与药物抗性有关的遗传变异的制作方法

专利名称：与药物抗性有关的遗传变异的制作方法
1/35 与药物抗性有关的遗传变异
本申请要求2008年3月14日提交的美国临时申请流水号61/036,874和2008年 5月16日提交的美国临时申请流水号61/0M,064的优先权权益，通过述及将这两篇完整 收入本文。发明领域
一般而言，本发明涉及预示药物抗性的遗传变异。
发明背景
现代分子生物学的一项关键目的是鉴定表征给定肿瘤的潜伏遗传和基因组变 异，使得患者能接受用有可能提供最大好处的化疗剂进行的靶向疗法。乳腺癌是西方世 界女性中癌症的最常见形式，估计全世界每年100万例新诊断和40万例死亡(1)。靶向 疗法诸如用于雌激素受体阳性癌症的他莫昔芬(2)和用于包含HER2癌基因扩增的肿瘤的 Herceptin(3)的出现对患者存活具有重大影响，尽管各种化学疗法方案仍构成乳腺癌治疗 的一项重要组分(4)。乳腺癌是一种异质疾病，具有以对靶向和化疗剂的差异响应为特征 的不同分子亚型。虽然化学疗法在许多病例中是一种成功的治疗方案，但是估计50%的 患者由于固有的或获得的多药抗性而未能受益(1)。多药抗性(MDR)指癌细胞对(在结 构和机制方面可以是无关的)多类化疗药物的抗性，而且涉及起ATP依赖性流出泵作用 的多种蛋白质的过表达( 。了解促成乳腺癌中MDR的分子改变是至关重要的第一步， 从而能够开发能够预测对给定疗法的抗性的诊断测试及理性选择更有效的治疗剂。
在先前的研究中已经将ABCC3过表达与癌细胞系中的获得性多药抗性联系 起来。例如，Liu等人报告了通过在存在多柔比星的情况中选择生长而衍生的细胞系 MCF-7/AdVp3000中ABCC3相对于亲本的459倍过表达(36)。另外，最近显示用长 春新碱处理癌细胞系导致这些细胞中ABCC2和ABCC3转录物显著上调(37)。相关泵 ABCC2 (MRP2)和ABCClO (MRP7)均显示在过表达时赋予帕利他塞抗性(38) (39)，而且 已经在小鼠模型中显示ABCC2是帕利他塞体内药动学的一项重要决定因素00)。先前没 有证明帕利他塞是ABCC3的底物，而且在MDCK或NIH-3T3细胞中进行的异位ABCC3 过表达研究确实未能证明对帕利他塞的抗性升高01，42)。值得注意的是，还在长期测 定法中发现Gl) ABCC3不能赋予对多柔比星的抗性，尽管其它已发表的功能研究的报告 提示ABCC3在转运此药剂中的作用(36)。
这些各式各样的观察结果例示了乳腺癌是一种能经由多种机制规避化学疗法的 异质疾病的实情，而且强调了对可用于预测癌症患者个体中治疗响应的生物标志物组的需要。
发明概述
本发明的一个方面提供一种用于确定患者中的癌症是否对抗有丝分裂剂处理 有抗性的方法，包括检测ABCC3基因是否在来自该患者的测试癌症样品中扩增，其中 ABCC3基因的扩增指示该癌症对抗有丝分裂剂处理有抗性。在一个实施方案中，所述测 试癌症样品是癌症肿瘤样品。
ABCC3基因的扩增是例如通过测定ABCC3基因的拷贝数来检测的。在一些实 施方案中，拷贝数至少3指示ABCC3基因扩增，在其它实施方案中，拷贝数至少5指示 ABCC3基因扩增。
ABCC3基因的拷贝数是例如通过荧光原位杂交(FISH)、Southern印迹、免疫组 织化学(IHC)、聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、比较基因组杂交、基于微阵列的比较基因组杂交、或连接酶链式反应(LCR)来测定的。
本发明的另一个方面提供一种用于确定患者中的癌症是否对抗有丝分裂剂处理 有抗性的方法，包括检测ABCC3基因是否在来自该患者的测试癌症样品中过表达，其中 ABCC3基因的过表达指示该癌症对抗有丝分裂剂处理有抗性。
在一个实施方案中，ABCC3基因的过表达是通过测定来自ABCC3基因的 mRNA转录水平来检测的。在一些实施方案中，测试癌症样品中来自ABCC3基因的 mRNA转录水平相对于对照样品升高至少5倍指示ABCC3基因过表达。在其它实施方案 中，测试癌症样品中来自ABCC3基因的mRNA转录水平相对于对照样品升高至少25倍 指示ABCC3基因过表达。
在另一个实施方案中，ABCC3基因的过表达是通过测定ABCC3多肽表达水平 来检测的。在一些实施方案中，(测定)ABCC3多肽表达水平包括使测试癌症样品与抗 ABCC3抗体接触并检测抗ABCC3抗体对ABCC3多肽的结合。在一些实施方案中，测 试癌症样品中的ABCC3多肽表达水平相对于对照样品升高至少2倍指示ABCC3基因过 表达。在其它实施方案中，测试癌症样品中的ABCC3多肽表达水平相对于对照样品升高 至少10倍指示ABCC3基因过表达。
在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、和结肠直肠癌。
在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂选自紫杉烷类(包括例如帕利他塞和多 西他塞)、美登木素生物碱类(包括例如DMl和DM4)、和auristatin类(包括例如单甲 基auristatin E (MMAE)和单甲基auristatin F (MMAF))，及它们的类似物和衍生物。
在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂偶联至抗体。在一个实施方案中， 所述抗有丝分裂剂-抗体偶联物是美登木素生物碱-抗Her2抗体偶联物，诸如曲妥单 抗-DMl。
本发明的另一个方面提供一种用于确定乳腺癌肿瘤是否对抗有丝分裂剂处理有 抗性的方法，包括检测ABCC3基因是否在乳腺癌肿瘤样品中扩增，其中ABCC3基因的 扩增指示该乳腺癌肿瘤对抗有丝分裂剂处理有抗性。
ABCC3基因的扩增是例如通过测定ABCC3基因的拷贝数来检测的。在一些实 施方案中，拷贝数至少3指示ABCC3基因扩增，在其它实施方案中，拷贝数至少5指示 ABCC3基因扩增。
ABCC3基因的拷贝数是例如通过荧光原位杂交(FISH)、Southern印迹、免疫组 织化学(IHC)、聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、比较基因组杂交、基于微阵列的比较基因组杂交、或连接酶链式反应(LCR)来测定的。
本发明的另一个方面提供一种用于确定乳腺癌肿瘤是否对抗有丝分裂剂处理有 抗性的方法，包括检测ABCC3基因是否在乳腺癌肿瘤样品中过表达，其中ABCC3基因 的过表达指示该乳腺癌肿瘤对抗有丝分裂剂处理有抗性。
在一个实施方案中，ABCC3基因的过表达是通过测定来自ABCC3基因的 mRNA转录水平来检测的。在一些实施方案中，测试癌症样品中来自ABCC3基因的 mRNA转录水平相对于对照样品升高至少5倍指示ABCC3基因过表达。在其它实施方案 中，测试癌症样品中来自ABCC3基因的mRNA转录水平相对于对照样品升高至少25倍 指示ABCC3基因过表达。
在另一个实施方案中，ABCC3基因的过表达是通过测定ABCC3多肽表达水平 来检测的。在一些实施方案中，(测定)ABCC3多肽表达水平包括使测试癌症样品与抗 ABCC3抗体接触并检测抗ABCC3抗体对ABCC3多肽的结合。在一些实施方案中，测 试癌症样品中的ABCC3多肽表达水平相对于对照样品升高至少2倍指示ABCC3基因过 表达。在其它实施方案中，测试癌症样品中的ABCC3多肽表达水平相对于对照样品升高 至少10倍指示ABCC3基因过表达。
在一些实施方案中，所述乳腺癌肿瘤是Her-2阳性乳腺癌肿瘤。
在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂选自紫杉烷类(包括例如帕利他塞和多 西他塞)、美登木素生物碱类(包括例如DMl和DM4)、和auristatin类(包括例如单甲 基auristatin E (MMAE)和单甲基auristatin F (MMAF))，及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂偶联至抗体。在一个实施方案中， 所述抗有丝分裂剂-抗体偶联物是美登木素生物碱-抗Her2抗体偶联物，诸如曲妥单 抗-DMl。
本发明的另一个方面提供一种用于为基于抗有丝分裂剂的化学疗法选择乳腺癌 患者的方法，包括a)检测ABCC3基因是否在来自该患者的测试癌症样品中扩增，并 b)若在该测试癌症样品中没有检测到ABCC3基因的扩增，则选择该患者进行基于抗有丝 分裂药物的化学疗法。
ABCC3基因的扩增是例如通过测定ABCC3基因的拷贝数来检测的。在一些实 施方案中，拷贝数至少3指示ABCC3基因扩增，在其它实施方案中，拷贝数至少5指示 ABCC3基因扩增。
ABCC3基因的拷贝数是例如通过荧光原位杂交(FISH)、Southern印迹、免疫组 织化学(IHC)、聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、比较基因组杂交、基于微阵列的比较基因组杂交、或连接酶链式反应(LCR)来测定的。
本发明的另一个方面提供一种用于为基于抗有丝分裂剂的化学疗法选择乳腺癌 患者的方法，包括a)检测ABCC3基因是否在来自该患者的测试癌症样品中过表达，并 b)若在该测试癌症样品中没有检测到ABCC3基因的过表达，则选择该患者进行基于抗有 丝分裂药物的化学疗法。
在一个实施方案中，ABCC3基因的过表达是通过测定来自ABCC3基因的 mRNA转录水平来检测的。在一些实施方案中，测试癌症样品中来自ABCC3基因的 mRNA转录水平相对于对照样品升高至少5倍指示ABCC3基因过表达。在其它实施方案 中，测试癌症样品中来自ABCC3基因的mRNA转录水平相对于对照样品升高至少25倍 指示ABCC3基因过表达。
在另一个实施方案中，ABCC3基因的过表达是通过测定ABCC3多肽表达水平 来检测的。在一些实施方案中，(测定)ABCC3多肽表达水平包括使测试癌症样品与抗ABCC3抗体接触并检测抗ABCC3抗体对ABCC3多肽的结合。在一些实施方案中，测 试癌症样品中的ABCC3多肽表达水平相对于对照样品升高至少2倍指示ABCC3基因过 表达。在其它实施方案中，测试癌症样品中的ABCC3多肽表达水平相对于对照样品升高 至少10倍指示ABCC3基因过表达。
在一些实施方案中，所述乳腺癌患者具有Her-2阳性乳腺癌。
在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂选自紫杉烷类(包括例如帕利他塞和多 西他塞)、美登木素生物碱类(包括例如DMl和DM4)、和auristatin类(包括例如单甲 基auristatin E (MMAE)和单甲基auristatin F (MMAF))，及其类似物和衍生物。
在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂偶联至抗体。在一个实施方案中， 所述抗有丝分裂剂-抗体偶联物是美登木素生物碱-抗Her2抗体偶联物，诸如曲妥单 抗-DMl。
本发明的另一个方面提供一种降低癌细胞对抗有丝分裂剂的抗性的方法，包括 使该癌细胞与ABCC3的拮抗剂接触。在一些实施方案中，所述拮抗剂是ABCC3抗体或 与ABCC3结合的siRNA。
