提高植物水分利用效率的方法和手段的制作方法

专利名称：提高植物水分利用效率的方法和手段的制作方法
技术领域：
本发明是在植物分子生物学领域，涉及到有新的表型的转基因植物，生产此类植物的方法和以此方法生产有用的多核苷酸和多肽。更明确的是，本发明涉及抑制蛋白激酶以及具有抑制蛋白激酶活性的转基因植物。
背景技术：
水是植物的生存，生长和繁殖必不可少的。经过光合作用的二氧化碳的同化直接关系到水通过气孔的流失。与生物质生产密切相关的作物生产力，依赖于植物水分利用效率(WUE)，尤其是在水分限制的条件下(Passioura 1994 and Sinclair 1994，in Physiology and Determination of Crop Yield)。植物的生长周期中的水分利用效率， 可使用每单位水蒸腾量生成的生物质量比例进行计算(Sinclair 1994)。水分利用效率瞬时测量亦可通过使用气体交换测量法测定二氧化碳的吸收与蒸腾的比率来确定(Farquhar and Sharkey 1994，in Physiology and Determination of Crop Yield)。由于作物产量和水分利用效率密切相关，人们已作出许多努力，来学习和理解这种关系以及密切相关的基因组成。为了实现作物产能和产量的最大化，人们努力设法提高植物的水分利用效率 (Condon et al. ,2002, Araus et al. ,2002, Davies et al.，2002)。较高的水分利用效率可以通过提高生物质生产量和二氧化碳同化或通过减少蒸腾水分流失来实现。减少蒸腾作用，尤其是在非限水环境下，可能随之降低生长速度，从而减少作物产量。这就带来了一个两难选择，如何在水有限的条件下提高作物的产能和产量，同时在灌溉水或非限水条件下还能保持产量(Condon et al. ,2002) 对于水分利用效率的改善，到目前为止，都采用植物育种方法进行，藉此，将水分利用率较高的品种与高产能但水分利用率较低的品种进行杂交，在限水条件下以期改善作物的产量(Condon et al.，2002，Araus et al.，2002)。使用数量性状定位(QTL)的方法来确定水分利用效率的组成是历史上最普遍的方法(Mian et al.，1996，Martin et al.， 1989, Thumma et al. ,2001,Price et al.，2002)，最近，人们尝试通过分子遗传学手段来构建优良植物品种。第一个与水分利用效率相关的基因是ERECTA。ERECTA基因是在花序发育和器官形态中作为功能基因首次被发现的(Torii el al.，1996)。后来通过QTL定位发现，它是蒸腾效率的一个重要贡献因子，蒸腾效率被定义为每吸收一个二氧化碳蒸腾的水，在拟南芥中，作为一个与水分利用效率相反的指标(Masle el al.，2005)。ERECTA基因编码一个假定的富含亮氨重复的类受体激酶(LRR-RLK)。尽管有人提出，至少在某种程度上，其对气孔密度，表皮细胞扩张，叶肉细胞增殖和细胞间的联系有影响，但LRR-RLK的调控机制有待理解。在eracta突变体中，使用野生型ERECTA进行互补，可以恢复正常的蒸腾效率。然而，不能确定的是，在转基因拟南芥中过表达ERECTA是否会降低蒸腾效率或提高水分利用效率。 这是唯一的报告，显示植物类受体激酶与蒸腾效率或水分利用效率相关。另一个与水分利用效率相关的拟南芥基因是HARDY基因，是通过对活化标签突变体库的表型筛选而发现的(Karaba el al.，2007)。在水稻中过表达HARDY，通过提高光合吸收和减少蒸腾，最终导致了水分利用效率的改善。增强表达HARDY的转基因水稻在最佳水环境下发芽生物量有所增强，在限水条件下出根生物量有所增强。过量表达HARDY，在拟南芥中产生了含有更多的叶肉细胞的厚叶片，在水稻中提高了叶片和束叶细胞的生物量。这些修饰有助于提高光合活性和效率(Karaba et al.，2007)。蛋白激酶是一个大家族酶系，通过添加磷酸基团(磷酸化)修饰蛋白除。在所有真核基因中，蛋白激酶约占2%，其中许多介导了真核细胞对外界刺激的响应。所有的单亚基蛋白激酶在羧基端附近含有一个共同的催化结构域，而氨基端起着调节作用。植物类受体激酶为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其含有，氨基端的一段预知信号肽， 一段跨膜域和一段胞浆激酶域。在拟南芥中，有超过610种的潜在编码类受体激酶GhiU and Bleecker 2001)。类受体激酶往往是信号级联反应的一部分。