专利名称：一种在植物中生产人类蛋白质的方法,特别是在谷物胚乳中生产人重组溶酶体酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种人类蛋白质的生产，特别是重组人溶酶体酶酸性β-葡萄糖 苷酶(E.C.3.2丄45)，通过植物即谷物品种的转化和遗传操纵来生产。本发明优先应用的 物种是水稻(栽培水稻)，因为是通过去除胚芽和糊粉层来实现工业种子的生产，所以种 子部分包含大部分的脂类和蛋白质污染物。同样的技术可以应用在胚乳特异性来表达其他人类溶酶体酶，这些酶的功能缺 失或者不完整会引起病理状态。
背景技术：
罕见病是一组遗传异质性疾病，具有在人群中发病率和盛行率低的特点。表现 为慢性起病，并可能产生严重的、无效的后果，或可致命。罕见病包括溶酶体贮积症，是由特异的溶酶体酶或载体蛋白的缺失引起的。这 一类疾病中包括戈谢病、糖原贮积症II型、法布瑞氏症、尼曼克氏B症以及黏多醣贮 积症I型、II型和IV型。对这些病的治疗主要是静脉注射缺失的酶(酶替代治疗)。例 如，戈谢病的治疗可以通过终生定期地注射人酸性β-葡萄糖苷酶来实现。然而，这种 疗法非常的昂贵，因此并不能适用于所有的病人。酶替代治疗的高成本，主要取决于由 人或哺乳动物细胞培养生产酸性β“葡萄糖苷酶所带来的困难。无论从技术角度抑或是经济角度看，基因工程植物都能作为一种溶酶体酶尤其 是重组酸性葡萄糖苷酶的生产体系替代途径，因为植物栽培需要相对便宜的材料， 并且农业基础设施在田地中已经存在。在WO-A_97/10353(WO，353)专利中，溶酶体酶包括人酸性β -葡萄糖苷酶的 合成，只是在叶子并且是烟草(烟草属)这种生物的叶子中有报道。WO’ 353讨论了一 个值得怀疑的方法，其中叶片组织中的水分含量很高(也就是目的蛋白的高分散性)，并 且大量的蛋白污染物、多酚、橡胶、渗出物、有毒生物碱，均会导致酶的提取和纯化过 程复杂化。此外，通过正常植物的代谢改变所引起的植物毒害现象也不能排除；这些现象 尤其相关，因为他们可能会突然发生，而且不能以一个可预知的方式来解决。 在WO’ 353中，酸性β-葡萄糖苷酶的表达在烟草转化之后，转化是在以具 有MeGa启动子(是伤诱导的，源于番茄HMG2启动子)或者CaMV 35S启动子的表达 载体下进行的。后者是一个人所共知的，且被广泛应用的组成型基因转录调控元件。在 WO’ 353中，一般认为其他组成型的或者诱导型的启动子可被用于同样的目的。至于受伤诱导启动子而言，在WO’ 353中，其使用严格限制在叶子上，并且为 了表达酸性β-葡萄糖苷酶，植物必须预先受伤。预受伤导致成本的增加和更加复杂的 生产过程管理，而且很可能会导致液泡或胞间存在的蛋白酶部分酶降解，以及细菌和真 菌引起的受伤材料严重污染。
WO’ 353认为光诱导型启动子除了在叶肉组织中外，如在种子，特别是谷物类 的种子中几乎不能得到有效地表达，这是由于缺乏通常存在于光合组织中透射光辐射和 (或)转录因子。至于组成型的启动子，所有例子均提到CaMV 35S启动子，并考虑到它的代表 性。然而，许多实验表明，CaMV 35S在种子中的转录效率较低，以至于排除了所有外 源蛋白合成的机会。这种说法在单子叶植物(如谷物)中更有意义，其中启动子似乎也 不太适合叶片组织中基因的直接高效表达。在WO-A-03/07389(W()，839)中，据报道，在CaMV 35S启动子的控制下，
在免疫学检测水平进行了特异性抗体的检测，一个基因编码突变形式的葡萄糖苷酶 在种子中不能表达。因此，与WO，839中断言的一样，我们很可能得出如下结论专利WO，353 实际上并不能提供一个能指导人们在非叶肉组织(尤其是种子中)生产人酸性葡萄糖 苷酶或其它溶酶体酶的方法。此外，后来的实验(Reggi等，2005，植物分子生物学，57: 101-113)已证明， 关于专利WO’ 353中给出的在烟草叶片中生产β-葡萄糖苷酶的资料，其可获得的酶量 低于行业吸引力。而且，如WO’ 353所示，从叶生物量中可以纯化的酶量，当用酶活 来表达时甚至更少，同时也支持了叶表达系统中的技术限制，尤其是与组成型启动子有关。在WO’ 839中报道，种子中生产溶酶体酶是可能的，在这个体系中的表达水平 可以满足产业化开发的需要。此外，它还指出，由于酶是在质外体中积累的(即胞外空 间具有略酸性PH的特点)，因此可以一种稳定的形式保藏相当长的一段时间。然而，专利WO’ 839中既没有提供在单子叶植物中生产溶酶体酶(尤其是酸性 β-葡萄糖苷酶)的指导方法，也没有给出如何避免、减少以及克服在种子中与组织表达 和酶的亚细胞定位(尤其是酸性β _葡萄糖苷酶)等相关的问题及相应的限制。实际上， 这些方面问题没得到解决并不因为未知或疏忽。实际上，专利WO’ 839中的例子解决了生产溶酶体酶的表达载体构建，同时也 报道了双子叶植物贮藏蛋白启动子的使用。实例中关于溶酶体酶的实际表达量，受到酸 性β-葡萄糖苷酶的突变形式以及宿主植物的限制，因为所用的宿主植物始终是烟草(烟 草属)。对于专利WO’ 839说明中，并没有提到由酸性β-葡萄糖苷酶在种子中积累而 引起的转基因烟草或其后代的植物毒性作用。因此，这个体系对解决溶酶体酶尤其是酸 性葡萄糖苷酶的生产是有效的。然而，随后在转基因烟草种子上进行的实验，与专利WO’ 839具有相同的构建 体系，揭示了 葡萄糖苷酶的积累会引起种子活力的严重反弹。特别地，已被证明的 是在酶浓度达到200单位/每千克种子时(1个酶单位就是在PH 5.9、温度37°C时，每分 钟分解1微摩尔4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷所用的酶量)，会出现繁殖异常现象，这是 由种子活力低以及萌发不良所引起的。此外，当酶浓度高于500单位/每千克种子时， 种子活力完全受损。专利申请人所进行的进一步试验， 与专利WO’ 839具有相同构建体系，表明 转基因烟草种子活力是不能用任何已知方式所恢复的。申请者通过电子显微镜发现，丧失活力的种子细胞膜系统组织结构被破坏，证实了无法从转基因株系获得具有活力的后 代，虽然这些株系理论上是能用来开发工业生产用酶。经由电子显微镜证实，贮藏位点 与专利W0’ 839构建体系中实际上并不相符，在专利W0’ 839中应该在质外体空间， 但实际上在液泡贮藏蛋白内部胚胎软组织细胞中。与专利WO，839相似的是申请专利WO-A_00/04146(WO，146)，其介绍了
植物种子中人乳铁蛋白和具有通用酶活力的蛋白表达情况，并未提供任何有关生产功能 活性酶，尤其是溶酶体酶的方法。在专利WO’ 146中，没有证据支持酶生产过程的有 效性，与稳定性、构象和功能有关的问题却完全被忽略了。一般情况下，尽管从原则上 讲，可以通过优良植株的体外繁殖获得生产工业酶量的植物，但是这种体系的使用，不 可避免地使生产周期复杂化，因为需要在一个相对较短的时间内将大量的植物移植到田 地里。计划为了得到60吨的转基因烟草种子以满足意大利对β-葡萄糖苷酶的需求，至 少 已经投资了 150公顷土地。更重要的是，在体外生产中，至少需要9百万烟草植株进 行温室驯化和田地移植。关于过程管理和经济问题，这显然是一个明显不同的情况，转基因种子需要窄 行播种，而后者只是在种子有活力的情况下适用，这也会使得单位面积的种子生产费用 比标准烟草作物高出4-6倍，这是因其具有更高的种植密度。通过移植获得与直接播种 相近的种植密度是不可能的，因为从生产的角度来看，这种成本是难以得到补偿的。事 实上，在植物生产和单位面积的植物数量之间存在一个反比关系。至于微繁成本，每株 植物均应单独处理，加之每株烟草的种子产量非常低(几克)，这会大幅降低开发这种植 物作为宿主体系生产溶酶体酶的优势。本发明的目的是通过植物，尤其是在单子叶植物，生产一种人类蛋白质，特别 是在谷物胚乳中生产重组人溶酶体酶。这个新的设计过程克服了现有技术水平中的难 题，更具体地说-可以有效地进行溶酶体酶组织表达和亚细胞定位，尤其是种子中的人酸性 β“葡萄糖苷酶和α“葡萄糖苷酶；-使得蛋白的提取和纯化过程更加地便捷；-消除了植物毒性现象的风险；-不会影响种子活力；-经济上比较方便；-极大地方便了生产过程的管理；-消除了部分酶降解的风险；-大大减少了细菌和真菌的污染程度。申请者已经设计、测试，呈现了本发明能克服现有工艺水平的缺点，并获得这 些及其它目的和优势。