本发明的又一个方面提供一种治疗具有对抗有丝分裂剂有抗性的癌症的患者的 方法，包括对该患者施用ABCC3的拮抗剂和治疗有效量的抗有丝分裂剂。在一些实施 方案中，所述拮抗剂是ABCC3抗体或与ABCC3结合的siRNA。在一些实施方案中，所 述抗有丝分裂剂选自紫杉烷类、美登木素生物碱类、和auristatin类，及其类似物和衍生 物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂偶联至抗体。在一个实施方案中，所述抗有 丝分裂剂-抗体偶联物是美登木素生物碱-抗Her2抗体偶联物，诸如曲妥单抗-DMl。
本发明还提供根据患者的癌症的ABCC3扩增状态来治疗癌症患者的方法。在一 个实施方案中，所述方法包括检测ABCC3基因是否在来自该患者的测试癌症样品中扩增 或过表达并若在该测试癌症样品中没有检测到ABCC3基因的扩增或过表达，则对该患者 施用治疗有效量的基于抗有丝分裂药物的化学疗法。在一个实施方案中，所述患者具有 Her2阳性乳腺癌且施用抗Her2抗体-抗有丝分裂剂偶联物诸如曲妥单抗-DMl或曲妥单 抗-MMAE。
在本发明的另一个方面，根据患者的癌症中没有ABCC3扩增或过表达来为基于 抗有丝分裂药物的化学疗法选择患者，并施用治疗有效量的抗有丝分裂药物。在一个实 施方案中，所选择的患者具有Her2阳性乳腺癌且施用抗Her2抗体-抗有丝分裂剂偶联物 诸如曲妥单抗-DMl或曲妥单抗-MMAE。
附图简述
图Ia图示乳腺癌细胞系对MMAE的体外响应。图Ib图示乳腺癌细胞系对帕 利他塞的体外响应。在χ轴上，将细胞系归类入乳腺癌的主要分子亚型。y轴指示体外 IC50值，或导致细胞存活力抑制50%的药物浓度。水平线指示给定亚型的细胞系对每种 药剂的敏感性均值。
图&显示在体外对帕利他塞的抗性与染色体17q21区扩增有关。图沈显示在 体外对MMAE的抗性与染色体17q21区扩增有关。以药剂敏感性升高的次序从左至右显 示细胞系。在图的顶部指示用于SNP阵列数据有监督的分析和抗性生物标志物的鉴定的 归类(敏感的、中间的、抗性的)。用菱形指示那些具有基因组DNA拷贝数扩增的细胞系。
图3显示ABCC3在具有17q21.3扩增的细胞系中过表达。根据该区拷贝数截留 4，将31种细胞系分成扩增的和不扩增的两类。框线图(box-and-whiskerplots)显示每个 组中的ABCC3表达。作为代表ABCC3的最易变的Affymetrix表达探针集，选择208161_ s_at。其它探针集给出相似的结果。中央的框代表四分位间范围(interquartile range)， 框内部的线指示中值，而垂直虚线延伸至距中值最远但在四分位范围1.5倍内的数据点。 垂直虚线以外的数据点用各个圈代表。
图4a_4d显示多幅图，呈现ABCC3或对照siRNA处理后四种不同细胞系响应 帕利他塞处理的有丝分裂指数。EFM-192A (a)和ZR-75-30 (b)细胞具有ABCC3扩 增和过表达且在敲低后展示增强的敏感性(有丝分裂指数升高)，而HCC_1428(c)和 MDA-MB-453 (d)具有低拷贝数和表达且不显示升高的敏感性。
图5显示在体外稳定的ABCC3过表达导致对帕利他塞和MMAE的抗性。对自 CMV启动子过表达ABCC3的单细胞克隆衍生的稳定细胞系或具有空载体的对照系测定 帕利他塞(图5a)或MMAE(图5b)的生长抑制效果。
图6显示对用MMAE(a)或帕利他塞(b)处理的乳腺癌细胞系的生长抑制。点 代表384孔板中四个复制孔的平均值及拟合的非线性剂量-响应曲线。y轴指示相对于对 照媒介处理孔的百分比细胞存活力。误差棒指示标准偏差。
图7显示在标准细胞存活力测定法中分析对游离DMl的敏感性的三种ABCC3过 表达克隆和一种对照细胞系。
图8显示一幅图，呈现用对照(NTC)或ABCC3siRNA转染的EFM-192A细胞在 用曲妥单抗-mc-vc-PAB-MMAF处理时的有丝分裂指数。
图9a显示用对照(NTC)或ABCC3siRNA转染的EFM-192A细胞在用游离DMl 处理时的有丝分裂应答。图9b显示用对照(NTC)或ABCC3siRNA转染的EFM-192A细胞在用T-DMl处理时的有丝分裂应答。


图10显示在自T-DMlII期试验获得的样品上实施的FISH分析的结果。
图11是一张表，显示关于细胞系的分子亚型及其对抗有丝分裂药物的敏感性的 fn息ο
发明详述
I.定义
短语“基因扩增”和“基因复制”(及变化形式诸如“基因的扩增”或“基 因的复制”)可互换使用，指在特定细胞或细胞系中形成多拷贝的基因或基因片段的过 程。复制区(扩增的DNA的区段)通常称为“扩增子”。一般而言，所产生的信使 RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也按由特定基因形成的拷贝数的比例增加。
如本文中所使用的，除非另有说明，术语“ABCC3”指来自任何脊椎动物来源 的任何天然ABCC3(也称作MRP-3)，包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人和猴)和啮齿 类(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长的”未加工的ABCC3以及源自细胞中加工 的任何形式的ABCC3。该术语还涵盖ABCC3的天然存在变体，例如剪接变体、等位变 体、和其它同等型(isoforms)。该术语还涵盖天然ABCC3的维持ABCC3的至少一项生 物学活性的片段或变体。ABCC3的例子包括那些用Genbank登录号NM_003786 (人)和XM_358306(小鼠)鉴定的。还可参见 Kiuchi，etal.，FEBS Lett. 433 149-152(1998); 及 Borst，etal., JNCI 92 (16) 1295-1302(2000)。
术语“遗传变异”包括基因或多肽扩增中的变异以及氨基酸序列或多核苷酸序 列中的变异。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关 的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性 的还是良性的，及所有癌前(pre-cancemus)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌 性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排 斥。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖 不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin) 淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括 鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、 胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肉 瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺 癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴 增生性病症、及各种类型的头和颈癌。
“对抗有丝分裂剂治疗有响应的”或“对抗有丝分裂剂治疗响应性的”癌症患 者指显示源自或源于抗有丝分裂剂治疗的临床或治疗受益的癌症患者。此类受益包括细 胞或生物学应答、完全响应、部分响应、病情稳定(没有进展或复发)、或患者具有较晚 复发的源自或源于药剂治疗的响应。
“对抗有丝分裂剂治疗有抗性的”癌症、癌细胞、或癌症肿瘤指不显示对药 剂的统计学显著的细胞或生物学应答的癌症、癌细胞、或癌症肿瘤。相反，对该药剂 治疗没有抗性的癌症、癌细胞、或癌症肿瘤显示对药剂的统计学显著的细胞或生物学应 答，诸如例如与未用药剂处理的癌细胞或肿瘤相比细胞死亡或凋亡率升高或增殖或生长 降低。在具体的实施方案中，若IC50大于30nM、或者大于50nM、或者大约IOOnM MMAE,则癌症、癌细胞、或癌症肿瘤对MMAE治疗有抗性。在其它实施方案中，若 IC50大于50nM、或者大于ΙΟΟηΜ、或者大于500nM、或者大于IOOOnM帕利他塞，则癌 症、癌细胞、或癌症肿瘤对帕利他塞治疗有抗性。
“抗有丝分裂剂”指抑制、阻止、或以其它方式破坏有丝分裂的化合物。抗有 丝分裂剂的具体例子包括但不限于紫杉烷类，诸如帕利他塞和多西他塞；美登木素生物 碱类，诸如DMl和DM4 ；多拉司他汀10 ；多拉司他汀15 ； auristatin类，诸如单甲基 auristatinE(MMAE)和单甲基auristatinF(MMAF)；长春花生物碱类，诸如长春碱和长春新碱；及其类似物和衍生物。抗有丝分裂剂任选偶联至抗体。
术语“治疗”或“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标 是预防或减缓(减轻)不想要的生理学变化或紊乱，诸如癌症的形成或传播。为了本发 明，有利或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、削弱疾病的程度、疾病状态稳定 (即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以指与不接受治 疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的受试者包括早就患有疾病或紊乱的受试者以及 倾向于患上疾病或紊乱的受试者或者要预防疾病或紊乱的受试者。
“个体”或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。 哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、 灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，患者指人。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。
本发明的物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性 别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量涵盖 该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需 的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病 发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死 亡或破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y9°、 Re186> Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶 呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱 (vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、 美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素 (daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分 子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文 披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。“杀肿瘤”药引起肿瘤细胞 的破坏。