他们在信号级联反应中解释胞外信号，通过配体结合，磷酸化目标，从而影响到下游的细胞过程，如基因的表达 (Hardie 1999) 可被操作用来提供有益特征的基因的鉴定是非常可取的。使用已确定的基因来评价所需要的特征也是同样的方法和手段。在TA^数据库中被定义为At2g25220的类受体激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是拟南芥中超过600名的成员的类受体激酶基因大家族中的一员(Shiu et al.，2001)。然而，除了作为一种激酶进行了序列的注释，并没有对 At2g25220基因进行功能和作用的披露。在本发明中，确定了高水分利用效率基因(HWE)， 当其表达或活性受到抑制时，会导致有益的表型，例如，相对于用水量，提高了植物生物量的积累。在限水条件或非限水条件下均可发生这种情况，并且确保更好的增长，因此植物有更大的生产率。

发明内容
本发明是基于以下发现，PK220基因的突变导致了植物表型的改变，例如，与未突变的植物相比，水分利用效率提高，耐旱性增强，对低温的敏感性降低、低氮条件下幼苗生长抑制性降低等等。
更具体地说，本发明涉及一种突变植物的鉴定，包含冊220基因的突变，在这里也称为HWE基因。该H(220基因是一种类受体蛋白激酶。在植物中抑制H(220基因的表达或活性提供了有益的表型，例如改进了植物的水分利用效率。改善的植物水分利用效率表型导致植物耐旱性增强。
在一方面，发明提供了一种获得转基因植物的方法，通过使用载体来转化植物、植物组织培养物、或植物细胞，载体中含有一种核酸构建物能够抑制PK220基因的表达或活性，从而获得PK220表达或活性水平降低的植物、组织培养物或植物细胞。从植物组织培养物或植物细胞中培育或再生植物，其中水分利用效率提高的植物被制备。
因此，本发明提供了一种具有改良属性的植物的生产方法，其中所述方法包括，抑制内源性H(220基因的表达或活性，其中所产生的植物具有有益的表型或改良的属性。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种用于生产水分利用效率提高的植物的方法，其中所述方法包括，转基因植物的形成以及使用所述方法进行植物基因组的修饰。
水分利用效率是指，当使用重力法测量时，生成的生物质的总量与单位水蒸腾量之间的比率，以及当使用气体交换定量法测量时，光合作用速率与叶片或枝条的蒸腾速率之间的比率。本文中所使用的术语“提高的水分利用效率“指的是，当与相应的野生型植物的水分利用效率相比时，植物水分利用效率是野生型的2，4，5，6，8，10，20或更多倍。举例来说，具有提高的水分利用效率的植物相比野生型植物，可能有5%，10^,15^,20%, 25%，30%，40%，50%，60%，70%，75%或更高的水分利用效率。
本发明的方法包括抑制或降低内源性基因的表达或活性，例如冊220，其中产生的植物具有有益的表型或改良的属性，例如提高的水分利用效率。一方面，本发明提供了一种植物的生产方法，该植物相对于野生型植物有提高的水分利用效率，通过在植物细胞中引入一个核酸构建物来抑制或降低H(220的表达或活性。举例来说，相对于野生型植物，具有提高的水分利用效率的植物由以下几步产生a)提供一种抑制H(220的活性的核酸构建物，该核酸构建物含有一个联结于其上的合适启动子；b)将核酸构建物掺入到载体中；C) 将该载体转化至植物、组织培养物或者植物细胞中，来制备具有PK220活性降低的植物、组织培养物或者植物细胞；d)从组织培养物或植物细胞中培育或再生植物，在此过程中制备该植物，与野生型植物相比，该植物的水分利用效率有所提高。该构建物包括一个启动子， 例如组成型启动子、组织特异性启动子或者诱导性启动子。优选的是，组织特异性启动子为根茎启动子。优选的诱导型启动子为干旱诱导型启动子。
术语“核酸构建物“是指一个全长基因序列或部分序列，其中一部分是最好至少有 19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100 或 150 个核苷酸长，或其互补体。 或者，它可能是一个寡核苷酸，单链或双链，由DNA或RNA或DNA-RNA双链组成。在一个具体实施方案中，核酸构建物包含PK220全长基因序列，或其中一部分，其中的一部分PK220 序列至少是 19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100 或 150 个核苷酸长，或其互补体。
本发明也提供了一种转基因植物，具有有益的表型或者改良的属性，例如提高的水分利用效率，通过本文描述的方法制备。