发明内容
本发明的提出具有独立权利要求及其特点，而从属权利要求说明了本发明的其 他特点或者主要发明想法的变体。按照上面所述目标，在植物中生产人类蛋白质，尤其是在植物胚乳中生产重组人溶酶体酶的过程包括-首先是植物转化来获得蛋白，并将其固定在胚乳中，最终，这些蛋白不会被胚 胎吸收，且大量蛋白的存在不能影响种子的活力及萌芽率；-在第一步的植物转化中，用到一个胚乳特异性上游启动子基因编码的所述蛋 白，以及一个信号肽共翻译转运新合成的蛋白至胚乳细胞内质网腔，用以组织特异性积 累；-第二步是植物种子胚乳中的蛋白积累。本发明可使异源蛋白在贮藏组织中积累，而不被种子胚乳吸收。本发明还证实 了，具有潜在的、高的植物毒性或结构破坏性的积累蛋白不会被胚吸收，而是在发育完 成时采取自发凋亡。此外，在无生命组织中很可能会积累具有潜在植物毒性的蛋白，在种子的吸涨 萌发后会进行急剧地水解。这些具有潜在危害的蛋白质会积累在蛋白贮藏液泡或蛋白体中，无需接触或穿 越细胞膜。本发明可以得到产物蛋白准确的氨基酸序列，而不是由新氨基酸存在形成的蛋 白非真实变体，如果这些新氨基酸对蛋白的运输、稳定性、生物活性以及治疗用途无 潜在的有害性的话，也是无用的。所合成的蛋白质可方便地在胚乳内的蛋白贮藏液泡 (PVSs)或蛋白体(PBs)内积累。因为从蛋白贮藏液泡或蛋白体中提取蛋白质极为相似， 根据本发明的有效性，所述蛋白在上面所述所引的一个或其他亚细胞间隔中的定位是无 关紧要的。本发明的实施方案意味着构建一个植物转化的表达载体包括以下一些要素i)天然或人为来源的胚乳特异性启动子。ii)天然或人为来源的5’端非编码区。iii)天然或人为来源的核苷酸序列编码的信号肽，能够将重组蛋白锚定在胚乳细 胞内质网腔中，并决定了所述蛋白在特异组织中的积累。iv)天然或人为来源的核苷酸序列编码的成熟形式的人类蛋白质。ν)天然或人为来源的3’端非编码区。可用来做植物转化的载体。方便的是，表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.1报道的。根据本发明的实施方案，将表达载体直接或间接导入做植物转化的细菌菌株 中。方便的是，所选菌株属于大肠杆菌、根癌土壤杆菌和毛根农杆菌组。转化的植物最好是谷物。 根据首选的实施方案，细菌菌株是用来转化水稻(粳稻，CRW3自交系)胚性 愈伤组织的。根据有利变体，溶酶体酶是人酸性β-葡萄糖苷酶。在另一个变体中，溶 酶体酶是人酸性α-葡萄糖苷酶。实际上，本发明在合成、提取、纯化许多重要的人酸性α-葡萄糖苷酶前体 中，是同样有效的，这些前体与人酸性葡萄糖苷酶具有完全不同的分子量、结构和 功能。根据实施方案，本发明在工业化种子生产中包括三步。根据解决方案，为了去除纤维成分、胚芽和含有许多蛋白污染物的糊粉层，工业生产需要脱壳和漂白所收获的成熟种子。根据进一步的实施方案，本发明包括四步法去纯化重组蛋白。首选的纯化步骤 包括疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤，按照上面所述顺序进行。此外，纯化步骤还 包括，另外(或)与在下文报道实例中的化学成分、结构和(或)功能相似的层析树脂的 应用，洗脱条件的部分修改，阶段重现，例如通过在层析柱中重装一个分级洗脱。依据本发明，纯化后酶量可以轻松达到100单位/千克种子，或甚至达到500单 位/千克种子。另外，纯化的酶活性很高，并没有出现氨基酸的删除、增加或者替换， 在这方面完全等同于人源的天然类似物。此外，胚乳中酶的积累不会导致种子活力及萌 芽率的改变。用来生产酶的分子盒通常由其后代遗传下去，且任何孟德尔基因均可进行纯合 或通过与其它转化系杂交而转移，证实了在两种情况下均可提高酶产量。本发明相关的方法不同于已知的技术，具有明显的创新和优势，因为它可以获 得转基因株系，如水稻，可以实现人酸性葡萄糖苷酶的工业相关量。没有改变正常 的表型(在宏观和微观层面)，且没有繁殖异常或改变种子活力及萌芽率，同时，酶量还 可以达到500单位/千克种子。这个过程提取和纯化的酶是完全具有活力的，与人源的 天然类似物相比，未改变其氨基酸序列。本发明内的核苷酸序列是可通过植物转化来表达人类蛋白质，尤其是植物胚乳 中的重组人溶酶体酶。上面所述的核苷酸序列包括下面一些元件i)天然或人为来源的胚乳特异性启动子；ii)天然或人为来源的5’端非编码区。iii)天然或人为来源的核苷酸序列编码的信号肽，能够将重组蛋白锚定在胚乳细 胞内质网腔中，并决定了所述蛋白在特异组织中的积累。iv)天然或人为来源的核苷酸序列编码的成熟形式的人类蛋白质。ν)天然或人为来源的3’端非编码区。依据本发明的实施方案，(i)启动子是水稻谷蛋白4启动子(GLuB4pr0)，其序列 如 SEQ ID N0.2 所示。依据本实施方案的优势，(ii)5’端非编码区是名为LLTCK的前导序列，在专利 申请PCT/EP2007/064590中已有说明和报道，其序列如SEQ ID N0.3所示。依据进一步的实施方案，(iii)核苷酸序列元件是序列PSGluB4，其序列如SEQ IDN0.4所示，编码水稻使用的信号肽将谷蛋白4前体锚定在内质网腔中。依据另一个实施方案，(iv)核苷酸序列元件是GCase序列，编码成熟形式的人 酸性β-葡萄糖苷酶，其序列如SEQ ID Ν0.5所示。依据本发明实施方案的优势，(ν)3’端非编码区元件为NOS终止子，其序列如 SEQ ID N0.6所示。或者GluB4基因的终止子亦可用。代表性地，表达盒的全部核苷酸序列与序列SEQ ID N0.1所示的是相同的。本发明内的核苷酸序列与上面所述序列是互补的。 本发明的序列来源于诱变过程，如通过删除、插入、转换和颠换上面所述序列 或其互补序列中的一个或多个的核苷酸。本发明是编码成熟形式人酸性葡萄糖苷酶的上面所述序列，与启动子元件或序列结合，用来锚定蛋白质在内质网腔中或5’端及3’端非编码区，与在序列SEQ ID N0.1所报道的序列是不同的，可以获得种子中胚乳特异性酶的合成与积累，或者形成 上面所述序列的互补核苷酸序列。本发明是上面所述元素(i)，(ii)，(iii)，(iv)及(ν)和与SEQ ID N0.1所报道
的序列不同的成熟酶编码序列的结合，是因为存在内在的人序列突变或多态性，或者是 与其互补序列的结合。而且，本发 明是元素(i)，(ii), (iii) , (iv)及(V)和上面所述编码成熟形式或 前体溶酶体酶的结合，或与其互补序列的结合。此外，本发明具有上面所述的结合，其中酶为人酸性α-葡萄糖苷酶。本发明的序列也如上所述，其中转化植物为谷物类。本发明中的分子载体，适用于人类蛋白质在植物中的表达，尤其是人溶酶体酶 在植物胚乳中的表达，具有上面所述核苷酸序列。通常情况下，分子表达载体是一个质 粒。依据优势解决方案，溶酶体酶是人类酸性β-葡萄糖苷酶。也许，溶酶体酶也是一种人类酸性α-葡萄糖苷酶。本发明也表明了上面所述的表达载体的应用，可用于植物转化产生一种蛋白， 尤其是人溶酶体酶。本发明的菌株包含上面所述的表达载体。有利的是，这个菌株可从大肠杆菌、 根癌土壤杆菌和毛根农杆菌组中选择。本发明是通过上面所述表达载体进行植物细胞转化。依据本发明的解决方案，这些细胞是谷物细胞，最好是栽培稻(水稻)。有一个 首选的水稻品种但是不适用于食物。因此，本发明用的是糯米，这种糯米在工业上主要 是用来提取和生产淀粉及其副产品。也许，这些细胞可能属于栽培的禾本科(禾本科) 的一员，例如玉米(玉米属)，大麦(大麦属)和小麦(小麦属)。本发明通过植物种子转化表达人类蛋白质，尤其是人的溶酶体酶，表达载体如 上所述。据本发明的解决方案，这种转化植物的种子属于谷物，更合适的转化植物是水 稻。有关本发明的保护领域包括用来表达人类蛋白尤其是人的溶酶体酶的转化植 物，所用表达载体如上所述。方便的是，这种植物是谷物，更合适的是水稻。本发明中的后代作物是通过自体受精或杂交获得的，或是从上面所述转化植物 中筛选得到的转化株系。本发明也涉及上面提到的一种可用于治疗的种子。并且，本发明也涉及先前提 到的一种用于生产ERT药物产品的种子，尤其是涉及到酶的替换疗法，可用于戈谢病、 糖原贮积症II型、法布瑞氏症、尼曼克氏B症以及黏多醣贮积症I型、II型和IV型。本 发明也涉及到上面所述用于酶的替换疗法的种子。尤其是，本发明还涉及上面所述用于 酶的替换疗法的种子，主要用于以下疾病的治疗戈谢病、糖原贮积症II型、法布瑞氏 症、尼曼克氏B症以及黏多醣贮积症I型、II型和IV型。