“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。
“化疗剂”指在癌症的治疗中有用的化学化合物。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括任何部分或完全阻断、抑制、或中和多肽 诸如ABCC3的生物学活性或其转录或翻译的分子。合适的拮抗剂分子包括但不限于拮抗 性抗体、多肽片段、寡肽、有机分子(包括小分子)、和反义核酸(包括siRNA)。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相似结构特征的糖蛋白。虽然抗 体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的 其它抗体样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水 平生成。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全 长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异 性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中 更为详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
术语“抗ABCC3抗体”或“能结合ABCC3的抗体”指能够以足够亲和力结合 ABCC3,使得该抗体可用作靶向ABCC3的治疗剂和/或诊断剂的抗体。优选的是，抗 ABCC3抗体结合无关、非ABCC3蛋白的长度小于抗体对ABCC3结合的约10%，根据放 射免疫测定法(RIA)的测量。在某些实施方案中，能结合ABCC3的抗体具有Sl μ Μ、<100ηΜ> <10ηΜ> <1ηΜ>或《0.InM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗ABCC3 抗体能结合在来自不同物种的ABCC3间保守的ABCC3表位。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的 抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含份区的抗体。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分存在于完整 抗体中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体 片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中， 抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有 关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。 在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如， 这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相 连。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自 具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。 胃蛋白酶处理产生一个F(ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
"Fv"是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链 Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链 Fv(SCFV)种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接， 使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中， 每个可变域的三个CDR相互作用而在Vh-V^二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六 个CDR—起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原 特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合 位点。
Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一 恒定域(CHl)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加 了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒 定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在成 对Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学 偶联形式。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和Vl结构域，其中这些结构 域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在Vh与Vl结构域之间进一步包含多肽 接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun， 于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编， Springer-Verlag, New York，第 ^9-3I5 页，I"4。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多 肽链(Vh-VJ中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(VJ。通过使用过短的接头 使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域 配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完 整的记载于例如 EP 404,097 ； W093/1161 ； Hudson et al. (2003)Nat.Med.9 129-134 ；及Hollingeretal., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四 抗体(tetrabody)也记载于 Hudson et al. QOO3) Nat.Med.9 1四-134。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突 变。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施 方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多 肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例 如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中 选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物 的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免 疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单 克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同， 单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单 克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释 为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通 过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler et al.，Nature256 495(1975)； Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2nd ed.1988 ； Hammerling et al., 于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas， 563-681，Elsevier, N.Y., 1981)、重组 DNA 法(参见例如美国专利 No.4,816,567)、噬 菌体展示技术(参见例如 Clackson et al., Nature 352 624-628(1991) ； Marks et al., J. Mol.Biol.222 581-597(1992) ； Sidhuetal., J. Mol.Biol.338 (2) 299-310(2004) ； Leeet al., J. Mol.Biol.340 (5) 1073-1093(2004) ； Fellouse, Proc.Nat.Acad.Sci.USAlOl (34) 12467-12472(2004) ； Leeetal., J. Immunol. Methods 284(1-2) 119-132(2004)),及 用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生 成人或人样抗体的技术(参见例如WO 98/24893 ； W096/34096 ； WO 96/33735 ； WO 91/10741 ； Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 2551 (1993) ； Jakobovits et al.， Nature 362 255-258(1993) ； Bruggemannet al., Year in Immuno.7 33(1993)；美国专 利 No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016 ； Marks et al., Bio/TechnologylO 779-783(1992) ； Lonberg et al.，Nature 368 856-859(1994)； Morrison, Nature368 812—813(1994) ； Fishwild et al.