专利名称：用于核酸测试的非竞争性内部对照物的制作方法
技术领域：
本申请一般地涉及用于进行诊断分析的工具，更具体地涉及用于核酸测试(NAT) 的不与目标核酸序列竞争的内部对照序列。
背景技术：
为了确保核酸测试(NAT)正确地进行，分析需要存在内部对照物。在诊断NAT中， 内部对照物的存在可以确保测试的完整性。具体地，通过在NAT中包括内部对照物，内部对 照物和目标核酸测试为阳性的样品是真阳性的。相反，仅测试了内部对照物的样品是真阴 性的，仅测试了目标核酸的样品是真阴性的，没有可检测的内部对照物或目标的样品是假 阴性的。需要存在内部对照物的最常用的诊断分析是聚合酶链式反应(PCR)分析，其在它 的传统用途中是目标扩增分析，在它的修改的用途中是目标扩增和定量分析。存在几种类 型的PCR分析传统的PCR(DNA的扩增)；反-转录酶PCR(也称为“RT-PCR” ；利用RNA作 为起始材料的DNA的扩增)，实时PCR(DNA的同时定量和扩增)；和实时RT-PCR(利用RNA 作为起始材料的DNA的同时定量和扩增)。在扩增分析，例如PCR分析中，一般地，使用一种或两种内部对照物竞争性内部 对照物和非竞争性内部对照物。使用竞争性内部对照物，目标和所述内部对照物在同样的条件下和在同一 PCR试 管中使用一组共同的引物来扩增。使用竞争性内部对照物，内部对照物核酸侧翼是用于启 动目标核酸的扩增的相同的引物序列。当正确地进行PCR分析时，IC核酸将在扩增分析之 后检测到。根据它的名字知道的是，竞争性内部对照物是基于目标DNA和内部对照物之间 的竞争。为了使竞争性内部对照物有效，样品试管中的内部对照物的数量对于检测极限是 关键的。使用竞争性内部对照物的缺点是基于它的结构，具体地，取决于核酸片段的摩尔 比、长度、序列和二级结构，侧翼是相同的引物位点的两种不同的核酸片段的同时扩增有着 一种或两种产物的抑制作用或增强作用的风险。竞争性内部对照物的另一个缺点是，它们 不能用于多重分析，多重分析在单次分析中筛选多个目标。对于非竞争性内部对照物，对每一种利用不同的引物组扩增目标和内部对照物； 因而，非竞争性内部对照物需要一种PCR，在其中具有不同动力学的两个反应同时地进行。 由于两种反应的动力学是不同的，对于引物没有竞争。当前使用的非竞争性内部对照物引 物组一般靶向目标基因以外的基因(例如，编码rRNA)，其以比目标基因更高的拷贝数存在 于样品中。本领域中最常用的非竞争性内部对照物利用特异于16S和23S核糖体DNA的保 守序列的引物。本领域中仍然需要可以被制备用于多重分析的其他非竞争性内部对照物。 非竞争性内部对照物的优点是，不同于竞争性内部对照物，非竞争性内部对照物可以被保 存用于多个反应，也可以用于多重反应中。本领域中需要这样的非竞争性内部对照物。发明概述通过提供核酸序列，所述核酸序列可以在实验室中制备，并保存用于多个反应和 用于多重NAT，本发明满足了本领域中对用于NAT的非竞争性内部对照物的需求。
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在本发明的一个方面，提供了用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物，包含 从选自 Methanobacterium thermoautrophicum(MET)和玉蜀黍(Zea mays)的生物体获得 的核酸。在本发明的一个实施方式中，所述非竞争性内部对照物包含DNA，并用于选自由甲 型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A) ,RSV B、人类偏月市病毒(human metapneumovirus, hMPV)、沙目艮衣原体(Chlamydiatrachomatis) (CT) ,Neisseria gonorrhea(GC[用于 gonococci])和乙型肝炎病毒(HBV)构成的组的 DNA NAT。在本发明的另一个实施方式中，所述非竞争性内部对照物包含RNA，并用于选自由 丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I (HIV-I)和严重急性呼吸综合征(SARS)构成的组 的 RNA NAT。