本发 明的这些和其他特点，从下面的优选实施方案说明中可以明显看到，结合 其中所附的图片，可作为一个非限制性的实例-图1是最终形式的表达载体 pSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/ NOSter]的设计方案，此载体用于生产具有胚乳特异性的人酸性β-葡萄糖苷酶。-图2Α显示了一个合成方法的实验计划，可通过回归-PCR检测LLTCK前导序
列下游GluB4启动子。-图2B显示了电泳分析双重-PCR产物的结果。这种产物是从基因组DNA中提 取的，其中基因组DNA来自转化植物，弓丨物退火后合成的GCase和HPT II基因。泳道 1: 1Kb梯度(NEB)；泳道2:阴性对照(NC)，即从非转化植物中提取的基因组DNA ； 泳道 3 阳性对照组(PC)，即 pSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/N()Ster]载 体；泳道4-16 待试验的植物-图3A和3B显示了SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳(A)和蛋白质印迹法(B)分析 蛋白提取物的结果，这些蛋白提取物是通过提取GCase转化植株的种子中获得的。在A 和B中，泳道1-5加了系列连续提取的漂白过的水稻样品，泳道6和7加了两个连续提取 的漂白过的废弃物。阳性对照组(PC):在蛋白质印迹中，它相当于IOOng纯化的伊米苷 酶。很显然，包含在漂白过的水稻样品中大部分的重组人酸性β-葡萄糖苷酶可以通过 三次连续提取而回收。-图4Α显示了蛋白质印迹的分析结果，这些蛋白来自GCase转化植株的种子。 泳道1:标记精密加蛋白标准(BioRad)；泳道2:阳性对照(PC，IOOng伊米苷酶)；泳 道3:阴性对照(NC，从非转化水稻中提取的蛋白，同系交配CRW3)；泳道4-10:不同 的主要转化株中的种子蛋白提取物。-图4Β显示了人酸性β-葡萄糖苷酶的三种糖形式。是将GCase转化株的种子 蛋白提取物进行双向凝胶电泳，分离后又用蛋白质印迹法检测出来的。-图5Α和5Β反映了免疫组化图像，是通过透射电子显微镜(放大12500Χ)观 察非转化水稻(A)和1个GCase转化株(B)的部分种子获得的。很显然，重组人酸性 β -葡萄糖苷酶的积累只仅与蛋白质贮藏液泡PSVs)有关。-图6Α和6Β显示了一个HIC(A)和IEC (B)样品的色谱图，可以看出其中洗脱
峰含有重组人酸性β-葡萄糖苷酶。-图7，在图表中显示荧光记录于4-MUG检测的非转化植株和GCase转化植株 的不同色谱等分。与之关联的蛋白质印迹分析结果显示，EX:原提取液，R:流经， Ε洗脱组分，PC:阳性对照(伊米苷酶)。很显然，真正的GCase酶活性(E2-E3)能 利用阳离子交换色谱从内源性GCase类似物(E6)中分离。-图8A及8B显示了重组人酸性β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电 泳(A)的结果，是在最终的凝胶过滤和相应的蛋白质印迹信号(B)纯化步骤后进行的。-图9表明了通过MALDI-T0F分析经疏水作用层析和阳离子交换色谱纯化的 GCase样品的质谱效果图。-图10显示了GAA基因在载体PUC18中从人工合成的初始片段组装的示意图。-图11 显示了获得最终表达载体 pSV2006[GluB4pro/LLTCK/GAA/N()Ster]方法的示意图。-图12显示了总蛋白提取物蛋白质印迹的分析结果，总蛋白来自不同的GAA转 化株，泳道1: M,标记精密加蛋白标准(BioRad)；泳道2:阴性对照(非转化株中的种 子蛋白提取物)；泳道3:阳性对照(IOOngMyozyme)；泳道4_10 :不同的重要转化株 中种子蛋白提取物。-图13显示了成熟种子胚乳的免疫金标签结果，用抗-GAA的抗体进行的。很 明显，GAA在检测蛋白质贮藏液泡上是很专一的，但对于蛋白质体的检测不专一。在阴 性对照中没有检测到信号(由非转化株产生的种子 ，资料没有显示)，放大16000X。发明的详细说明本发明涉及到一种在栽培水稻种子胚乳中生产人酸性β “葡萄糖苷酶的方法； 方法包括-第一步是进行植物转化，藉此获得蛋白并固定在胚乳中，最终不会被胚胎吸 收。同时，胚乳中大量蛋白的存在并不会影响种子的活力和萌芽率。-在第一步植物转化中，用到一个胚乳特异性上游启动子基因编码的所述蛋白，以及 一个信号肽共翻译转运新合成的蛋白质至胚乳细胞的内质网腔中，用以组织特异性的积累。-第二步是植物种子的胚乳中的蛋白质积累。在植物转化的方法中，表达载体的使用需要考虑以下一些因素i)天然或人为来源的胚乳特异性启动子。ii)天然或人为来源的5’端非编码区。iii)天然或人为来源的核苷酸序列编码的信号肽，能够将重组蛋白锚定在胚乳细 胞内质网腔中，并决定了所述蛋白在特异组织中的积累。iv)天然或人为来源的核苷酸序列编码的成熟形式的人类蛋白质。ν)天然或人为来源的3’端非编码区。包含在表达载体中的核苷酸序列在是序列标识符号中表明的，如SEQIDN0.1。在这些已知的禾本科植物尤其是水稻中的胚乳特异性启动子，本发明优先开发 了 GluB4基因启动子(序列SEQ ID N0.2所示)，因为GluB4编码的蛋白在种子胚乳中 具有较均衡的分布。此外，与其它基因编码的水稻胚乳贮藏蛋白的启动子相比，如球蛋 白、醇溶蛋白、谷蛋白等，GluB4基因启动子还有更高的翻译能力。GluB4基因启动子与前导区是从糯稻同系交配CR W3(由Ente Nationale Risi筛 选，米兰)中通过PCR方法分离出来的。因为天然的前导序列相当短，其中CAA和CT 元件的重复少，故而对基因的表达有积极的影响。它最终被5’端非编码区的LLTCK 序列所取代(DeAmicis etal.2007，转基因研究，16: 731-738)，并在国际专利申请PCT/ EP2007/064590中报道，其序列如SEQ ID N0.3所示。GluB4基因启动子/LLTCK的序列被PSGluB4/GCase连接，其中-PSGluB4是编码水稻谷蛋白4的信号肽的前体序列(如SEQ ID N0.4所示)， 并进入内质网腔中。-GCase是编码成熟形式人酸性β -葡萄糖苷酶的序列(如SEQ ID Ν0.5所示)； 前体蛋白除去信号肽后，即为成熟形式人酸性葡萄糖苷酶。为了避免异源氨基酸的添加在成熟蛋白质的N末端，异源氨基酸的添加可能会造成用于克隆或序列连接的限制性内切酶位点的引入，与PSGluB4序列相对应的DNA区 域以及成熟GCase编码序列(到自然发生HindIII限制性内切酶位点)的初始部分的人工合成。尽管意义相同，但是这样人工合成的PSGluB4序列与天然水稻序列不匹配，由 于这种变化是故意介导的，用以识别与LLTCK序列相结合的翻译起始密码子，避免了 稀有密码子或不利的内含子的发生。相反地，GCase起始部分在人类天然序列中保持不 变，因此，整个GCase序列可完全与基因库*N°M16328相对应，存在于核酸位置553 和2046之间的间隔。在将合成序列连接完后，编码剩余部分的酶通过Hind III限制位 点，整个复合体被连接到GIuB4pro/LLTCK的3’末端，GIuB4pro/LLTCK之前已被克 隆在pSV2006双重载体上。pSV2006是被申请人从pCAMBIA 1300质粒中开发的(www. cambia.org)；多腺苷酸化信号是用于人酸性β _葡萄糖苷酶的构建的NOS终止子，即根 癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子。这个NOS终止子序列如SEQ ID Ν0.6所示。在检查完所有的用于构建最终载体pSV2006[GluB4pro/LUCK/PSGluB4/GCase/ NOSter]的序列后(图1)，这个载体通过电穿孔的方法被插入根癌农根菌的EHA 105菌株 上。