，NatureBiotechnol. 14: 845-851 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intem.Rev.Immunol.13 65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与 衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩 余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源， 以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和 Morrison et al., Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81 6851-6855 (1984))。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的 高变区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、 大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免 疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体 抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一 般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或 基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫 球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常 是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321 522-525(1986)； Riechmann et al.，Nature 332 323-329 (1988)； 和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献Vaswani andHamilton，Ann. Allergy, Asthma&Immunol.l 105-115 (1998) ； Harris, Biochem.Soc.Transactions 23 1035-1038(1995) ； Hurle and Gross, Curr.Op.Biotech.5 428-433(1994)。
“人抗体”指包含与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使 用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。此类技术包括筛选人衍生的组 合文库，诸如噬菌体展示文库(参见例如Marks等，J.Mol.Biol.，222 581-597(1991) 和 Hoogenboom 等，Nucl.Acids Res., 19 4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小 鼠-人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系来生成人单克隆抗体(参见例如Kozbor J.Immunol.， 133 3001(1984) ； Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51 页-第 63 页(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；禾口 Boerner 等，J.Immunol.，147 86(1991))；和在转基因动物(例如小鼠)中生成单克隆抗体， 所述转基因动物能够在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体的完全全集(参见 例如 Jakobovits 等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90: 2551(1993) ； Jakobovits 等，Nature， 362 255(1993) ； Bruggermann 等，Year in Immunol.，7 33(1993))。人抗体的这种定 义明确排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改 变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在 一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和 力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Markset al.，Bio/Technology 10 779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文 献记载了 HVR和/或框架残基的随机诱变Barbas et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91 3809-3813(1994) ； Schier et al., Gene 169 147-155(1995) ； Yelton et al., J. Immunol. 155 1994-2004(1995) ； Jackson et al., J.Immunol. 154 (7) 3310-9(1995)； Hawkins et al., J. Mol.Biol.226 889-896 (1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性 的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体部分或完全抑制抗原的生物学活性。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变 体:Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合 和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
术语“Fe受体”或“FcR”描述能结合抗体Fc区的受体。在一些实施方 案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是能结合IgG抗体的RxEU Y受 体)，包括FcyRI、Fc Y RII和Fc Y RIII亚类的受体，包括那些受体的各等位变体和各 可变剪接形式。？(^1111受体包括^^1111人(“活化受体”)和Fc Y RIIB ( “抑制受 体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体:Fc Y RIIA 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fc Y RIIB 在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见DaSron，Annu. Rev.Immunol.15 203-234(1997))。FcR 的综述参见 Ravetch and IGnet，Annu.Rev. Immunol.9 457-492(1991) ； Capel etal.，Immunomethods 4 25-34(1994)；及 de Haas etal.，J. Lab.Clin.Med.126 330-341(1995)。术语 “FcR” 在本文中涵盖其它 FcR，包 括那些未来将会鉴定的。
术语“Fe受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体:tgG转移 给胎儿(Guyer etal.，J.Immunol.117 587 (1976)及 Kim et al.，J.Immunol.24 249(1994)) 和调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的。可以测定人:FcRn 高亲和力结合多肽对人:FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人:FcRn的转基因小 鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了 Fc变异多肽的灵长类动物中。
W000/42072 (Presta)记载了对FcR的结合得到改进或消除的抗体变体。将该 专利出版物的内容明确收入本文作为参考。还可参见Shields etal.，J.Biol.Chem.9 (2) 6591-6604(2001)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实 施方案中，该细胞至少表达Fc Y RIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞 的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细 胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合至某些细胞毒 性效应细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体 (FcR)的免疫球蛋白使得那些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随 后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达 FcyRIII,而单核细胞表达 Fc Y RI、Fc Y RII 禾口 Fc Y RIII。 RavetchandIGnet, Annu.Rev. Immunol.9 457-92 (1991)第464页表3总结了造血细胞上的RxR表达。为了评估目的分 子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或 Presta美国专利No.6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个 核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC 活性，例如在动物模型中，诸如Clynes etal.，PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露 的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典 补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类 的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro etal.， J.Immunol.Methods 202 163(1996)中所记载的。