在本发明的另一个方面，提供了制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物 的方法，包括步骤(a)从 Methanobacteriumthermoautrophicum(MET)提取基因组 DNA ； (b)利用具有至少两个限制性内切酶位点和至少一个目标特异性序列的正向和反向引物， 从步骤(a)的基因组DNA产生扩增子；(c)通过连接步骤(b)的扩增子和载体序列产生质 粒，所述载体序列具有启动子序列和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切 酶位点；和(d)用与步骤(b)和(c)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质 粒来产生MET内部对照DNA。当需要RNA时，所述方法进一步包括步骤(e)从步骤(d)的DNA制备MET内部对 照 RNA。在本发明的进一步的方面，提供了制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照 物的方法，包括步骤(a)从玉蜀黍(玉米(corn))提取基因组DNA ;(b)利用具有至少两个 限制性内切酶位点和目标特异性序列的正向和反向引物，从步骤(a)的基因组DNA产生扩 增子；(c)通过连接步骤(b)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列 和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；(d)用与步骤(b)和(C) 的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产生玉米内部对照DNA。当需要RNA时，所述方法进一步包括步骤(e)从步骤(d)的DNA制备玉米内部对 照 RNA。在本发明的一个实施方式中，步骤(b)和(d)的所述至少两个限制性内切酶位点 (对于MET和玉米两者)相应于限制性内切酶XhoI和SpeI的序列。在本发明的另一个实施方式中，步骤(c)的启动子序列(对于MET和玉米两者) 是T7启动子序列。在本发明的进一步的实施方式中，MET或玉米内部对照DNA被用作选自以下构成 的组的DNA NAT中的非竞争性内部对照物甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1 到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、 Neisseria gonorrhea(GC)和乙型肝炎病毒(HBV)。在本发明又一个实施方式中，MET或玉米内部对照RNA被用作选自以下构成的组 的RNA NAT中的非竞争性内部对照物丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I (HIV-I)和 严重急性呼吸综合征(SARS)。
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本发明的其他方面、优点和特征将在以下的说明书中部分地阐述，部分地，在本领 域技术人员参阅下文时将变得显而易见，或可以通过本发明的实践来学习到。附图的简要描述附
图1是制备本发明的内部对照序列的方法的示意图。附图2是单个反应孔中沙眼衣原体(CT)(左侧曲线)和MET IC(右侧曲线)的扩 增曲线的图形。附图3是单个反应孔中Neisseria gonorrhea(GC)(左侧曲线)和MET IC(右侧 曲线)的扩增曲线的图形。附图4是单个反应孔中丙型肝炎病毒(HCV)(左侧曲线)和MET IC(右侧曲线) 的扩增曲线的图形。发明的详细描述以下阐述的是当前被认为是所请求的发明的优选的实施方式和最好实施例的描 述。在功能、目的或结构方面的任何替代或修饰意图由本申请的权利要求涵盖。定义在描述和要求本发明的权利时，以下术语、以下定义仅被用于描述特定实施方式 的目的，而不意图是限制性的。如在本说明书和附随的权利要求中使用的，单数形式“一 (a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数的指代物，除非上下文明显地相反指示。 术语“非竞争性内部对照物”是指内部对照核酸序列，其包括在目标核酸序列中不 存在的引物位点。术语“竞争性内部对照物”是指内部对照核酸序列，其包括在目标核酸序列中也存 在的引物位点。术语“ FW”和“ FP ”表示正向引物，术语“ RV ”和“ RP ”表示反向引物。术语“ P ”单 独使用时是指探针。术语“用于内部对照物(IC)克隆的构建的PCR引物”是指寡核苷酸，其被设计以 通过重叠PCR反应将独特的序列和限制性位点引入新构建的IC质粒DNA中。