然后，工程菌株用于转化水稻胚性愈伤组织(Oryzasativa ssp。Japonica，inbred CR W3),整个植物转化和再生的过程均在选择性培养基定期完成。生长在人工气候室的相 同条件下，如光、温度和湿度等，转化植株和对照植物的生长状况无明显差异。在转化 植株中雌性和雄性器官的生育率、落花比率与非转化植株CR W3自交系相似。所有的初 级转化植株得到的种子，平均存活率高于95%，与人酸性葡萄糖苷酶的表达水平无 关。此外，萌芽率与该物种的最大值相当(在4-6天内，几乎所有的活种子都长出了初 生根和胚芽鞘)。同样地，对于初级转化，他们的后代生长也正常，也产生种子并且种子中含有 重组人酸性β -葡萄糖苷酶。在所有的转化植株(图2Β)中，这种酶的编码基因的存在 通过PCR分析得到证实，且在最好的初级转化植株中有超过150个随机样本的后代是通 过自交获得的。在这些分析中，所用的阴性和阳性对照，分别对应各自的非转化株CR W3的总DNA和小量制备的表达载体。 此外，利用一对特异性引物可设计一个水稻叶绿体DNA区域，可将每个测试的 DNA提取物的扩增能力得到证实。整体而言，PCR分析表明，水稻基因组能被编码人 类酸β-葡萄糖苷酶的序列转化，转基因被传递给后代。遗传传递表明不仅存在于自交 后代，而且在阴性对照的杂交植株或其他的转化株中也存在。为了证实人类酸性葡 萄糖苷酶的信使RNA的产量，收获未发育完全的水稻种子(花后10-15天的)，用于总 RNA的提取。接着，进行下面的分析a.通过PCR扩增，不存在基因组DNA的污染。 b.通过RT-PCR扩增人类酸β-葡萄糖苷酶信使RNA。C.通过RT-PCR扩增谷蛋白4信 使RNA。在所有的情况下，GCase基因显示有规律的表达，并显示了与基因编码的谷蛋 白4存储蛋白有同样的表达形式。正如所期望的，当总RNA在阴性对照中被使用的时 候，仅获得谷蛋白4基因的扩增。未成熟种子通过透射电子显微镜还可用来进行重组蛋白的免疫定位。这项工作 表明，人酸性葡萄糖苷酶专门积累在贮藏蛋白胚乳细胞的液泡中。当同样的分析在 CR W3对照种子中进行重复测定时，没有得到信号，这表明我们使用的抗GCase的绝对特异性抗体及其分析极为有效。一个专一性抗体的有效性，以及通过可靠且敏感的荧光 检测去测定β-葡萄糖苷酶的活性的可能性均被用来开发、筛选最佳的转基因株系，并 制定重组蛋白的纯化过程。关于提取和纯化过程，制定了用来生产初级种子的程序，粗蛋白提取和重组酸 性β-葡萄糖苷酶的分离纯化。纯化程序由三个系列步骤组成的疏水作用层析(HIC)、 阳离子交换色谱(IEC)和凝胶过滤(GF)。种子脱皮和漂白对于去除大部分的蛋白质污 染物绝对是非常有效的，并伴随最少的GCase损失；在提取步骤中损失非常的低。内源 GCase类似酶，具有GCase类似活性，可通过在阳离子交换色谱的尾部进行连续洗脱过 程获得。这种色谱可以通过继续凝胶过滤进一步减少蛋白质污染物，起到样品抛光的作 用。在SDS-PAGE聚丙烯 酰胺凝胶电泳中，纯化的蛋白具有与伊米苷酶(Cerezyme，
Genzyme公司)基本相同的流动性且表观分子量约60kDa。在免疫印迹中，纯化的蛋白 能被强烈地检测到通过抗-伊米苷酶抗体，这种抗体由兔得到的。发现纯化的蛋白酶很 活跃，特别是能有效地水解的荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，表现出了与伊米 苷酶同样的反应动力学。在二维电泳中，在标准的SDS-PAGE电泳后，用免疫印迹分析 进行单条带重复检测，发现至少三个蛋白糖的形式。进一步分析显示了在水稻胚乳中生 产的重组人酸性葡萄糖苷酶的完整性，及其氨基酸序列在相应的人类天然序列中的 位置。N末端的微量测序表明相对应的ARPCIPKSF最初的九肽也是人源性酸性β-葡 萄糖苷酶的N末端。以MALDI-TOF进行的肽质量指纹图谱表明，蛋白质的C末端是完 全保守的，与在原始酶中所见是相似的，在第五N-糖基化位点中没有发现聚糖链。不同 的是，第一、第二、第三和第四的N-糖基化蛋白质的位点似乎已被占据。第一个位点中 N-聚糖链的存在对于蛋白酶的活性是必须的。
具体实施例方式实例1 GCase表达分子盒的构建以下部分讲述了在水稻中表达胚乳特异性人酸性β-葡萄糖苷酶的方法。相似 的方法可被用在变异体的构建中，但应以存在能将蛋白锚定在内质网腔中的其它的胚乳 特异性启动子和(或)序列为特点。分离谷蛋白4启动子(GluB4pr0)为了分离水稻(GenBank acc.N°AY42571)谷蛋白4启动子，将CR W3自交系的 基因组DNA进行PCR。在这种PCR中，用到以下的一些引物正向引物GluB4pro 序列如SEQ ID N0.7所示。反向引物GluB4pro 序列如SEQ ID N0.8所示。为了便于后续的克隆工作，GluB4pro for引物设计为在5’端的扩增子处插入 SphI和Eco RI限制性位点；同样地，GluB4pro rev引物设计为在PCR产物3’端导入一 个Xba I位点。循环95°C 2 分钟，40 次循环(95 °C 45 秒；63 °C，40 秒；72 °C 2 分钟)；72°C 5 分钟。扩增的产物被克隆到pGEM-T (Promega)中，并完全测序。
& Γ—Β4辟好LLTCK λ工■辦贿代漏■辦歹丨丨为了用合成的前导序列LLTCK(De Amicis et al.2007,转基因研究)替代水稻谷
蛋白4启动子的原始前导序列(GluB4pr0)，按照图2A中的程序计划，以合适的引物进行 3次连续PCR(—个正向引物，三个反向引物)。在第一次PCR时，质粒pGEM-T[GluB4pro]被用来作为模板；在接下来的两次
PCR中，前一次反应的产物作为下一次的模板。正向引物1始于一个BfrI限制性位点， 在接近于GluB4启动子序列的3’端时退火。反向引物1的3’端到达GluB4启动子区 的上游前导序列区时，迅速退火。未退火的部分有助于合成初始LLTCK序列。反向引 物2接近后面的片段时退火，并合成LLTCK序列的第二部分。最后，反向引物3引入 LLTCK序列的终止部分以及3’端的XbaI位点。PCR反应是在Acc Tag (Sigma) DNA聚 合酶的的作用下，以下面的循环温度进行的98°C 2分钟；15次循环(I和II PCR)或者 25 次循环(IIIPCR) X (940C 30 秒；65°C 30 秒；68°C 1 分钟)；68°C 10 分钟。最终的 PCR产物被克隆到pGEM-T中，并通过酶切法和测序得到证实。为了用人工LLTCK前 导序列替代GluB4pro的原始前导序列，用到了 BfrI和XbaI限制性位点。载体和插入位 点被T4DNA连接酶连接到一起，由此产生的载体pGEM-T[GluB4pro/LLTCK]进一步通 过PCR分析和酶切反应得到证实。以SPGluB4替代原始的信号肽为了增加GCase基因在水稻中的表达，根据水稻偏爱的密码子，进行了编码谷 蛋白4信号肽(SPGluB4)的核苷酸序列优化，并将其放于编码成熟形式的人酸性β _葡萄 糖苷酶的序列(GCase)之前。如果异源氨基酸添加到成熟形式酶的N末端，这样会使杂 散的限制性内切酶位点就不能连接到一起。为了解决这个问题，合成了一个人工片段， 包含5’端的XbaI位点、SPGluB4序列和GCase初始区至自然发生的HindIII位点，被克 隆到pUC57中(Fermentas)。在序列检查完后，被克隆到pGEM_T[GCase]中编码原始信 号肽的片段处，也就是包含全部编码人酸性β-葡萄糖苷酶序列的质粒中，如在GenBank Ν°Μ16328 中报道的一样。pUC57[SPGluB4]和 pGEM_T[GCase]分别在 Xba I 及 Hind III 位点被酶切，分别用以形成插入位点以及载体框架。这些部分均通过T4DNA连接酶连接 在一起，形成pGEM-T[SPGluB4/GCase]，并通过酶切得到验证。水稻中人酸性葡萄糖苷酶表达的分子盒的组装与GluB4pro/LLTCK和SPGluB4/GCase对应的区域，均通过两步法被亚克隆到 pUC18[NOSter]中；所克隆的这个质粒来源于pUC18 (Pharmacia)，其中包含了根癌土壤 杆菌的NOS多聚腺苷序列。为此，在每一个区域的5’端和3’端均被引入了限制性位 点，也就是 GluB4pro/LLTCK 的 Sph I 和 Xba I，SPGluB4/GCas 的 Xba I 和 Sac I 位点。pSV2006[GluB4pro/LLTCK/SPGluB4/GCas/NQSterl 载体的生产为了获得最终的表达载体，用到了 pSV2006 ( 一个pCAMBIA 1300的衍生物)。 通过Eco RI酶切，pSV2006的最初表达盒以及包含在pUC18「GluB4pro/LLTCK/SPGluB4/ GCas/NOSter]中的分子构建均被移除了。pSV2006的框架及有用的插入位点彼此连接起 来，以获得最终的表达载体(图1)，通过电穿孔转入根癌土壤杆菌菌株EHA 105之前， 需进行特殊分析。基因工程菌根癌土壤杆菌被用来转化栽培水稻自交系CR W3。实例2 =通过根癌土壤杆菌进行水稻转化