具有改变的Fc区氨基酸序列及提高的或降低的Clq结合能力的多肽变体加载于 美国专利Νο.6,194,551Β1和W099/51642。将那些专利出版物的内容明确收入本文作为 参考。还可参见 Idusogie et alJ.Immunol.164 4178-4184(2000)。
术语“含Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素。Fc区的 C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者 通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含 具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。
“细胞毒性抗体”指能够在结合至其靶抗原后发挥效应器功能和/或诱导细胞死 亡的抗体。
“免疫偶联物”或“抗体偶联物”指偶联有一种或多种细胞毒剂的抗体。
“小分子”或“有机小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿的有机分子。
“ABCC3结合寡肽”或“结合ABCC3的寡肽”或“ABCC3多肽结合寡肽”指能够以足够的亲和力结合ABCC3以使得该寡肽作为靶向ABCC3中的诊断剂和/或治疗 剂是有用的寡肽。在某些实施方案中，ABCC3结合寡肽对无关的、非ABCC3的蛋白质 的结合程度小于约10%的该ABCC3结合寡肽对ABCC3的结合，如通过例如表面等离振 子共振测定法所测量的。在某些实施方案中，ABCC3结合寡肽具有小于等于1 μ M、小 于等于ΙΟΟηΜ、小于等于ΙΟηΜ、小于等于InM、或小于等于O.lnM的解离常数(Kd)。
"ABCC3结合有机分子”或“结合ABCC3的有机分子”或“ABCC3多肽结合 有机分子”指与如本文中所定义的寡肽或抗体不同的、能够以足够的亲和力结合ABCC3 以使得该有机分子作为靶向ABCC3中的诊断剂和/或治疗剂是有用的有机分子。在某 些实施方案中，FGFR2结合有机分子对无关的、非ABCC3的蛋白质的结合程度小于约 10%的该ABCC3结合有机分子对ABCC3的结合，如通过例如表面等离振子共振测定法 所测量的。在某些实施方案中，ABCC3结合有机分子具有小于等于ΙμΜ、小于等于 ΙΟΟηΜ、小于等于ΙΟηΜ、小于等于InM、或小于等于O.lnM的解离常数(Kd)。
可以使用表面等离振子共振测定法来方便地测量任何分子结合靶多肽的解离常 数(Kd)。此类测定法可以采用于 25°C 的 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BiAcore, Inc., Piscataway, NJ)，其中固定化靶多肽CM5芯片在约10个响应单位(RU)。简言 之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC) 和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸钠pH 4.8将靶多肽稀释至5 μ g/ml (约0.2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分 钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入靶多肽后，注入IM乙 醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25°C以约25μ1/分钟的流速注入在 含0.05% Tween-20的PBS (PBST)中两倍连续稀释的结合分子(0.78nM至500nM)。使 用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcoreEvaluation Softwareversion 3.2)通 过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k。n)和解离速率(kj。平衡解离常数 (Kd)以比率 k。a/k。n 计算。参见例如 Chen，Y.，等，(1999)J.Mol.Biol.293 865-881 如果根据上文表面等离振子共振测定法，抗体的结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速 率可以使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(astop-flow equippedspectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度 计(ThermoSpectranic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量 PBS, pH 7.2中的20nM抗体(Fab形式)于25°C的荧光发射强度(激发=295nm ；发射 =340nm, 16nm带通)的升高或降低。
术语“标记物”在用于本文时指可检测化合物或组合物。标记物自身可以是可 检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化底 物化合物或组合物的化学改变，产生可检测产物。可充当可检测标记物的放射性核素包 括例如 1-131、1-123、1-125、Y-90、Re-188, Re-186, At-211、Cu_67、Bi-212、和 Pd-109。
“分离的”生物学分子，诸如核酸、多肽、或抗体，指已经鉴定且自其天然环 境的一种成分分开和/或回收的生物学分子。
II.对某些实施方案的描述
原发性乳腺肿瘤可以通过基因表达序型分析归类入至少三种主要亚型，而且各 亚型在患者存活方面具有不同的预后结果(9)。腔乳腺癌通常是雌激素受体阳性的， 而且特征为多种上皮特异性基因的协同表达、相对较好的预后、和较好的对靶向激素疗 法的响应率。HER2阳性乳腺癌特征为HER2癌基因的高水平基因扩增、相对较差的预 后(如果不治疗的话)、和临床显著受益于HER2靶向单克隆抗体曲妥单抗(Herceptin， Genentech) (3)。基样乳腺癌通常缺乏HER2、ER和孕酮受体表达，因此有时称作“三 联阴性”肿瘤(10，11)。基样乳腺癌具有相对较差的预后，而且当前尚未显示对任何靶 向疗法有响应(1 。这些亚型对术前化学疗法方案展示差异响应(1 ，但是在极大程度 上尚未确定这些差异下潜伏的药物抗性机制。
最近的研究揭示了乳腺癌细胞系大集合反映人乳腺肿瘤特征性的许多遗传和基 因组变化，并因此可充当一群分子异质的乳腺癌的模型系统(14)。例如，可以基于基因 表达序型分析签名将细胞归类入基样和腔的亚型，而且它们保留原发性肿瘤中大多数与 较差结果有关的高水平扩增和删除(14)。
将乳腺癌分子归类入具有共享特征和相似预后结果的亚型提供框架来开始个性 化癌症疗法的努力。本发明证明乳腺癌亚型在对抗有丝分裂剂的响应中显示清楚的差 异，其中基样亚型(basal-like subtype)最敏感。这种差异响应的一种机制是在腔的和 HER2扩增的细胞系子集中观察到，但在基样细胞系中没有观察到的ABCC3药物流出泵 (drag efflux pump)的扩增。
如实施例中所述，本发明利用经过分子表征的一组乳腺癌细胞系作为药物基因 组学分析模型来鉴定对如下两种基于抗有丝分裂的治疗剂的抗性机制和亚型响应差异， 单甲基-auristatin-E(MMAE)和帕利他塞。MMAE在结构上与多拉司他汀10相关，后 者是一种五肽天然产物，已经进行了癌症治疗的数项人体临床试验，而且展现有力的抗 肿瘤活性通过抑制微管蛋白聚合并如此使细胞微管失稳(1 。已经开发了 auristatin-单 克隆抗体偶联物，基本原理是经由抗体的特异性抗原识别实现的靶向投递药物会导致增 强的化疗功效同时不表达靶物的组织免于毒性(1 。帕利他塞及相关化合物多西他塞是 抗癌细胞毒性药物，它们稳定微管，而且在乳腺癌的治疗中广泛使用(16)。
基于实施例中列出的这些发现，发现染色体17 —个区域(17q21)的扩增与体外对紫杉烷类和auristatin类的抗性有强联系。扩增的区域包含至少100个基因。为了鉴定 有关基因，使用由RNA干扰和大容量分析组成的无偏办法来显示ABCC3基因的扩增和 伴随的过表达最有可能负责赋予对帕利他塞和MMAE的抗性。还显示了此扩增子存在于 原发性乳腺肿瘤中，而且它在HER2扩增的和腔的肿瘤(luminal tumors)中是常见的，但 是在基样细胞(basal-likecell)中并非如此(图6和9)。
因而，本发明的一个方面提供用于确定癌症是否会对抗有丝分裂剂处理有抗性 的方法。在一个实施方案中，该方法包括检测ABCC3基因是否在癌细胞样品中扩增。 ABCC3基因的扩增指示该癌症对抗有丝分裂剂有抗性。ABCC3基因扩增的检测可通过 本领域已知的任何方法来实施。在一个实施方案中，ABCC3基因扩增(的检测)是通过 检测癌细胞样品中ABCC3基因的拷贝数是否增加来实施的。在一些实施方案中，若拷贝 数为至少3、或者至少4、或者至少5、或者至少7、或者至少9、或者至少10，则基因是 扩增的。
基因拷贝数可通过本领域已知的任何手段来测定，例如通过荧光原位杂 交(FISH)、Southern印迹、免疫组织化学(IHC)、聚合酶链式反应(PCR)、定 量PCR(qPCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、比较基因组杂交、基于微阵列的比较 基因组杂交、或连接酶链式反应(LCR)。 参见例如Avison，M.，MeasuringGene Expression, New York Taylor&Francis Group，2007, Allison, D.B., et al，ed.DNA Microarrays and Related Genomics Techniques Design, Analysis, andlnterpretation of Experiments (Biostatistics)，Boca Raton Chapman&Hill/CRC，2006; Hayat M.A., ed.， Handbook of Immunohistochemistry and in SituHybridization of Human Carcinomas， Burlington Elsevier Academic Press，2004。
在又一个实施方案中，确定癌症是否会对抗有丝分裂剂有抗性的方法包括检测 癌细胞样品中ABCC3基因是否过表达。ABCC3基因的过表达指示该癌症对抗有丝分 裂剂有抗性。ABCC3过表达的检测可通过本领域已知的任何方法来实施。在一个实施 方案中，ABCC3基因过表达是通过测定来自ABCC3基因的mRNA转录水平来检测的。 mRNA转录水平可以通过本领域技术人员知道的各种方法定性或定量地测定。mRNA 转录水平还可以通过检测自mRNA生成的cDNA的水平直接或间接地测定。用于测定 mRNA转录水平的例示性方法包括但不限于PCR、实时定量RT-PCR和基于杂交的测定 法，包括基于微阵列的测定法和基于滤器的测定法诸如Northern印迹。在某些实施方案 中，若mRNA转录水平与适宜的对照样品相比升高至少3、5、7、10、15、20、25、30、 35、40、45、或50倍，则ABCC3基因是过表达的。
