物杂交(插入序列中的一个引物和侧 翼基因组序列中的一个引物)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷 酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和荧光素的存在下进行温育。单独地加入DNTP，且掺入造成了所测 量的光信号。光信号由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸表明存在转基因/基因组序 列。Chen等人，(Genome Res. 9 =492-498, 1999)描述的荧光偏振是可用于检测本发明 的扩增子的方法。通过使用该方法，设计了与基因组侧翼和插入DNA接合区重叠的寡核苷 酸。该寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物杂交(使用插入的DNA中的一个引物和侧 翼基因组DNA序列中的一个引物)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下进行温 育。单碱基延伸造成了 ddNTP的掺入。可以使用荧光计通过偏振的改变来测量掺入。偏振 中的改变由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而表明存在转基因/基因组序列。Taqman (ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA)被描述为检测和定量 DNA序列的存在的方法，且在厂商所提供的说明书中有完整的描述。简而言之，设计了与基 因组侧翼和插入DNA接合区重叠的FRET (荧光共振能量转移)寡核苷酸探针。在耐热聚合 酶和dNTP的存在下，FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序 列中的一个引物)进行循环。FRET探针的杂交造成了荧光部分(例如6FAM 和VIC )的 裂解和释放，离开猝灭染料(例如用于常规探针的TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)或用于 MGB探针的非荧光小沟结合化合物)。当使用TAMRA或MGB探针时，在PCR过程中聚合酶切 割结合的探针，以FRET不能发生的程度分离荧光团和猝灭剂，因而荧光信号表明存在转基 因/基因组序列。Tyangi等人(Nature Biotech. 14 :303_308，1996)中已描述用于序列检测的分子 信标(Molecular Beacon)。简而言之，设计了与侧翼基因组和插入DNA接合区重叠的FRET 寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构使其包含维持荧光和猝灭部分紧密接近的二级结构。 在热稳定聚合酶和dNTP的存在下FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧 翼基因组序列中的一个引物)进行循环。在成功的PCR扩增后，FRET探针与目标序列的杂 交导致了探针二级结构的破坏以及荧光和猝灭部分的空间分离。荧光信号由于成功的扩增 和杂交表明存在侧翼/转基因插入序列。其他描述的方法(例如微流体(美国专利公布No. 2006068398、美国专利No. 6，544，734))可用于分离和扩增DNA样品。光学染料可用于检测和定量特定的DNA分子 (TO/05017181)。已描述了包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳 米珠的纳米管装置(W0/06024023)。可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域公知的方法研发DNA检测试剂盒。该 试剂盒可用于识别样品中的玉米植物M0N87460DNA，并可用于包含M0N87460 DNA的玉米植 物的育种方法中。试剂盒包含用作引物或探针且与SEQ ID N0:l-7中的至少一部分同源 或互补的DNA分子。DNA分子可用在DNA扩增方法(PCR)中，或作为核酸杂交方法(例如 Southern分析和Northern分析)中的探针。在本发明的另一方面中，用于鉴别M0N87460 DNA的存在的优选的本发明多核苷 酸具有 SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :4 或 SEQ IDNO :25 所示的序列。SEQ ID NO :1-SEQ ID NO 4和较大的基因组/转基因接合多核苷酸(例如SEQ ID NO :5_7中的接合多核苷酸) 还可在植物育种方法中用作标记来识别遗传杂交的后代，与〃 DNA markers protocols, applications, and overviews : (1997) 173-185, Cregan 等人，eds. , Wiley-Liss NY 中描 述的简单序列重复DNA标记分析的方法类似。可以使用本领域技术人员已知的许多方法 来检测探针与目标DNA分子的杂交，这些方法包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于 抗体的标签和化学发光标签。本发明的另一方面中，本发明的优选的标记核酸分子与SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :7所示的核酸序列或其互补序列或任一的片段具有80%-100%或 90%-100%的序列同一性。