根据Hiei，计划程序进行水稻转化(Hiei et al.，1994)，此程序被C.Huge (莱顿大学，植物科学研究所，水稻研究组)和E.GuiderdonK法国，蒙彼利埃，法国国际开发 农业研究中心，热带生物计划)。该程序的主要阶段简要报告如下
件愈伤组织的培养
水稻的转化用的是盾片源胚性愈伤组织。为了从盾片组织诱导愈伤组织增殖， 需要对将水稻种子脱皮、消毒，以消除潜在的病原体和腐生物污染物，用无菌蒸馏水冲 洗几次，在无菌吸水纸上干燥，并转移至含有愈伤组织诱导培养基(CIM)的培养皿中。 在观！、无光照条件中培养7天；此后，将小盾片从种苗中切除，并在愈伤组织诱导培 养基中、^°C、无光照条件中培养培养14天。在诱导的最后阶段，根据微小的白色的愈 伤组织去筛选的愈伤组织团。最后一步是将其转移至新鲜的愈伤组织诱导培养基中，并 培养10天，以获得适合转化的胚性愈伤组织。
根癌土壤杆菌共培养愈伤组织
为了获得转化用的足够数量的根癌土壤杆菌，将具有表达载体的菌株置于30°C 下在LB琼脂培养基中培养3天。收集农杆菌细胞层并重悬浮在液体共培养基(CCML) 中直到O.D.·值达到为1.00时(此时相当于大约每ml培养基中有3.5X IO9个细胞)。 最好的愈伤组织，也就是那些紧凑的、白色的、且直径在2毫米左右的，被浸入菌悬液 中。在经过无菌滤纸印迹后，愈伤组织即被转移至共培养基中(CCMS)，每个高边培养 皿中愈伤组织密度为20 (Sarstedt)，并于25°C中无光照条件下培养3天。
抗潮霉素愈伤组织的筛选
在共培养阶段末期，愈伤组织转移到选择性培养基I中6MI)，并在中无光 照条件下培养2周。愈伤组织最终被转移到选择性培养基II中6MII)，并在相同条件下再培养一周。
转化的愈伤组织中植株的再生
通过适当的激素刺激实现了转化植株的再生。筛选得到抗潮霉素胚性愈伤组 织，转移至预再生培养基中(PRM)并在条件下高边培养皿中培养1周。然后再将愈 伤组织转移至再生培养基中(RM)，其中培养皿中愈伤组织数量为8-10个。在光照条件 下，培养3-4周即可实现植株再生。当植株长到足以从愈伤组织中分离的时候(也就 是高度在3厘米以上时)，它们将被转移至含有25毫升生根培养基(ROT)的培养管中。 将培养管放置在观°0、光照条件下培养3周。在再生过程的最后，将植株栽在含有腐殖 土的盆中，在一个密闭的植物生态实验装置中，生长条件为M°C，相对湿度为85%， 并在金属卤化物灯OsramP()wei>star HQI -BT 400W/D (光周期为16小时光照/8小时 黑暗)下生长至成熟。
实例3 用GCase转化的水稻种子中总蛋白提取
首先将转基因水稻的种子用Satake TO-92进行脱壳和漂白(Satake公司，日 本)。然后将漂白过的水稻种子进行碾磨，所形成的面粉在提取缓冲夜(50mM的醋酸 钠，350mM氯化钠，pH为5.5)中成为勻浆，使得缓冲液体积(毫升)与面粉重量(克) 之比为10 1.5。然后在4°C下培养1小时，将样品在14000 条件下离心45分钟。回 收上清液后，余下的颗粒用于以相同的程序进行进一步的提取。将漂白过种子中的蛋白 提取物以及漂白废弃物，均进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3A和3B)分析与蛋白免疫印迹。这些分析结果均证实了大部分的重组人酸性β-葡萄糖苷酶均含在漂白过的种 子中，并能以三步连续提取方法得以回收。
辅丨丨4 & GCase餅射·S馳_胃0舰迹擺㈤二赫就
总蛋白提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Laemli，1970年)得到分离，利 用Mini Protean II型电泳槽装置(BioRad)，并且用0.75毫米厚的10 %聚丙烯酰胺胶。上 样前，样品要在100°C下变性5分钟，不用β-巯基乙醇。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳后，蛋白质通过转印迹SD装置(BioRad))，在15伏、30分钟被转移至聚偏氟乙烯膜 (PVDF)上。然后样品与多克隆抗-GCase抗体杂交，这种抗体是通过两只具有商业伊米 苷酶的免疫兔产生的。杂交时应用了如下的条件室温下培养1个小时，所用的稀释溶 液为1/1000的(此培养液为PBS中含有7.5% ρ/ν的蛋白胨脱脂乳培养基)，通过PBS吐 温0.1%v/v清洗，将这个抗兔HRP偶联二抗6igma，稀释1 10000)在室温下培养1 小时，然后通过ECL Plus (GE Healthcare)化学发光。为了确定阳性蛋白带的分子量， 共同使用了精密加蛋白标准(BioRad)与HRP偶联精密Strepactin抗体(BioRad)(图4A 中)。
通过等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析两个包含大约200 μ g种子总蛋 白的样品。最初的分析通过PROTEAN IEF聚焦系统(BioRad)和7厘米的ReadyStrip IPG 完成，在非线性的PH值3-10的范围内(BioRad)。用2D Clean-Up试剂盒(GE Healthcare) 将蛋白提取物沉淀，再用130微升DeStreak再水化溶液和0.6%的Byolites ampholytes 3-10 进行悬浮。应用了如下电泳条件
步骤1 250V，15 分钟。
步骤2: 4000V，2 小时。
步骤3 20000V-小时，大约24小时。
在电泳最后，条带用两种不同的平衡缓冲液清洗缓冲液K2%DTT，2% SDS, 50mM Tris-HCl, 6M 尿素，30%甘油，0.002%溴酚蓝，PH 为 8.8)进行 15 分钟， 缓冲液20.5%碘乙酰胺，2%SDS，50mMTris-HCl, 6M尿素，30%甘油，0.002%溴酚 蓝，PH = 8.8)进行20分钟。根据标准的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳程序，样品在两个 单独的凝胶中展开，其中一个凝胶被胶质考马斯亮蓝(0.08%考马斯蓝R-250，1.6%奥托 磷酸，8%硫酸铵，20%甲醇)污染，但是其他的用蛋白质印迹分析(在图4B中)，整个 过程也在非转化的CR W3种子蛋白样品中同时进行。
实例5 通过免疫定位确定GCase贮藏位点。
将乳熟后期阶段转化的种子采收，去皮，切成1毫米的碎片并在室温下固定在 0.2%的戊二醛中1小时。用0.15M磷酸缓冲液冲洗，用梯度无水乙醇(从25%到100% ) 进行脱水处理。脱水的样品包埋在LR白树脂(伦敦树脂有限公司)并在60V聚合M小 时。2-3微米厚的片段用LKB Nova显微镜切片机破碎，放置于镍网网格中(电子显微镜 科学)，培养15分钟，用普通山羊血清培养液(Aurion)，在缓冲液C中稀释1 30，缓 冲液C(0.05MTris-HCI，pH为7.6，0.2%的牛血清蛋白)，最终，在室温下用在缓冲液C 中稀释1 500的一抗-GCase抗体杂交1个小时。用缓冲液B(0.05M Tris-HCI, pH为 7.6，0.9%的氯化钠)与0.1%的吐温20w/v(6X5分钟)冲洗多次后，切片与偶联胶体金 (15nm，Aurion)的二抗以在缓冲液 E(0.02MTris_HCI，pH 为 8.2，0.9% 的氯化钠和的牛血清蛋白)稀释1 40，在室温下培养1个小时。杂交最后，将切片冲洗并用醋酸 铀和柠檬酸铅(雷诺，196 染色。最后用Phlips CM 10透射电子显微镜(TEM)观察。