在其它实施方案中，ABCC3基因的表达是通过测定ABCC3多肽表达水平来检 测的。ABCC3多肽水平可通过本领域技术人员知道的某些方法定性或定量地测定，包括 基于抗体的检测方法。在一个实施方案中，检测测试癌症样品中的ABCC3基因表达包括 使测试癌症样品与抗ABCC3抗体接触并通过检测抗ABCC3抗体对ABCC3多肽的结合来 测定测试癌症样品中的ABCC3表达水平(定性或定量)。在某些实施方案中，抗ABCC3 抗体对ABCC3多肽的结合可通过本领域技术人员知道的各种方法来检测，包括但不限于 免疫组织化学、荧光激活细胞分选、Western印迹、放射免疫测定法、ELISA、等等。在 某些实施方案中，ABCC3过表达意味着ABCC3多肽水平与适宜的对照样品相比升高至少 3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、或 50 倍。
癌细胞样品或测试癌症样品优选包含直接取自癌症肿瘤的细胞，但是测试癌症 样品也可包含转移的癌细胞、循环中的肿瘤细胞、或鉴定癌症中ABCC3基因扩增或表达 状态的细胞的任何合适样品。可测试的癌症的例子包括乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、 前列腺癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、 肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤、结肠癌、 直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白 血病和其它淋巴增殖性病症、各种类型的头颈癌、和适合于使用抗有丝分裂剂治疗的任 何其它癌症。
用于确定癌症中ABCC3过表达的适宜对照可例如通过测定表达正常水平 ABCC3的细胞或组织的对照样品中的ABCC3表达水平并将癌症中的ABCC3表达水平 与对照样品中的ABCC3表达水平比较来生成。或者，对照可通过测定用于确定ABCC3 过表达的相同测试癌症样品中或来自要测试ABCC3过表达的相同癌症的样品中持家基因 (诸如肌动蛋白家族成员)表达来生成。持家基因充当比较对照，以此确定ABCC3基因 过表达。
因而，ABCC3扩增和/或过表达的检测容许患有癌症的患者选择最有可能成功 治疗其癌症的适宜治疗方法。
因而，本发明的一个方面是提供用于为基于抗有丝分裂剂的化学疗法选择癌症 患者的方法。那些其癌症显示ABCC3扩增或过表达的患者可使用该信息与他们的内科医 师一起来决定他们是否应当采用抗有丝分裂疗法以外的治疗剂。在一个实施方案中，该 方法包括检测ABCC3基因是否在来自患者的测试癌症样品中扩增，并且，若在测试癌症 样品中没有检测到ABCC3基因扩增则选择该患者进行基于抗有丝分裂药物的化学疗法。 在另一个实施方案中，该方法包括检测ABCC3基因是否在来自患者的测试癌症样品中过 表达，并且，若在测试癌症样品中没有检测到ABCC3基因过表达则选择该患者进行基于 抗有丝分裂药物的化学疗法。
在一个实施方案中，患者是乳腺癌患者。在又一个实施方案中，患者具有Her2 阳性乳腺癌。与具有HER2阴性、雌激素受体阳性、结节阳性乳腺癌的患者相比，乳腺 癌中HER2的表达或扩增(Her2阳性乳腺癌)与多柔比星辅助治疗后添加抗有丝分裂剂 帕利他塞的临床受益增强有关(5 。然而，显著比例的具有HER2阳性肿瘤的女性未 能显示存活受益于这种治疗(5 ，提示帕利他塞抗性机制存在于一定比例的HER2阳性 乳腺肿瘤中。对于利用偶联有抗有丝分裂剂的抗Her2抗体诸如例如曲妥单抗-DMl抗 体偶联物的治疗方案，这种对抗有丝分裂剂的抗性特别受关注。如实施例中所例示的， ABCC3过表达与对曲妥单抗-抗有丝分裂剂偶联物处理的抗性有关。相反，用SiRNA敲 低ABCC3基因提高细胞对曲妥单抗-抗有丝分裂剂偶联物处理的敏感性。因而，本发明 提供为抗Her2抗体-抗有丝分裂剂偶联物处理选择Her2阳性乳腺癌患者的方法。在一 个实施方案中，该方法包括检测ABCC3基因是否在来自患者的测试乳腺癌样品中扩增， 并且，若在该测试乳腺癌样品中没有检测到ABCC3基因扩增则选择该患者进行抗Her2 抗体-抗有丝分裂剂偶联物处理。在另一个实施方案中，该方法包括检测ABCC3基因 是否在来自患者的测试乳腺癌样品中过表达，并且，若在该测试乳腺癌样品中没有检测到ABCC3基因过表达则选择该患者进行抗Her2抗体-抗有丝分裂剂偶联物处理。在 一些实施方案中，该方法涉及确定患者是否具有Her2阳性乳腺癌(如果此信息早先不知 道的话)，如此确定用抗Her2抗体疗法治疗的合适性。在一些实施方案中，抗Her2抗 体-抗有丝分裂剂偶联物是曲妥单抗-抗有丝分裂剂偶联物诸如曲妥单抗-DMl或曲妥单 抗-MMAE。
本发明还提供根据患者癌症的ABCC3扩增状态来治疗癌症患者的方法。在一 个实施方案中，该方法包括检测ABCC3基因是否在来自患者的测试癌症样品中扩增， 并且，若在测试癌症样品中没有检测到ABCC3基因扩增则对患者施用治疗有效量的基于 抗有丝分裂药物的化学疗法。在另一个实施方案中，该方法包括检测ABCC3基因是否 在来自患者的测试癌症样品中过表达，并且，若在测试癌症样品中没有检测到ABCC3基 因过表达则对患者施用治疗有效量的基于抗有丝分裂药物的化学疗法。在一个实施方案 中，患者具有Her2阳性乳腺癌，而且，若在测试癌症样品中没有检测到ABCC3基因扩 增或过表达则施用抗Her2抗体-抗有丝分裂剂偶联物。在一些实施方案中，抗Her2抗 体-抗有丝分裂剂偶联物是曲妥单抗-抗有丝分裂剂偶联物诸如曲妥单抗-DMl或曲妥单 抗-MMAE。
在又一个实施方案中，根据患者的癌症中没有ABCC3扩增或过表达来选择患者 进行基于抗有丝分裂药物的化学疗法，并且施用治疗有效量的基于抗有丝分裂药物的化 学疗法。在一个实施方案中，所选择的患者具有Her2阳性乳腺癌且施用抗Her2抗体-抗 有丝分裂剂偶联物。在一些实施方案中，抗Her2抗体-抗有丝分裂剂偶联物是曲妥单 抗-抗有丝分裂剂偶联物诸如曲妥单抗-DMl或曲妥单抗-MMAE。
本发明的另一个方面提供鉴定与药物敏感性改变有关的基因扩增变异的方法。 迄今为止大多数致力于了解药物抗性的体外序型分析努力集中于基因表达分析。本发明 描述经由分析高密度SNP阵列序型(Affymetrix)来鉴定与药物敏感性改变有关的DNA拷 贝数改变的。最近的研究显示了高密度单核苷酸多态性6NP)阵列在它们的预定基因分 型应用之外可用于检测人类癌症中的基因组范围DNA拷贝数变化和杂合性损失(17)。这 些阵列已经显示出可用于通过查明经常删除或扩增的染色体区域来鉴定肿瘤抑制基因和 癌基因基因座(18)。
本文中所呈现的数据显示这些阵列可用于鉴定包含可能调控治疗性药物活性的 基因的扩增区域。这种办法的一项关键优点在于基因扩增事件相对稳定且最终能在来自 临床试验的归档样品上化验。一种特别适合于检测归档样品中基因扩增事件的测定法是 荧光原位杂交(FISH)。FISH测定法早就成为HER2阳性MBC诊断的例行临床实践的一 部分(50)，而且当前正在作为用于检测EGFR扩增的诊断测试进行评估，EGFR扩增是对 Tarceva或Erbitux的响应的一种可能的生物标志物(51)。
本发明的又一个方面提供为那些其癌症包含ABCC3扩增和/或过表达的患者确 定抗有丝分裂剂剂量给药适宜水平的方法。在一个实施方案中，该方法包括确定ABCC3 是否在患者的测试癌症样品中扩增和/或过表达，并且，若ABCC3扩增或过表达则对患 者使用剂量增大的抗有丝分裂剂。抗有丝分裂剂的剂量增大至癌症显示对抗有丝分裂剂 处理有响应的量。在一些实施方案中，对患者施用的抗有丝分裂剂剂量是对其癌症不包 含ABCC3扩增和/或过表达的患者施用的量的至少1.2倍、或至少1.3倍、或至少1.5倍、或至少2倍、或至少2.5倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍。
本发明的又一个方面提供降低癌细胞对抗有丝分裂剂的抗性的方法，包括使癌 细胞与ABCC3的拮抗剂接触。在一些实施方案中，ABCC3拮抗剂用于阻止ABCC3扩增 和/或过表达及降低由该扩增和/或过表达赋予的药物抗性。在其它实施方案中，ABCC3 拮抗剂用于抑制ABCC3活性。在这些方法中有用的拮抗剂包括ABCC3抗体，基于RNA 干扰(RNAi)的 ABCC3 拮抗剂尤其是反义 RNA、miRNA、siRNA、和 shRNA，ABCC3 多肽结合寡肽，和ABCC3结合有机分子。
本发明的又一个方面提供用于治疗具有对抗有丝分裂剂有抗性的癌症的患者的 联合疗法，包括对该患者施用ABCC3的拮抗剂和抗有丝分裂剂。在一些实施方案中，该 拮抗剂选自ABCC3抗体和与ABCC3结合的siRNA。在一些实施方案中，该抗有丝分裂 剂选自紫杉烷类、美登木素生物碱类、和auristatin类，及其类似物和衍生物。在一些实 施方案中，该抗有丝分裂剂偶联至抗体，诸如美登木素生物碱-抗Her2抗体偶联物，例 如曲妥单抗-DM1。在一个实施方案中，该联合疗法包括用与ABCC3结合的siRNA和 曲妥单抗-DMl处理。
上文所述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或 分开的配制剂中)和分开施用，其中ABCC3拮抗剂的施用可发生于抗有丝分裂剂的施用 的之前、同时、和/或之后。
在一个实施方案中，ABCC3拮抗剂是抗ABCC多肽抗体。例示性的抗体包括 多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体。
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(SC)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂 来生成。将相关抗原(尤其在使用合成肽时)与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质 偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥 珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、 琥珀酸酐、S0C12、或R1N = C = NR,其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔i威.血 蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。在某些实 施方案中，用于生成抗体的动物可以是转基因动物。在某些此类实施方案中，可以改造 动物使得它们展现编码ABCC3的多核苷酸的完全缺失，使得它们没有ABCC3表达(称 作“敲除”动物)。生成此类动物的方法是本领域公知的，参见例如Snouwaertet al.， Science 257 1083，1992 ； Lowell etal.，Nature 366 740-42，1993 ； Capecchi, M.R., Science 244 1288-1292, 1989。在敲除了特定蛋白质或肽的动物中生成针对该蛋白质或 肽的抗体可能是有利的，因为该动物中不会发生可能降低该抗体生成和/或产量的抗自 身反应，正如本领域公知的。