在本发明的进一步的方面中，本发明优选的标记核酸分子与SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :7所示的序列或其互补序列或任一的片段具有95%-100%的序列同 一性。本文还提供了缺乏选择标记基因或缺乏完整的选择标记基因的水分亏缺耐受的 玉米植物。可以通过包括以下步骤的方法获得这样的植物将包含赋予水分亏缺耐受性的 异源转基因插入片段和选择标记基因的玉米染色体暴露于一种或多种重组诱导剂，并选择 包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段的玉米植物，其中选择标记基因已被完全 或部分除去或其中选择标记基因已被破坏。赋予水分亏缺耐受性并包含选择标记的异源 转基因插入片段包括但不限于包含SEQID NO 7的插入片段或包含SEQ ID NO=I的插入片 段、与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子、选择标记基因和SEQID NO 2。包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段和选择标记基因的玉米染色体还包括 但不限于包含SEQ ID NO :24的玉米染色体、已保藏在ATCC(保藏号PTA-8910，ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA，美国)的玉米植物及其后代的玉米染色体。赋予水分亏 缺耐受性的异源转基因插入片包括但不限于包含SEQ ID NO 1和与cspB基因可操作地 连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段，以及包含SEQ ID N0:1和与cspB基因可操 作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段，其中插入片段的5’端与SEQ ID NO 1 的3’末端重叠。本文所用的短语“可操作地连接的”是指核酸序列的连接以使得一个序列可为连 接的序列提供所需的功能。当谈到启动子时，“可操作地连接的”是指启动子与目标序列相 连，从而该目标序列的转录受该启动子的控制和调节。当目标序列编码蛋白质时和当希望 获得该蛋白质的表达时，“可操作地连接的”是指启动子与序列连接的方式使得所获得的转 录体能被有效地翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录融合体且希望获得编码蛋白质的表达的话，则形成连接以使得得到的转录体中的第一翻译起始密码子为编码序列的起始 密码子。或者，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合体且希望获得编码蛋白质的表达 的话，则形成连接以使得包含在5’未翻译的序列中的第一翻译起始密码子与启动子相关， 且进行连接从而得到的翻译产物与编码所需蛋白质的翻译开放阅读框的同框(in frame) 0 可以可操作地连接的核酸序列包括但不限于提供基因表达功能的序列(即基因表达元 件，例如启动子、5’非翻译区、内含子、蛋白质编码区、3’非翻译区、聚腺苷酸化位点和/或 转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组 酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素耐药性标记、生物合成 基因)、提供可记分的标记功能的序列(即报道基因)、有利于体外或体内序列操作的序列 (即多接头序列、位点特异性重组酶的靶序列)和提供复制功能的序列(即细菌复制起点、 自主复制序列、着丝粒序列)。重组诱导剂可包括电离辐射和/或用于消除或改变多核苷酸序列的任何化合物、 蛋白质和/或核酸。重组诱导剂因此包括但不限于提供同源重组、非同源重组、位点特异 性重组和/或基因组修饰的试剂。重组诱导剂提供的基因组修饰因此包括但不限于插入、 缺失、反转和/或核酸置换。已经公开了使用重组诱导剂在植物中诱导基因修饰(Lloyd等 人，Proc Natl Acad Sci USA.，102(6) =2232,2005) 重组剂可为天然的或工程化的。位 点特异性重组酶包括但不限于Cre_重组酶、FLP重组酶、翻转酶(Flippase)等。重组诱 导剂还包括但不限于核酸酶。可用的核酸酶包括但不限于大范围核酸酶(meganuclease) 和锌指核酸酶。其他重组诱导剂包括但不限于同源置换序列和非同源置换序列。在某些 实施方式中，重组诱导剂可包括核酸酶和同源或非同源置换序列。在某些实施方式中，可以 使用能够切割在SEQ ID NO :24的Iox位点之间的选择标记的ere-重组酶。已经公开了植 物中Iox位点侧邻序列的Cre-介导的消除(美国专利No. 5，658，772)。通过诱导目标序列中双链断裂、提供缺乏选择标记基因的同源置换序列或其部分 以及回收其中置换序列已经整合入原驻留序列(resident sequence)的位置的复植物，可 以实现选择标记基因、其部分或其他序列的消除或破坏。同源置换序列可在用于染色体中 的驻留序列用置换序列同源重组和置换的双链断裂的两个末端包含同源序列。已经公开 了作物(例如烟草和玉米)中靶向双链断裂诱导的同源重组(Wright等人，Plant J. 44， 693，2005 ;D，Halluin 等人，Plant Biotech. J. 6 :93，2008)。还有可能通过非同源末端 连接或非同源末端连接和同源重组的结合将同源置换序列插入到目标核酸酶切割位点中 (综述参见Puchta，J. Exp.Bot. 56,1,2005) 0还公开了通过非同源末端连接或非同源末 端连接和同源重组的结合将同源置换序列靶向插入到特定植物基因组位点中(Wright等 人，Plant J. 44，693，2005)。