术语“扩增引物”(在此也称为“引物”)是指寡核苷酸，其与DNA或RNA分子互补， 并提供了底物的3-0H末端，任何DNA聚合酶可以按照5到3的方向将增长中的DNA链的核 苷酸添加到所述末端上。术语“检测探针”(在此也称为“探针”)是指在合适的条件下能够选择性地与扩增 的目标核酸杂交的寡核苷酸。检测探针可以由具有5-报告物染料(R)和3-淬灭剂染料(Q) 的核苷酸组成。荧光报告物染料和荧光团，或为红位移荧光的或非荧光的淬灭剂可以共价 连接到寡核苷酸的5-末端或3-末端。检测探针在扩增和检测过程期间作为TAQMAN (Applied Biosystems,Foster City,CA)探针或其他检测探针，例如信标、非核酸酶实时扩 增探针。术语“诊断目标(未知的)，，是指已经设计了 PCR分析来特异性地检测的核酸序 列。这些分析的实例包括一些目标，例如，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类 免疫缺陷病毒(HIV)。术语“诊断目标(已知的)”是指独特的DNA或RNA目标，其以已知的浓度掺入到 用于分离和扩增特定诊断目标的提取步骤或扩增混合物中，所述特定诊断目标在样品中的存在或数量是未知的。此外，识别RNA或DNA的独特片段的独特的引物和探针被添加到扩增 混合物中。这些内部对照物可以用于监视实时kPCR分析中目标提取、扩增和检测的效力。如在此使用的，术语“目标扩增”是指酶介导的过程，其能够产生核酸目标的数 十亿的拷贝。本领域已知的酶介导的目标扩增过程的实例包括PCR、基于核酸序列的扩增 (“NASBA”)、转录介导的扩增(“TMA”)、链置换扩增(“SDA”)和连接酶链式反应(“LCR”)。 最广泛使用的目标扩增过程是PCR，由Mullins等人在美国专利No. 4，683，195中和Mullis 在美国专利No. 4，683，202中首先描述用于DNA的扩增。PCR过程是本领域普通技术人员公 知的。当PCR反应的起始材料是RNA时，互补DNA(“cDNA”)通过逆转录由RNA制成。用于 扩增RNA产物的PCR被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。在PCR技术中，DNA的样品在溶液中与摩尔过量的、各自10_30碱基对的两种寡核 苷酸引物，所述引物各自制备为互补于DNA双链体的每条链的3'末端；摩尔过量的未连接 的核苷酸碱基(即，dNTPs)；和DNA聚合酶(优选的Taq聚合酶，其是对热稳定的)，其催化 从寡核苷酸引物和dNTP的DNA形成，混合。两种引物中，一种是正向引物，其将以5' -3' 方向结合变性的DNA被分析物的一条链的3'末端，另一个是反向引物，其将以3' -5'方 向结合变性的DNA被分析物的另一条链的5 ‘末端。溶液加热到94-96°C来将双链DNA变 性为单链的DNA。当溶液冷却时，引物结合独立的链，DNA聚合酶通过将dNTP结合到引物上 来催化被分析物的新的链。当重复该过程时，从引物合成的延伸产物从它们的互补物上分 离，每个延伸产物充当了从另一个引物合成的互补延伸产物的模板。换句话说，从正向引物 合成的延伸产物，在分离时，将充当从反向引物合成的互补的延伸产物的模板。类似地，从 反向引物合成的延伸产物，在分离时，将充当从正向引物合成的互补的延伸产物的模板。这 样，引物之间的DNA的区域随着过程的每次重复被选择性地复制。由于在每个循环之后序 列被扩增加倍，十亿个拷贝的理论上的扩增可以在重复该过程几个小时后获得；因而，极小 数量的DNA可以利用PCR在相对短的时间内扩增。 如在此使用的，术语“扩增子”是指扩增的核酸产物，例如，扩增的PCR产物。当PCR反应的起始材料是RNA时，互补DNA (“cDNA”)通过逆转录由RNA制成。产 生的cDNA然后利用如上所述的PCR方案扩增。逆转录酶作为在逆转录病毒中发现的酶是 本领域普通技术人员已知的，其可以从mRNA序列作为模板合成互补的DNA单链。所述酶被 用于遗传工程中来从mRNA的纯化的制品产生特定的cDNA分子。用于扩增RNA产物的PCR 被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。术语“实时PCR，，和“实时RT-PCR”本领域中也称为“动力PCR，，( “kPCR” )或 “动力RT-PCR” ( “kRT-PCR”)，是指用于DNA的同时扩增和定量的修改的PCR分析。对 于实时PCR，通过由发荧光染料分子和淬灭剂部分与相同的或不同的寡核苷酸底物的 偶联所产生的荧光信号，来检测PCR产物。