通过将例如100 μ g或5 μ g蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的 弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶 联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中肽或 偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的 抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋 白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
单克隆抗体可以通过最初由Kohler etal.，Nature 256 495 (1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。
本发明的抗ABCC3抗体还可包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠源)抗 体的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫 球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗体的其它抗原结合子序列)。 人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异 性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的免疫 球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源 化抗体还可包含在受体抗体或输入CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人源化 抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个CDR区 对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且整个或基本上整个FR区是人免疫球蛋白共有序列 的FR区。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋 白的恒定区(Jones et al.，Nature 321 522-525(1986) ； Riechmannet al.，Nature 332 323-329(1988) ； Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992))。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗体 具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输 入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的 方法进行(Jones et al., Nature 321 522-525(1986) ； Riechmann et al., Nature 332 323-327(1988) ； Verhoeyen et al., Science 239 1534-1536 (1988))，通过用啮齿类 CDR序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利 4,816,567)，其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中， 人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位 点的残基替代的人抗体。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于制备人源化抗体的人可变区的选择， 包括轻链和重链，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)非常重要。根据所 谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文 库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的人框架区(FR)用 于人源化抗体(Simset al.，J.Immunol.151 2296(1993) ； Chothiaetal.，J.Mol.Biol.196 901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚型的所有人抗体的共有序列衍生的 特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter etal.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA39 4285(1992) ； Presta etal., J.Immunol.151 2623 (1993))
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力以及其它有利的生 物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三 维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋 白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候 选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基 在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原 的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗 体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结 合的影响。
设想了人源化抗ABCC3多肽抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片 段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。或者，人源化抗体可 以是完整的抗体，诸如完整的:tgGl抗体。
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免 疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。 例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合删除导致内源 抗体生成的完全抑制。将大量人种系免疫球蛋白基因转移到此类种系突变小鼠中将导 致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 2551 (1993) ； Jakobovits etal.，Nature 362 255-258(1993) ； Braggemann et al.，Year in Immuno.7 33(1993)；美国专利 5,545,806，5,569,825，5,591,669 (都是 GenPharm 的)； 5,545,807 ；及 WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCaffertyetal.，Nature ；348 552-553 (1990))可用于 在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根 据这种技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白 基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬 菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那 些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以 多种形式进行，综述参见例如 Johnson，Kevin S.and Chiswell, David J.，Current Opinion inStructural Biology 3 564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。 Clackson et al., Nature 352 624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组 合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Markset al.，J.Mol.Biol.222 581-597(1991)或 Griffith etal.，EMBO J.12 725_7；34 (1993)所述技术，由未免疫人供体 构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专 利 5,565,332 和 5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来 生成人抗体。
在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。片段的大小较小，容许 快速清除，可导致对实体瘤的进入提高。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整 抗体来衍生这些片段(参见例如 Morimoto et al., Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24 107-117(1992) ； Brennan et al.，Science 229 81(1985))。然而，现在可 直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和 由大肠杆菌分泌，由此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文 库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab' -SH片段，并通过化学方法偶联 形成 F(ab' )2 片段(Carteret al.，BioATechnology 10 163-167(1992))。依照另一种方 法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab' )2片段。包含补救受体结合表位残基、具 有延长的体内半衰期的Fab和F(ab' )2片段描述于美国专利5,869,046。用于生成抗体片 段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv 片段(scFv)。参见WO 93/16185 ；美国专利5,571,894 ；和美国专利5,587,458。Fv和SFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一种类；因此，它们适合于在体内使用过程中 降低非特异性结合。可构建SFv融合蛋白以生成效应物蛋白质位于SFv氨基末端或羧基 末端的融合。参见《AntibodyEngineering》，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以 是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特 异性的或双特异性的。