得到的结果表明，GCase只存在于种子胚乳的蛋白质贮藏液泡中；多克隆抗 GCase抗体可以用一个强烈明确的信号识别GCase，在没有显着的背景下。在非转化水 稻谷物中进行了同样的分析，通过缺少矩阵相关交叉反应位点的继迹象(图5A和5B)证 实了抗GCase抗体的高度特异性。
_ 6 狀·种舰翻 λ_ β - giUf·酶
为了进行纯化，制订了一个工业规模的计划程序，此程序是第一步捕获，根 据疏水作用层析(HIC图6A)；中间步骤是基于离子交换色谱(IEC)进行的(图6B)；最 后一步抛光是通过凝胶过滤层析。所有层析步骤均在AKTAPrime系统下进行的。
疏水作用层析(HIC)
这一步是用5毫升的HiTrap Octyl FF层析柱完成的。在程序的开始，用1倍体 积的上样缓冲液(50mM的醋酸钠，350mM氯化钠和IOOmM硫酸铵，pH值=5.5)进行 柱子的平衡。上样前，将3M的硫酸铵溶液加入到澄清的提取液中，以获得最终浓度为 IOOmM的硫酸铵，然后将这个提取液过0.2毫米的微孔滤膜。样品加到柱中，以流速为 lml/η ι。用三倍体积的上样缓冲液、50mM的醋酸钠冲洗柱子，使pH值=5.5时，跑 平基线。程序结束后，用20%的乙醇冲洗和再生柱子。
离子交换饩谱(IEC)
对于离子交换色谱(IEC)来讲，用的是5毫升的HiTrap SP FF柱子，其中使用了 阳离子树脂。用50mM的醋酸钠平衡柱子；然后，将疏水层析洗脱成分用相同的缓冲液 稀释1 1，然后上样。冲洗完柱子后，用IM溶液中氯化钠量从15、20到100%不断 增加的溶液A，进行不连续的梯度洗脱。结束时，用20%的乙醇再生柱子。用从每个色 谱操作中收集到的等分进行免疫定位分析，证实了重组人酸性葡萄糖苷酶用20%的 氯化钠溶液可以洗脱出来。通过分级洗脱，用非转化株种子的蛋白提取物进行酶活性测 试，表明重组人酸性葡萄糖苷酶从具有GCase类似物活性的内源成分中的分离发生在 层析步骤中。尤其是，已经证明，内源成分在20%的氯化钠溶液中，能有效地保留在柱 子中。
凝胶过滤层析
对于凝胶过滤层析，用的为HiTrep 16/60Sephacryl S-100高分辨率柱和成分为 20mM的醋酸钠、200mM的氯化钠、pH值=5.5的洗脱缓冲液。最初用2倍体积的缓冲 液冲洗柱子，然后将离子交换层析的洗脱产物上样，流速为0.3m1/min。通过SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法分析有用峰(图8Α和8Β)。
实例7: GCase酶活性的测定
用4-MUGG-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷，Sigma)作为底物，分析测定重组人 GCase的活性。反应混合物的成分为75mM的磷酸钾缓冲液，pH为5.9，0.125% w/v 的牛磺胆酸盐，3mM的4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷。反应在如下条件下进行37°C反 应1个小时，在300微升的分析溶液中加入10微升的样品。通过加入1690微升的0.1M 的甘氨酸-氢氧化钠溶液来终止反应，此时pH为10.0。酶活性的测定使用荧光计，激发 波长为365 ±7nm，发射波长为460 ± 15nm。一个酶活单位定义为每分钟分解1微摩底物所用的酶量。测试了不同量的样品，并用已知含量的商业伊米苷酶做对照。荧光分析 证实了水稻胚乳中生产的重组人GCase的活性，并具有与商业伊米苷酶同样的反应动力学。
实例8 重组GCase N末端序列测定
GCaseN-末端序列的正确性由蛋白质的微量测序来确定。为此，将疏水层析和 阳离子交换层析所纯化的酶等分，上样在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳结束时，使用半 干转印槽仪器(转印条件在IOmM的CAPS缓冲液与10%的甲醇中，pH值11.0，25V， 30分钟)将其转移到聚偏氟乙烯膜中，转移后，用0.25% w/v的考马斯亮蓝R-250溶液 在50%甲醇中，5分钟将膜染色，用水冲洗并且用50%甲醇溶液脱色10分钟，让有用的 蛋白条带显现。通过Edman降解程序进行微测序(Edman，1950)。分析结果表明，九 肽(ARPCIPKSF)的存在正好重叠在成熟的形式人酸性β -葡萄糖苷酶N-末端序列。因 此，我们可以得出结论，水稻谷蛋白4信号肽能够通过内质网膜系统被充分识别，并在 内化过程中能正确地移除。
实例9 纯化的GCase的质谱分析
胰蛋白酶的蛋白酶切
经过凝胶电泳和0.25% (w/v)考马斯亮蓝的R-250水溶液、50%的甲醇、10% 的冰醋酸染色后，与重组GCase相对应的蛋白质条带被切断，并用300微升IOOmM的碳 酸氢铵(NH4HCO3)、100%的乙腈溶液(ACN) (50 50v/v)在37°C冲洗，进一步用100 微升的乙腈溶液变形和脱水。
随后，将50微升20mM的DTT加入IOOmM的碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液中对 蛋白条带进行处理，56°C持续1个小时，得到一个还原的二硫键，并用50微升50mM的 生长素(碘乙酰胺)溶于IOOmM的碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液中30分钟进行烷基化。
此外，将蛋白条带用300微升20mM的碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液和100%的乙 腈溶液(50 50v/v)冲洗，并再次用加如100微升的乙腈溶液脱水。最后，将蛋白条带 进行复水用5-10微升的酶切缓冲液、IOOmM的碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液和50ng/μ 1 的胰蛋白酶。30分钟后，添加20微升的20mM的碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液。将样品 在37°C中过夜培养，移除含有胰蛋白酶肽的缓冲液，通过在样品中添加10微升2%的甲 酸和60%的乙腈溶液(50 50v/v)进一步提取肽。两种提取物储存一起并用质谱分析仪 进行分析。
通过C18树脂纯化肽
酶解产物的纯化与脱盐通过用一个C18zip-top装置来完成。吸管尖用 10μ1100%的乙腈溶液洗四次，用ιομ 0.1%的三氟乙酸洗三次。然后将样品加在活化 的吸管尖中；在用0.1%的三氟乙酸洗后，肽被束缚在C18zip-top的反相树脂中，并用 10 μ 1 100%的乙腈溶液和10 μ 10.1%的三氟乙酸以体积比为70 30的比例洗脱。
ii丄寸肽质^■指纹Si普在JIH普Φ鉴定潘白质
质谱分析的样品准备添加1 μ 1的CHCA树脂浓缩溶液，放于一个金属支持物 中，并放入 μ 的纯肽。分析表明(图9)，用实例6中所述方法进行纯化的蛋白质与人 酸性β -葡萄糖苷酶完全一致。尤其是，通过获得的10_32的显著性水平和与已知肽覆盖 率达53%进行识别。这些结果可以得到绝对的保证，因为其显着性水平且百分覆盖率》0%。有趣的是，在质谱分析中识别出的肽中发现了这个蛋白质的N端和C-末端 (完整的表单见表1)。
表1 通过质谱分析胰肽的主要分配