在kPCR和kRT-PCR中通常使用的探针的实 例包括以下探针TAQMAN 探针(Applied Biosystems, Foster City, CA)、分子 信标探针(PHRI，Neward, N. J. )、SCORPION 探针(DXS Ltd, Manchester, UK)和 SYBR Green 探针(Invitrogen，Carlsbad，CA)。简要地，TQMAN 探针、分子信标和 SCORPION 探针各自具有附着到探针的5'末端的荧光报告物染料(也称为 “荧光剂”)和偶联到探针的3'末端的淬灭剂部分。在未杂交的状态下，荧光剂和淬灭分子 的接近阻止了来自探针的荧光信号的检出。相反，在PCR期间，当聚合酶复制其上结合了探针的模板时，聚合酶的5'-核酸酶活性裂解探针，因而每个复制循环提高荧光。SYBR Green探针结合双链DNA，并在激发时发射光线；因而随着PCR产物积累，荧光提高。术语“互补的”和“基本上互补的”是指核苷酸或核酸之间的碱基配对，例如，在双 链DNA分子的两条链之间，或在寡核苷酸引物和要测序或扩增的单链核酸上的引物结合位 点之间。互补的核苷酸一般是，A和T(或A和U)，以及G和C。在本发明的上下文中，要 理解的是，列出的具体序列长度是说明性的，不是限制性的，并且，覆盖相同的图谱位置、但 具有稍稍更少或更多数量的碱基的序列被认为是所述序列的等同物，并且属于本发明的范 围，条件是它们将与所列序列一样杂交到目标上的相同位置。因为要理解的是，为了杂交， 核酸不需要完全互补，在此公开的探针和引物序列可以被一定程度上修饰而不损失作为具 体引物和探针的实用性。一般地，具有80%或更高同源性的序列属于本发明的范围。如在此使用的，术语“克隆”被用于指“分子克隆”，其是产生核酸序列的多个拷贝 (在此也称为"插入物")的一种过程，例如，来自插入物的单个拷贝的独特基因或可选择 的遗传标志物。克隆过程一般在“克隆载体”(在此也称为"载体")中发生，其是一种能 够在适合的宿主细胞中复制的DNA分子，例如，质粒或病毒DNA染色体。“质粒”是本领域 已知的，从细菌物种获得的环状双链DNA分子。克隆载体一般具有用于核酸序列的插入的 一个或更多个适合的位点。在成功的克隆中，克隆载体被导入宿主细胞中，克隆载体在宿主 细胞中的复制产生转化的宿主细胞，其表达被插入到所述克隆载体中的所述核酸序列。克 隆载体在宿主细胞中的复制一般经由“启动子”来启动，其是位于基因的上游(朝向5'区 域)的DNA的调节区域，其结合RNA聚合酶和转录因子来启动RNA转录。利用这种操作和 如附图1中所示的，克隆载体可以用作模板来通过常规转录反应产生RNA内部对照物，或通 过限制性消化产生DNA内部对照物。如在背景小节中解释的，当非竞争性内部对照物用于扩增反应，例如PCR时，不同 的引物集被用于内部对照物和用于目标。非竞争性内部对照物的使用因而需要一种PCR， 其中具有不同的动力学的两种反应同时进行，每个反应的动力学不受到对引物的竞争的影 响。非竞争性内部对照物相对竞争性内部对照物的一个优点是，由于非竞争性内部对 照物是用它们自己的引物集来制备的，它们可以用于同一实验室中的许多不同的分析。非 竞争性内部对照物的另一个优点是它们可以用于多重PCR分析。相反，竞争性内部对照物 不能用于多重PCR分析，在多重PCR分析中需要几个引物对。如技术人员已知的，多重PCR 对于分子诊断是非常有用的，因为产生相似症状的多种病原体可以在单个反应中同时地筛 选。本发明的非竞争性内部对照物具有至少两个引物结合位点和至少一个探针结合 位点。作为非竞争性对照物，本发明的内部对照物具有独特的克隆序列，其不与目标核酸序 列竞争。所述内部对照物是从生物体Methanobacterium thermoautrophicum(MET)和玉蜀 黍(玉米)的基因组独立地设计的。分离自所述生物体的核酸被构建到带有克隆载体的质 粒中。用于克隆核酸的操作是本领域技术人员已知的。附图1显示了克隆本发明的内部 对照物核酸的示范性的操作；附图1中阐述的操作被用于产生实施例中描述的非竞争性内 部对照物。如附图1中所示，分离的基因组DNA用XhoI和SpeI限制性内切酶消化，产生的DNA插入物利用PCR来扩增并纯化。单独地，从TOPO 克隆载体(Invitrogen，Carlsbad， California)制备载体片段，其用XhoI和SpeI限制性内切酶消化来形成具有XhoI和SpeI 粘性末端的载体片段，其随后被纯化。DNA插入物和载体片段然后通过匹配XhoI和SpeI粘 性末端来连接，形成包括了基因组DNA插入物、载体片段和T7启动子序列的质粒。