在某些实施方式中，可以使用催化在选择标记基因中至少一 个位点特异性的双链断裂的大范围核酸酶。已证明大范围核酸酶适用于遗传修饰，因而 它们可被改造或工程化(W0/06097853AU W0/06097784AU W0/04067736A2)或合理设计 (U. S. 20070117128A1)，以在与特定目标序列完全匹配或非常相关的识别序列内进行切割。 在这些情况中，给定合理大小的目标(例如选择标记基因序列)，人们可选择或设计将在目 标选择标记基因序列内进行切割的核酸酶。或者，可以使用催化选择标记基因中至少一个 位点特异性的双链断裂的锌指核酸酶。也公开了这种锌指核酸酶、工程化特异性锌指核酸 酶的能力以及它们在植物中用于提供同源重组的用途(W0 03/080809、WO 05/014791、WO07014275、W008/021207)。通过诱导目标序列中的双链断裂、提供缺乏选择标记基因或其部分的非同源置换 序列以及其中回收非同源置换序列已经整合入目标序列中的植物，也可以实现选择标记基 因、其部分或其他序列的消除或破坏。在某些实施方式中，非同源置换序列可以在两个末端 包含与双链断裂的两个末端的单链序列互补的单链序列，以提供置换序列和双链断裂的非 同源末端连接。本文还提供了从头产生与事件M0N87460的玉米植物基本相同的玉米植物的方法 及生成的植物。这样的方法可以包括使用重组诱导剂。与事件M0N87460的玉米植物基本 相同的玉米植物包括但不限于包含具有含与cspB基因可操作地连接的启动子的异源转 基因插入片段的染色体的玉米植物，其中转基因插入片段存在于与M0N87460中的相同或 基本相同的染色体位置或染色体整合位点。可与cspB基因可操作地连接的启动子包括但 不限于水稻肌动蛋白启动子，包括截短的水稻肌动蛋白启动子、玉米RS81启动子、玉米 RS324启动子、玉米A3启动子、病毒启动子等。在某些非限制性的实施方式中，人们可以选 择、改造或设计核酸酶，以在与SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、非转基因玉米植物中跨越SEQ ID NO :5和SEQ IDNO :6的玉米染色体序列或SEQ ID NO :23中的目标序列完全匹配或紧密 相关的目标识别序列中进行切割。在这些或其他非限制性的实施方式中，包含与cspB基因 可操作地连接的启动子的遗传修饰的玉米植物可通过以下步骤产生i)将包含与cspB基 因可操作地连接的启动子和与目标序列基本相同的侧翼序列的同源置换序列及切割目标 序列的核酸酶导入玉米植物细胞中；和ii)选择其中同源置换序列已整合入目标序列中的 玉米细胞或玉米植物。考虑到已发现本文公开的玉米染色体目标序列为转基因插入的有利 位点，本发明还提供了获得具有一个或多个赋予水分亏缺耐受性以外的性状的转基因或包 含赋予水分亏缺耐受性的cspB以外的基因的转基因插入本文公开的目标位点中的植物。还提供了重组诱导剂和不同的同源置换序列对于包含一个或多个被整合到与赋 予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段相同的染色体位置的附加基因的水分亏缺耐受 的玉米植物的可用性。与赋予水分亏缺耐受性的基因相同位置的附加基因的整合是有利 的，因为附加基因所携带的任何性状都将会与水分亏缺耐受性性状遗传连接，从而有利于 育种。在某些实施方式中，附加的一个或多个基因可以是与赋予水分亏缺耐受性的驻留异 源转基因插入片段协同工作的基因，以赋予额外的水分亏缺耐受性。在某些实施方式中，附 加的一个或多个基因可以是提供水分亏缺耐受性以外的不同和有用性状的一个或多个基 因。因此，赋予一个或多个性状的一个或多个基因包括但不限于赋予除草剂耐药性、虫害 抗性、在水充足条件下具有更高产量、改良的种子油、改良的种子淀粉、改良的种子蛋白和/ 或改善的氮利用的基因。可通过包括如下步骤的方法获得这样的植物将包含赋予水分亏 缺耐受性的异源转基因插入片段的玉米染色体暴露于包含一个或多个附加基因的同源置 换序列，并选择包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段和一个或多个附加基因的 玉米植物。在某些实施方式中，可通过使用附加的重组诱导剂来促进同源置换序列的插入。 因此，所用的附加重组诱导剂包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶或在双链断裂诱导 同源重组的理想位点诱导双链断裂的其他试剂。赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片 段包括但不限于包含SEQ IDNO 1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启 动子的插入片段，以及其中插入片段的5’末端与SEQ ID NO :1的3’末端重叠的包含SEQID NO :1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子插入片段。在某些实 施方式中，同源置换序列包含用于驻留异源转基因插入片段中的选择标记基因被一个或多 个附加基因置换的序列。赋予水分亏缺耐受性并包含选择标记的异源转基因插入片段包括 但不限于包含SEQ ID NO :7的插入片段和包含SEQ ID NO 1和与cspB基因可操作地连 接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段。包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入 片段和选择标记基因的玉米染色体也包括但不限于包含SEQ ID NO :24的玉米染色体、已 保藏在ATCC(保藏号PTA-8910)的玉米植物及其后代的玉米染色体。