MteoricalΔΜassignation840.464-0.0101-7 N-teraiinus883.45140.:104322-329932,472+0,122426-433950.461+0,102347-353976,586+0.073286-293988.655+0.045156-1631002.517+0.084278-2851086,628+0.209464-4731281.585+0.008121-1311459.792-0,023396-408+0.006199-2111630,818+0.995263-2771646.794+0.018107-1201664.806+0.038347-359 7 4.937-0.087426-4411870,896+0.120330-3462099,099+0.170304-321.2304.190+0,074442-463 43 2+0.205164-1862846.256+1.025132-1553087.435+1.005132-1573139.530199-2243217,641P1 521 \258"28534.24,784+1.007506-535 Otermirms
实例10 GAA表达载体的生产
本实例讲述了一个在水稻中胚乳特异性表达人酸性α-葡萄糖苷酶的方法。最 终实现的表达载体为pSV2006[GluB4pro/LLTCK/GAA/N()Ster]，已报道。这个载体是通过用 GAA 基因取代先前提到的 pSV2006[GluB4pro/LLTCK/GCase/NOSter]中的 GCase基因而获得的。
修改人酸性α-葡萄糖苷酶(GenBank Acc.N°NM_000152)的编码序列，是为了 增加水稻胚乳中的转基因表达水平。根据水稻偏好的密码子将新的GAA编码序列改变。 此外，已经决定用PSGluB4替代原始GAA信号肽，也就是用相同的转运肽将目标重组 GCase锚定在内质网腔中。GAA编码序列长为^50bp，它是用3个片段进行人工合成 的(A、B和C)。为了用明晰的方式装配这些片段，通过在边缘进行同义点突变，引入 了限制性酶切位点。分别在第一个片段的5’端和第三个片段的3’端引入了 Xba I和 SacI位点，以缓和整个GAA基因克隆入pSV2006的过程。这三个GAA片段的装配是 在pUC18载体中进行的(图10)。检查完整个序列后6EQ ID N0.9)，这个基因就被从 pUC18载体中Xba I和Sac I位点上酶切掉，克隆并取代载体pSV2006[GluB4pro/LLTCK/ GCase/NOSter]中的 GCase 基因，得到了最终的表达载体 pSV2006[GluB4pro/LLTCK/ GAA/NOSter](图 11)。
实例11 GAA蛋白提取物的蛋白免疫印迹
将五个脱壳的种子，在加有1毫升350mM的氯化钠的50mM的磷酸盐缓冲液 (pH = 6. 中用研钵及研杵进行研磨。得到的勻浆放入冰浴中，上下搅拌培养一个小 时，然后在4°C、15000 转速下，离心45分钟。将得到的上清液(20 μ g的可溶性蛋 白)与精密加蛋白质标准(BioRad) —起加入10%的聚丙烯酰胺凝胶中。通过电渍法用 半干转印槽将凝胶转至0.2微米的聚偏氟乙烯膜上。用加有7.5%脱脂乳的PBS缓冲液将 印渍进行封闭，条件为室温下进行一个小时。洗完后，用冻干的重组阿葡糖苷酶α作 为抗原，可形成初级兔多克隆抗体，将此抗体在封闭缓冲液中稀释1 5000，然后将印 渍在室温下孵育一小时。然后，将偶联HRP的二抗稀释1 10000，然后将膜在室温下 孵育一小时。经过最后的清洗，用增强化学发光法进行显色。(图12).
实例12 重组GAA在水稻胚乳中的免疫定位
这个过程与所述的用GCase构建水稻种子的转化是相似的。简单地说，大约 开花后10-15天，将未成熟的水稻种子脱水，埋植入LR白树脂(伦敦树脂有限公司， Hamshire,英国)嵌段在60°C进行聚合M小时。用超微切片机LKBNova切断超薄片 段，并装载到镍网中(电子显微镜科学)进行免疫定位。用普通山羊抗血清(Aurion)稀 释1 30在缓冲液C中培养15分钟，然后用抗-GAA血清(同样的方法用在免疫印迹 中)稀释1 100在缓冲液C中培养1.5小时，在室温下。洗过后，将片段在羊抗-兔 抗体偶联15nm胶体金(Aurion)溶液稀释1 40，在0.02M Tris-HCL缓冲液，pH为 8.2，含有0.9%的氯化钠和的牛血清蛋白中培养1个小时。将片段用0.1%的柠檬酸 铅(Reynolds，196 染色，用菲利普CMlO透射电子显微镜观察。从非转化水稻中得到 的样品也进行同样的处理。
正如在转基因GCase种子的观察中得知，GAA种子胚乳的免疫标签显示了重组 酶特异地定位在贮藏蛋白液泡中(图13)。在蛋白体中没有检测到信号，在阴性对照CR W3中也没检测到信号。
实例13 酶联免疫法检测GAA蛋白提取物
在进行酶联免疫前，加入2毫升抗-GAA血清抗体，此抗体由实例11中提到的兔生产的，并通过一个1毫升的Hitrap rProteon A FF柱子进行纯化。然后用EZ-Link马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶试剂盒将纯化的:tgGS偶联上辣根过氧化物酶，如下面 程序中报道的添加100 μ 1马来酰亚胺偶联缓冲液到含有2-MEA的6毫克的小瓶中， 后将溶液加到bGs样品中，这个混合物在37°C下培养90分钟。在室温下平衡后，将 IgG/2-MEA溶液加入到脱盐的柱子中，用30毫升的马来酰亚胺偶联缓冲液预平衡。随 后，将马来酰亚胺偶联缓冲液加入柱子中，并收集到了 0.5毫升的小片段。为了定位这 些蛋白质的峰，在280纳米下测定了每个片段的吸收。将含有还原的:tgG的片段汇集一 起，并加入到活化HRP的小瓶中。反应在室温下进行1个小时。最后，用superdex200 10/300GL柱子，缓冲液为马来酰亚胺包被缓冲液(含PBS和EDTA)，进行凝胶过滤层 析。通过Amicon Ultra-ΙΟ进行浓缩至浓度为0.85 μ g/μ 1。HRP偶联抗-GAA抗体的性 能通过酶联免疫检测。为此，将1毫克/毫升的抗原Myozyme涂在板上；封闭后，在不 同的稀释度下会进行偶联，并在37°C下培养30分钟。本检测使用的底物为TMB (四甲基 联苯胺-3，3，，5，5” -tetramethylbenzidine)；通过 HRP 偶联抗-GAA 抗体的 1 1000 稀释，获得了本抗原的最低检出限。
然后将抗体用在夹心酶联免疫吸附分析粗蛋白提取物，如下所述
通过在酶联免疫板的微孔板中加入100 μ 1的15ng/ μ 1的纯化的抗-GAA抗体， 在4°C过夜制备包被层。
在室温下1个小时，用3%的牛血清蛋白在PBS中阻断抗体后，用PBS 0.1%吐 温-20冲洗，添加总蛋白提取物(在PBS中1 10或1 100的稀释，0.1%Tween_20 和牛血清白蛋白)并在37°C培养30分钟。培养结束后，洗三次，然后将HRP偶联 抗-GAA抗体添加到稀释度为1 40的PBS缓冲液，0.1 % Tween-20和牛血清白蛋 白，并在37°C培养30分钟。洗完第四次后，用四甲基联苯胺为底物进行检测。
在酶联免疫检测的基础上进行了已知量的标准物Myozyme检测，从GAA初级转 化株中获得的种子蛋白样品表明，平均GAA含量等于总可溶性蛋白的0.5%。
很明显，修饰和(或)添加部分或步骤能形成在植物中生产人蛋白的方法，尤其 是在谷物胚乳中生产人重组溶酶体酶，如前所述，而无需脱离本发明的范围。
同样清楚的是，虽然本发明是通过参照一些具体的实例来说明的，但在此工艺 中具备技能的人，一定能够掌握许多其它的同等形式的在植物中生产人蛋白的方法，尤 其是在谷物中生产人重组溶酶体酶，此方法所具有的特点在专利权利要求书中已提出， 因此，由此可以确定所有在本范围内的方法均受到保护。
权利要求
1.一种植物中生产人蛋白的方法，尤其是在植物胚乳中生产重组人溶酶体酶，其特 征在于包括-第一步是进行植物转化，由此获得蛋白质，并将其固定在胚乳中，最终这些蛋白不 会被胚胎吸收，且大量蛋白的存在不能影响种子的活力及萌芽率；-在第一步的植物转化中，用到一个胚乳特异性上游启动子基因编码的所述蛋白，以 及一个信号肽共翻译转运新合成的蛋白至胚乳细胞内质网腔，用以组织特异性积累； -第二步是植物种子胚乳中的蛋白积累。