T7启动 子序列一般是 20-mer T7 启动子序列 5'-TAA TAC GAG TCA CTA TAG GG-3，(SEQ ID NO. 1) 或 21-mer T7 启动子序列 5，-TAA TAC GAG TCA CTA TAG GGA-3，(SEQ ID NO. 2)。本发明 的内部对照DNA序列通过用XhoI或SpeI消化质粒来产生。内部对照RNA序列通过在本领 域技术人员已知的条件下转录DNA来获得。对附图1中所示操作的修饰，例如，用本领域已知的其他启动子替换T7启动子，例 如T3和SP6启动子，或在MET或玉米插入物侧翼插入超过一个启动子，处于本领域技术人 员的技术水平之内。类似地，处于本领域技术人员的技术水平之内的是，用其他适合的限制 性内切酶的结合位点替换XhoI和SpeI限制性结合位点，来修改在此阐述的方法。本发明的DNA内部对照物在DNA核酸测试(DAT)中具有实用性，无限制地包括 甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、 RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseria gonorrhea(GC)和乙型肝炎病 毒(HBV)。本发明的RNA内部对照物在RNA核酸测试(NAT)中具有实用性，无限制地包括丙 型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-I)和严重急性呼吸综合征(SARS)。实际上，要理解的是，本发明的内部对照物被包括在与被靶向的样品相同的反应 混合物中。在本发明的一个实施方式中，在病毒裂解的步骤引入内部对照物，因而，可以用 于在样品制备步骤监测RNA或DNA目标捕获或释放，和/或监测在实时PCR期间的目标扩 增和检测。内部对照物片段和引物和探针集序列表描述了⑴克隆期间的DNA插入物；(ii)基于限制性内切酶消化之后的纯 化，产生的完整的双链DNA序列；和(iii)产自带有附着的载体序列的T7启动子的单链RNA 的序列。MET核酸片段表1显示了用于从M thermoautrophicum(MET)基因组提取核酸片段的正向(FP) 和反向(RP)弓丨物的序列，其被用于克隆本发明的MET内部对照物(MET IC)。引物被设计具 有限制性内切酶结合位点(以粗体突出)和目标特异性结合位点(下划线的)。如其中所 示，正向引物被设计具有XhoI限制性内切酶序列(C/TCGAG)，反向引物被设计具有SpeI限 制性内切酶序列(A/CTAGT)。
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权利要求
一种用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物，包含从选自Methanobacterium thermoautrophicum(MET)或玉蜀黍(Zea mays)的生物体获得的核酸。
2.权利要求1的非竞争性内部对照物，其中所述核酸是DNA。
3.权利要求2的非竞争性内部对照物，其中所述NAT选自以下构成的组甲型流感、乙 型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类 偏肺病毒(hMPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、沙眼衣原体(CT)和Neisseria gonorrhea (GC)。
4.权利要求1的非竞争性内部对照物，其中所述核酸是RNA。
5.权利要求4的非竞争性内部对照物，其中所述诊断NAT选自以下构成的组丙型肝 炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I (HIV-I)和严重急性呼吸综合征(SARS)。
6.权利要求1的非竞争性内部对照物，其中所述核酸包括至少两个引物结合位点和至 少一个探针结合位点。
7.一种制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物的方法，包括步骤(a)hk Methanobacterium thermoautrophicum (MET)DNA ；(b)利用具有至少两个限制性内切酶位点和目标特异性序列的正向和反向引物，从步 骤(a)的基因组DNA产生扩增子；(c)通过连接步骤(b)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列 和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；(d)用与步骤(b)和(c)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产 生MET内部对照DNA。