在另一个方面，本发明提供了一种植物，该植物在H(220基因中具有一个非天然存在的突变，其中，所述植物具有降低的H(220表达或活性，并且与野生型对照相比，具有提高的水分利用效率。PK220的表达或活性降低，是指与野生型H(220相比，在DNA、RNA或者蛋白质水平上，降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，或75倍或更多，或者与野生型 PK220 活性相比，降低 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60，或 75 倍。 PK220活性包括但不限于多肽底物的丝氨酸和/或苏氨酸残基处的激酶活性，那是它参与磷酸化反应的位置。
本发明进一步提供了转基因种子，由本发明的转基因植物制备，其中种子产生的植物，具有有益的表型或者改良的属性，例如与野生型植物相比，具有提高的水分利用效率。
在另一实施例中，发明提供了核酸用于在植物细胞中表达该核酸，来制备转基因植物，该植物具有有益的表型或者改良的属性，例如提高的水分利用效率。
在本发明中某些方面发现使用的编码野生型冊220基因或其中的一部分的模板序列由以下序列号描述:SEQ ID 1，7，9，11，12，13，24，25，27，四，31，33，35，37，39，41，43， 45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，84，86，88，90，92， 94，96，98，100，153，161和193。编码突变的PK220基因由SEQ ID 3和5描述。用于下调 PK220表达和活性的对构建物有用的模板序列由以下序列号描述SEQ ID 12，13，147，149， 153，161，168和174。本发明进一步提供了一些组合，包含本发明的核酸，用于在植物中进行表达，制备所述的转基因植物。
除非另有界定，此处使用的所有的技术和科学术语，具有与本发明所属领域中技术人员所熟知的含义相同的含义。虽然与此处所述类似的或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明，合适的方法和材料如下所述。所有出版物，专利申请，专利和本文提及的其他文献全部引用作为参考。在冲突的情况下，以本发明说明书，包括定义，为准。此外，材料， 方法及实例仅用于阐述目的而作为对本发明的限制。
本发明其他的特点和优势，将是显而易见的，并由下面的详细说明书和权利要求书涵盖。
具体实施例方式除非另有界定，此处使用的所有的技术和科学术语，具有与本发明所属领域中技术人员所熟知的含义相同的含义。虽然与此处所述类似的或相同的方法和材料可用于实践或检验本发明，合适的方法和材料如下所述。所有出版物，专利申请，专利和本文提及的其他文献全部引用作为参考。在冲突的情况下，以本发明说明书，包括定义，为准。此外，材料， 方法及实例仅用于阐述目的而作为对本发明的限制。
为方便起见，在本发明的进一步说明前，这里先进行用于说明、示例及要求的特定术语的规定。这些定义应当由本领域技术人员很容易阅读并理解。
“启动子序列”或“启动子”，是指在植物细胞中，能够诱导可操作基因序列转录的核酸序列。启动子包括，例如(但不限于)组成型启动子、组织特异性启动子，例如根茎启动子、诱导型启动子，例如干旱诱导型启动子、或内源性启动子，例如与兴趣基因即PK220基因相关的启动子。
术语“表达盒”是指载体构建物，其中一个基因或核酸序列被转录。此外，所表达的基因可能被翻译成多肽。
术语“表达”或“过表达”可以互换使用，都指的是，基因的表达也就是转基因的表达。相对于野生型细胞，细胞中的表达总水平可升高。
所谓“非天然存在突变"指的是任何方法，在一种植物或植物种群引入基因突变。 例如，化学诱变，如磺酸甲乙酯或甲磺酸乙酯，快中子诱变，DNA插入诱变如T-DNA插入或定点突变的方法。
术语“干旱胁迫"是指这样一种情况，相对水非受限情况，植物生长或产量受到抑制。术语“水分-胁迫”与干旱水分胁迫同义可互换。
术语“耐旱性”是指植物能够超越野生型植物的能力，在干旱胁迫条件下，或限水条件下，或相对于野生型植物在成长和发展过程中使用更少的水。
术语“水分利用效率”是一个比率表达式，当使用重力法测量时，指的是生成的生物质的总量与单位水蒸腾量之间的比率，当使用气体交换定量法测量时，指的是光合作用速率与叶片或枝条的蒸腾速率之间的比率。
术语“干重”是指已被干燥去除大部分细胞水的植物组织，与术语“生物质”这个词同义可互换。
术语“空”定义为，同胞基因分离的转基因线，已经失去掺入的转基因，因此作为对昭线。
说明书中使用了各种标准缩写，例如g，克；WT，野生型；DW，干重；WUE，水分利用效率；d，天。
术语“hwell6”指的是含有PK220基因突变的植物。