2.如在权利要求1所述的方法，其特征在于，胚乳贮藏蛋白液泡或蛋白质体中的蛋白 积累。
3.如在权利要求1或2所述的方法，其特征在于，构建含具有以下元件的核苷酸序列 转化植株表达载体i)天然或人为来源的胚乳特异性启动子； )天然或人为来源的5’端非编码区；iii)天然或人为来源的核苷酸序列编码的信号肽，能够将重组蛋白锚定在胚乳细胞内 质网腔中，并决定了所述蛋白在特异组织中的积累；iv)天然或人为来源的核苷酸序列编码的成熟形式的人类蛋白质； ν)天然或人为来源的3’端非编码区；以及可用来做植物转化的载体。
4.如在权利要求3所述的方法，其特征在于，表达载体的序列如SEQID Ν0.1所示。
5.如在权利要求3或4所述的方法，其特征在于，将表达载体引入细菌菌株中，直接 或间接地，用于植物转化。
6.如在权利要求5所述的方法，其特征在于，细菌菌株的选择是在属于大肠杆菌、根 癌土壤杆菌和毛根农杆菌组。
7.如在以上任一权利要求所述的方法，其特征在于，转化植株是谷物。
8.如在权利要求5和7或者6和7所述的方法，其特征在于，细菌菌株是用来转化水 稻(粳稻，自交系CR W3)胚性愈伤组织。
9.如在以上任一权利要求所述的方法，其特征在于，溶酶体酶为人酸性葡萄糖苷酶。
10.如在权利要求1-8中的任一所述的方法，其特征在于，溶酶体酶为人酸性α-葡萄糖苷酶。
11.如在以上任一权利要求所述的方法，其特征在于，包含一个三步法工业化生产植 物种子。
12.如在权利要求11所述的方法，其特征在于，将经过转化的谷物植物中收获的种子 进行脱壳和漂白，目的是为了去除纤维成分、胚芽和糊粉层中所含的蛋白质污染物。
13.如在以上任一权利要求所述的方法，其特征在于，通过四步法纯化重组蛋白。
14.如在权利要求13所述的方法，其特征在于，纯化步骤包括疏水作用层析、离子交 换层析和凝胶过滤层析。
15.如在权利要求13或14所述的方法，其特征在于，纯化步骤包含了具有相似化学 成分、和/或者结构、和/或者功能的色谱树脂的应用，洗脱条件的部分修改，阶段的重现。
16.适合植物转化并表达人蛋白的核苷酸序列，尤其是在植物胚乳中表达重组人溶酶 体酶，其特征在于，包括下面一些要素i)天然或人为来源的胚乳特异性启动子； )天然或人为来源的5’端非编码区；iii)天然或人为来源的核苷酸序列编码的信号肽，能够将重组蛋白锚定在胚乳细胞内 质网腔中，并决定了所述蛋白在特异组织中的积累；iv)天然或人为来源的核苷酸序列编码的成熟形式的人类蛋白质；ν)天然或人为来源的3’端非编码区。
17.如在权利要求16所述的序列，其特征在于，i)启动子为水稻谷蛋白4启动子 (GluB4pro)。
18.如在权利要求16或17所述的序列，其中ii)5’端非编码区的前导序列是 LLTCK。
19.如在权利要求16、17或18所述的序列，其特征在于，核苷酸序列iii)的元件为 PSGluB4序列编码的信号肽，是用来在水稻中将谷蛋白4前体锚定在内质网腔中。
20.如在权利要求16-19任一所述的序列，其特征在于，核苷酸序列iv)的元件为 GCase序列编码的成熟形式的人酸性β-葡萄糖苷酶。
21.如在权利要求16-20任一所述的序列，其特征在于，3’端非编码区ν)的元件是 NOS终止子或者GLuB4基因的终止子。
22.如在权利要求16-21任一所述的序列，其特征在于，序列如SEQID N0.1所示。
23.如在权利要求16-22中任一所述的核苷酸序列的互补序列。
24.所用的序列来源于以下突变过程，如删除、插入、替代在权利要求16-22中任一 所示的一个或多个核苷酸，或者如在权利要求23中所示的它们的互补序列。
25.所用的核苷酸序列和作用元件的组合，核苷酸序列如在权利要求16-22中任一所 示，是编码成熟形式的人酸性葡萄糖苷酶；作用元件则是像启动子、能将蛋白锚定 在内质网腔的序列以及5’端和3’端非编码区，这与SEQ ID Ν0.1中所报道的序列是不 同的，其能够获得酶的合成以及特异性贮藏在种子胚乳中，或者是这些序列的核苷酸互 补序列。
26.如在权利要求16中所述的i)，ii)，iii),iv)以及ν)这五种元件的组合，需具有 编码不同于SEQ ID N0.1的成熟酶的序列，这是因为人类中存在同义突变和多态性；或 者是能产生与这些序列互补的核苷酸序列的组合。
27.如在权利要求16中所述的i)，ii),iii), iv)以及ν)这五种核苷酸序列元件的组 合，并具有编码成熟形式或前体的其它溶酶体酶的序列；或者是能产生与这些序列互补 的核苷酸序列的组合。
28.如在权利要求27中所述的组合，其中的酶是人酸性α-葡萄糖苷酶。
29.如在权利要求16-28中任一所述的序列，其特征在于，进行转化的植物是谷物。
30.在植物中表达人蛋白的分子载体，尤其是在植物胚乳中表达重组人溶酶体酶，包 括的核苷酸序列如在权利要求16-29中任一所示。
31.如在权利要求30中所述的载体，其特征在于，溶酶体酶是人酸性葡萄糖苷酶。
32.如在权利要求30中所述的载体，其特征在于，溶酶体酶是人酸性α-葡萄糖苷酶。
33.如在权利要求30、31或32中所述的载体，其特征在于，所用的载体是一个质粒。
34.表达载体的使用如在权利要求30-33中任一所示，是用来进行植物转化，生产蛋 白尤其是人溶酶体酶。
35.所用的细菌菌株具有载体的如在权利要求30-33中任一所示。
36.如在权利要求35中所述的细菌菌株，是从一组包含大肠菌、根癌土壤杆菌和毛根 农杆菌的微生物群中选择出来的。
37.用表达载体进行植物细胞的转化如在权利要求30-33中任一所示。
38.如在权利要求37中所述的细胞，其特征在于，细胞是谷物细胞。
39.如在权利要求38中所述的细胞，是属于栽培水稻(栽培稻)。
40.如在权利要求39中所述的细胞，属于禾本科(禾本科)，像例如玉米(玉米)、 大麦(大麦)和小麦(小麦属)。
41.用于表达人蛋白的转化植物的种子，尤其是表达重组人溶酶体酶，其特征在于， 它包含了一个表达盒，此表达盒来源于在权利要求30-33中任一所示的载体。
42.如在权利要求41中所述的种子，其特征在于，转化植物属于谷物。
43.如在权利要求41或42中所述的种子，其特征在于，转化植物属于栽培水稻种(栽 培水稻)。
44.表达人蛋白，尤其是人溶酶体酶的转化植物，其特征在于，进行转化的表达载体 如在权利要求30-33中所示。
45.如在权利要求44中所述的转化植物，其特征在于，属于谷物。
46.如在权利要求44或45中所述的转化植物，属于栽培水稻种(栽培水稻)。
47.通过自体繁殖、自然或人工杂交获得后代植株，或通过转基因植物中筛选得到转 化株系，均如在权利要求44、45或46中所示。
48.如在权利要求41、42或43中所述的种子，具有治疗用途的。
49.使用如在权利要求41、42或43中所述种子进行生产获得酶替代疗法的药物。
50.如在权利要求49中所述用种子进行生产获得酶替代疗法的药物，用于治疗以下疾 病戈谢病、糖原贮积症II型、法布瑞氏症、尼曼克氏B症，以及黏多醣贮积症I型、II 型和IV型。
51.如权利要求41、42或43中所述的种子在酶替代疗法中的使用。
52.如权利要求51中所述种子在酶替代疗法中的使用，主要是用来治疗以下疾病 戈谢病、糖原贮积症II型、法布瑞氏症、尼曼克氏B症，以及黏多醣贮积症I型、II型和 IV型。
53.在植物中生产人蛋白，尤其是在谷物胚乳中生产重组人溶酶体酶的方法如上所 述，参照附图。
全文摘要
一种在植物中生产人类蛋白质的方法，特别是在谷物胚乳中生产人重组溶酶体酶，包括首先是植物转化来获得蛋白，并将其固定在胚乳中，最终，这些蛋白不会被胚胎吸收，且大量蛋白的存在不能影响种子的活力及萌芽率。在第一步的植物转化中，用到一个胚乳特异性上游启动子基因编码的所述蛋白，以及一个信号肽共翻译转运新合成的蛋白至胚乳细胞内质网腔，用以组织特异性积累。第二步是植物种子胚乳中的蛋白积累。
文档编号C12N15/82GK102027122SQ200980117500
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月11日 优先权日2008年3月13日
发明者塔马拉·巴蒂, 布鲁诺·本比, 斯特凡诺·马尔凯蒂, 皮耶罗·克里斯蒂 申请人:创思阿克第瓦有限公司