在某些实施方式中， 附加的一个或多个基因也可被插入SEQ IDNO :5和/或SEQ ID NO :6中。还可以预想到，通过位点特异性重组，上述附加的一个或多个基因可被整合到包 含SEQ ID NO :1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子和一个或多个 Iox位点的染色体中。用于该目的的位点特异性重组系统包括但不限于FLP重组酶/FRT、 ere重组酶/Iox及其组合。已公开了位点特异性重组系统在植物和其他真核生物中的用 途(美国专禾U No. 5，801，030、美国专利No. 5，658，772和美国专利No. 6，262，341)。因此， 在包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :24的玉米染色体和已经保藏(ATCC保藏号PTA-8910) 的玉米植物或其后代的玉米染色体中Iox位点特异性重组位点的存在用于将附加基因位 点特异性地整合到这些玉米染色体中。在某些实施方式中，侧邻玉米染色体中的Iox位点 的选择标记序列首先被ere-重组酶切割，从而在染色体中留下单个Iox位点。然后可以将 附加基因引入包含附加基因和可操作地连接的Iox位点的环形DNA分子中，并在染色体中 遗留的单个Iox位点处整合到玉米染色体中。已经公开了用于产生环形DNA分子和位点特 异性地将基因整合到染色体中的示例性方案(Vergunst等人，Nucleic Acid Res. 26(11)， 279，1998)。本文还提供了在SEQ ID NO :24插入的染色体位置引入Iox以外的位点特异性 重组位点和在这些重组位点处插入附加基因。下面的实施例意图显示本发明某些优选实施方式的实例。本领域技术人员知道， 下面实施例中公开的技术代表了本发明人已发现能够很好实施本发明的途径，因此可认为 构成了实施本发明的优选实施方式的实施例。但是，本领域技术人员根据本发明的公开可 理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对公开的具体实施方式
做出许多改变，且 仍然能够获得相同或相似的结果。实施例实施例1.转基因玉米植物的产生通过土壤杆菌介导的LH59玉米用载体pM0N73608 (图1)的转化产生转基因玉米 植物。该载体包含由水稻肌动蛋白启动子、水稻肌动蛋白内含子和tr73’聚腺苷酸化序列 调控的cspB编码区及由35SCaMV启动子和NOS 3’聚腺苷酸化序列调控的nptll编码区。表1 :pM0N73608中遗传元件的总结
1权利要求
一种包含SEQ ID NO1和含可操作地与cspB基因连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的玉米染色体。
2.根据权利要求1所述的玉米染色体，其中所述插入片段的5’末端与SEQID N0:1的3’末端重叠。
3.根据权利要求1所述的玉米染色体，其中所述玉米染色体还包含SEQID NO :2。
4.根据权利要求2所述的玉米染色体，其包含SEQID NO :7或SEQ ID NO :24。
5.一种具有包含SEQ ID NO :1和含可操作地与cspB基因连接的截短的水稻肌动蛋白 启动子的异源转基因插入片段的染色体的玉米植物。
6.根据权利要求5所述的玉米植物，其中所述染色体还包含SEQIDNO :2。
7.根据权利要求6所述的玉米植物，其中所述染色体包含SEQID NO :7或SEQ ID NO24。
8.根据权利要求5所述的玉米植物，还包含用于表达草甘膦抗性EPSPS的DNA。
9.一种来自具有包含SEQ ID NO :1和含可操作地与cspB基因连接的截短的水稻肌动 蛋白启动子的异源转基因插入片段的染色体的玉米植物的种子。
10.根据权利要求9所述的种子，其中所述染色体进一步包含SEQID NO :2。
11.根据权利要求10所述的种子，其中所述染色体包含SEQID NO :7或SEQ ID NO:24。
12.—种由具有包含SEQ ID NO :1和含可操作地与cspB基因连接的截短的水稻肌动 蛋白启动子的异源转基因插入片段的染色体的玉米种子制备的加工食物或饲料产品，其中 所述加工食物或饲料产品包含可检测的量的含有核苷酸序列SEQ ID NO=USEQ ID N0:2或 其互补序列的多核苷酸。
13.根据权利要求12所述的加工食物或饲料产品，其中所述加工食品或饲料产品包括 玉米面、玉米粉、玉米麸、玉米油和玉米淀粉。
14.根据权利要求12所述的加工食物或饲料产品，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列 SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 或其互补序列。
15.根据权利要求12所述的加工食物或饲料产品，其中所述多核苷酸还包含SEQID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 24 中含有的核苷酸序列。
16.一种源自名为M0N87460的转基因玉米植物或其后代的种子，所述玉米植物的代表 性种子已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
17.根据权利要求16所述的种子，其中所述植物或其后代具有包含SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 24 的染色体。
18.—种从权利要求16所述的种子生长的后代玉米植物，其中所述植物具有包含SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 24 的染 色体。