可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，例如为了增强抗体的抗体依赖 性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗 体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨 酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的 内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。 参见 Caron et al.，J.Exp.Med.176 1191-1195 (1992)禾Π Shopes，B., J.Immunol.148 2918-2922 (1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.， Cancer Research 53 2560-2565 (199 中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改 造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al., Anti-Cancer Drag Design 3 219-230 (1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美 国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文 时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgGp IgG2, IgG3或IgG4)Fc区中负 责提高:tgG分子体内血清半衰期的表位。
另一种潜在的ABCC3拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建 物，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交并防止蛋白质翻译来起直接 阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA来控 制基因表达，二者都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，可将编码本文中成 熟ABCC3多肽的多核苷酸序列的5'编码部分用于设计长度为约10-40个碱基对的反义 RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计成与基因中参与转录的区互补(三股螺旋-参见 Lee 等，1979，Nucl.Acids Res.6 3073 ； Cooney 等，1988，Science 241 456 ； Dervan 等，1991，Science 251 1360),由此防止转录和产生ABCC3多肽。反义RNA寡核苷 酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA分子翻译成为ABCC3多肽(反义-Okano，1991， Neurochem.56 560 ； Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCPress Boca Raton, FL, 1988)。上述寡核苷酸还可递送至细胞，使得反义RNA或 DNA可在体内表达以抑制ABCC3多肽的生成。在使用反义DNA时，优选衍生自靶基因 核苷酸序列的翻译起始位点(例如约-10到+10位置之间)的寡脱氧核糖核苷酸。
小干扰RNA(siRNAs)指长度一般小于30个核苷酸且降低靶基因表达的双链 RNA分子。SiRNA已经证明可用作其中传统拮抗剂诸如小分子或抗体失败的调控基因表 达的研究中的工具(ShiY.，Trends in Genetics 19(1) 9-12(2003))。长度为 21 到 23 个 核苷酸的体外合成的双链RNA可起干扰RNA(iRNA)的作用，且能特异性抑制基因表达 (FireA., Trends in Genetics 391 ； 806-810 (1999)) 这些 iRNA 通过介导其靶 RNA 的降 解起作用。然而，由于它们的长度低于30个核苷酸，因此它们不会触发细胞抗病毒防御 机制。在本发明的一些实施方案中，SiRNA与ABCC3编码多核苷酸的编码序列的一部分 或其互补序列具有至少约 90%、91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99%,或100%核酸序列同一性。
本发明的ABCC3多肽结合寡肽指结合(优选特异性结合)本文所述ABCC3多 肽的寡肽。ABCC3多肽结合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法学化学合成，或者可以 使用重组技术制备和纯化。ABCC3多肽结合寡肽的长度是至少约5个氨基酸，或者长 度为至少约 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24,25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更长，其中此类寡肽能够结合(优选特异性结合)本文所述ABCC3 多肽。ABCC3多肽结合寡肽无需过多试验就可使用公知技术来鉴定。在这点上，注 意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域公知的(参见 例如美国专利号 5,556,762，5,750,373，4,708,871，4,833,092，5,223,409，5,403,484， 5,571,689，5,663,143 ； PCT 公布号 W084/03506 和 WO 84/03564 ； Geysen 等，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.81 3998-4002(1984) ； Geysen 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82 178-182(1985) ； Geysen 等，in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)； Geysen 等，J.Immunol.Meth.102 259-274(1987) ； Schoofs 等，J.Immunol. 140 611-616(1988) ； Cwirla, S.E.等，(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 6378 ； Lowman, H.B.等，(1991)Biochemistry 30 10832 ； Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ； Marks, J.D.等，(1991)，J.Mol.Biol.222 581 ； Kang, A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88 8363 ； Smith, G.P., (1991) Current Opin.Biotechnol.2 668)。
在这点上，噬菌体展示是一种可以筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够 特异性结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的 融合蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术6cott，J.K.andSmith, G.P. (1990)Science 249 386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆 cDNA)的大型文库迅速且有效的分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展 示肽(Cwirla, S.E.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 6378)或蛋白质(Lowman， H.B.等，(1991)Biochemistry 30 10832 ； Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ； Marks, J.D.等，(1991) J.Mol.Biol.222 581 ； Kang，A.S.等，(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA88 8363)文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些 (Smith, G.P. (1991) Current Opin.Biotechnol.2 668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要 构建和扩增大量变体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果 的手段。参见美国专利 5,223,409，5,403,484，5,571,689 和 5,663,143。
产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利No.5,723,观6，5,432,018， 5,580,717，5,427,908，5,498,530，5,770,434，5,734,018，5,698,426，5,763,192， 和 5,723,323。
ABCC3多肽结合小分子优选指本文所定义的寡肽或抗体以外，结合(优选特异 性结合)本文所述ABCC3多肽的有机分子。ABCC3多肽结合有机小分子可以使用已知方 法学来鉴定和化学合成(参见例如PCT
发明者卡罗尔·奥布赖恩, 卢卡斯·C·阿姆勒, 盖伊·卡维特, 阿杰伊·潘迪塔, 马克·拉克纳 申请人:健泰科生物技术公司