8.权利要求7的方法，进一步包括步骤(e)从步骤(e)的DNA制备MET内部对照RNA。
9.权利要求7的方法，其中步骤(b)和(d)的所述至少两个限制性内切酶位点相应于 限制性内切酶XhoI和SpeI的序列。
10.权利要求7的方法，其中所述步骤(b)的正向引物具有SEQIDNO :3的序列，步骤 (b)的反向引物具有SEQ ID NO 4的序列。
11.权利要求7的方法，其中步骤(c)的启动子序列是T7启动子序列。
12.权利要求7的方法，其中所述MET内部对照DNA被用作用于以下疾病状态的DNA核 酸诊断测试中的内部对照物甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、八型 呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、沙眼衣原 体(CT)禾口 Neisseria gonorrhea(GC)。
13.权利要求8的方法，其中所述MET内部对照RNA被用作用于以下疾病状态的RNA核 酸诊断测试中的内部对照物丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-I)和严重急 性呼吸综合征(SARS)。
14.一种制备用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物的方法，包括步骤(a)从玉蜀黍(玉米)提取基因组DNA；(b)利用具有至少两个限制性内切酶位点和目标特异性序列的正向和反向引物，从步 骤(a)的基因组DNA产生扩增子；(c)通过连接步骤(c)的扩增子和载体序列产生质粒，所述载体序列具有启动子序列 和与所述扩增子的限制性内切酶位点相同的限制性内切酶位点；(d)用与步骤(b)和(C)的限制性内切酶位点相应的限制性内切酶消化所述质粒来产 生玉米内部对照DNA。
15.权利要求14的方法，进一步包括步骤(e)从步骤(e)的DNA制备玉米内部对照RNA。
16.权利要求14的方法，其中步骤(b)和(d)的所述至少两个限制性内切酶位点相应 于限制性内切酶XhoI和SpeI的序列。
17.权利要求14的方法，其中步骤(d)的启动子序列是T7启动子序列。
18.权利要求14的方法，其中所述玉米内部对照DNA被用作用于以下疾病状态的DNA 核酸诊断测试中的内部对照物甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、 A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、B型呼吸道合胞体病毒(RSV B)、人类偏肺病毒(hMPV)、沙 眼衣原体、Neisseria gonorrhea和乙型肝炎病毒(HBV)。
19.权利要求15的方法，其中所述玉米内部对照RNA被用作用于以下疾病状态的RNA 核酸诊断测试中的内部对照物丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-I)和严重 急性呼吸综合征(SARS)。
20.权利要求14的方法，其中所述步骤(b)的正向引物具有SEQIDN0:27的序列，步 骤(b)的反向引物具有SEQ ID NO 28的序列。
全文摘要
提供的是用于核酸测试(NAT)的非竞争性内部对照物，其是从生物体Methanobacterium thermoautrophicum(MET)和玉蜀黍(玉米)获得的。所述非竞争性内部对照物在DNA和RNA NAT中具有实用性，所述DNA和RNA NAT选自甲型流感、乙型流感、副流感病毒1到4(PIV-1到PIV-4)、A型呼吸道合胞体病毒(RSV A)、RSV B、人类偏肺病毒(hMPV)、沙眼衣原体(CT)、Neisseria gonorrhea(GC)和乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒I(HIV-1)和严重急性呼吸综合征(SARS)。
文档编号C12Q1/68GK101978074SQ200980109445
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月19日 优先权日2008年3月20日
发明者D·谢尔曼, J·德特默, M·乐, X·蒋 申请人:西门子医疗保健诊断公司