19.一种源自权利要求18所述的后代玉米植物的种子，其中所述种子具有包含SEQ ID NO :1,SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :7 或 SEQ ID N0:24 的染色体。
20.一种产生干旱耐受的玉米植物的方法，包括将包含SEQ ID NO :1和含可操作地与 cspB基因连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的干旱耐受的第一亲 本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交，从而产生多个干旱耐受的后代植物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一和第二玉米植物为自交植物，且其中 产生杂交玉米种子。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述插入片段包含SEQID NO :7或SEQ ID NO 24。
23.一种检测玉米组织样品中SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的存在的方法，所述方法 包括将样品与DNA引物对接触，其中所述引物对中的至少一个DNA引物分子包含SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7或其互补序列的至少11个连续的核苷酸，和 进行多核苷酸扩增反应，从而产生扩增子；和检测所述扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2。
24.—种检测玉米组织样品中SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的存在的方法，所述方法 包括将含有DNA的样品与探针接触，所述探针在严格杂交条件下与来自玉米事件M0N87460 的基因组DNA杂交且在严格杂交条件下不与来自对照玉米植物的基因组DNA杂交，其中所 述探针与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2同源或互补； 使样品和探针经受严格杂交条件；和检测探针与来自样品的DNA的杂交，从而检测玉米组织样品中的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2。
25.一种获得缺乏完整的选择标记基因的水分亏缺耐受玉米植物的方法，包括步骤 将包含SEQ ID NO :1和异源转基因插入物的玉米染色体暴露于一种或多种重组诱导剂，其中所述异源转基因插入片段包含与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白 启动子和选择标记基因；选择包含SEQ ID NO :1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的 玉米植物，其中所述选择标记基因或其部分已被除去或破坏，从而获得缺乏完整的选择标 记基因的水分亏缺耐受玉米植物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述重组诱导剂包括重组酶、核酸酶、同源置换 序列、非同源置换序列或其组合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述同源置换序列或所述非同源置换序列包含 一种或多种基因。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述异源转基因插入片段包含SEQID NO :7或 SEQ ID NO :24。
29.—种包含SEQ ID NO :25或其互补序列的多核苷酸。
30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含SEQID NO :3、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 7中包含的核苷酸序列。
31.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO :24。
32.一种包含SEQ ID NO :2或其互补序列的多核苷酸。
33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含SEQID NO :4、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7中含有的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了转基因玉米事件MON87460，以及包含鉴别该玉米事件的DNA的细胞、种子和植物。本发明还提供了包含用于检测样品中MON87460事件的核苷酸序列的存在的组合物、用于检测样品中MON87460事件多核苷酸的存在的方法，以及用于检测鉴别样品中MON87460的存在的核苷酸序列的探针和引物。本发明还提供采用MON87460育种的方法以产生耐受水分亏缺的玉米植物。
文档编号C12N15/82GK101978065SQ200980109620
公开日2011年2月16日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月29日
发明者A·洛克, C·沃伊勒斯, J·A·科尔特, K·A·比兹利, M·A·迪兹甘, P·卡斯蒂格里奥尼, R·A·凯利 申请人:孟山都技术公司