HWE基因指的是H(220基因序列，由H(220基因编码的蛋白质指的是H(220多肽或蛋白质。术语HWE和H(220是同义词。
术语“PK220核酸〃是指至少有一部分H(220核酸。同样的，术语“PK220蛋白质” 或“PK220多肽”是指至少有一部分蛋白质。一部分对于核酸来说是指至少21个核苷酸长， 对于蛋白质或多肽来说是至少有7个氨基酸。术语“AtfK220”指的是拟南芥PK220基因， 术语“BnPK220”指的是一个甘蓝型油菜PK220基因。
本发明部分地取决于有改良农艺属性植物的发现基础上的，例如，相对于野生型对照，水分利用效率提高，耐旱性增加，敏感性低温降低以在低氮条件下幼苗生长抑制降低。有益表型所对应的基因已被确定并证明是一种抑制PK220基因。
制备具有提高的水分利用效率的植物的方法在本说明书中详细进行了描述，包括突变植物、转基因植物、或者遗传修饰植物。具体来说，本发明确定了 H(220基因的功能，当其表达或者活性受到抑制时，可制备具有有益表型的植物。
两个或两个以上序列同源性的确定 要确定两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的同源性百分比，为实现最佳比较目的，所有序列被对齐。(例如，可以在用于最优对齐比较的两个序列任一个中引入间隔)。将氨基酸残基或相应的氨基酸位点的核苷酸或核苷酸位点进行比较。当第一个序列中的某个位点被第二个序列中相应位置的同样的氨基酸残基或核苷酸占据，那么这两个分子在此处是同源的(即这里所用的氨基酸或核酸“同源性“相当于氨基酸或核酸的“一致性“)。
核酸序列同源性，可以两个序列之间一致性的程度来确定。同源性也可使用本领域熟知的计算机程序来确定，如GCG程序包提供的GAP软件，见Needleman and Wunsch (1970)。使用GCG-GAP软件进行如下设定用于核酸序列比较GAP创建点为5. 0，GAP 延伸点为0. 3，类似的核酸序列的编码区域参照上面提到的，与序列号SEQ IDl显示的DNA 序列的编码序列部分一致性程度最好至少是70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，98 %，或 99%。
术语“序列一致性”指的是当进行特定区域比较时，在“残基-残基“基础上两个多核苷酸或多肽序列的一致性程度。术语“序列一致性百分比”通过所对比的区域中，比较两个最佳相似序列来计算，测定两个序列中相同核酸碱基(例如A，T，C，G，U，或I，在核酸的情况下)同时存在的位点的数量来得出匹配位点的数量，除以比较区域(例如窗口尺寸)的总位点数，然后将结果乘以100得出序列一致性百分比。这里所用的术语“实质同一性”是指一个多核苷酸序列特征，其中与对照区域的参考序列相比，该多核苷酸包括的序列中至少有80%的序列一致性，最好是至少85%，经常是90-95%，更常见的是至少99%。术语“阳性残基百分比”通过所对比的区域中，比较两个最佳相似序列来计算，测定两个序列中相同和保守氨基酸残基，如上所述，同时存在的位点的数量来得出匹配位点的数量，除以比较区域(例如窗口尺寸)的总位点数，然后将结果乘以100得出阳性残基百分比。
内源性PK220表达及活性的抑制 本发明的一方面，是关于抑制或降低PK220基因的表达和活性的方法和手段，任意地，导致冊220蛋白表达和活性的抑制或降低。术语“PK220表达或活性”包括抑制或减少这两个层次。PK220的表达或活性降低，是指与野生型冊220相比，在DNA、RNA或蛋白质水平上降低2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60或75倍或更多，或者与野生型 PK220 活性相比，PK220 蛋白活性降低 2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，60 或 75 倍。PK220活性包括但不限于多肽底物的丝氨酸和/或苏氨酸残基处的激酶活性，那是它参与磷酸化反应的位置。测定丝氨酸/苏氨酸激酶活性的方法是本领域人员众所周知的。
对于本领域的技术人员来说，目前已有很多方法来实现这种抑制作用，通过影响基因表达途径中各种步骤，例如转录调控，后转录和翻译调控。这些方法包括但不限于，反义核酸的方法，RNA干扰构建物，包括所有的发夹结构和有用的RNAi构建物，通过双链RNA 指导的DNA甲基化抑制或者通过mRNA的降解抑制，或翻译抑制，小RNA(miRNA)，包括人工 miRNA的(amiRNA) (Schwab et al.，2006)的技术，突变和TILLING方方法，在体内特定位点突变技术以及显性/隐性抑制方法。
基因抑制的一种优选方法包括RNA抑制(RNAi)技术也被称为发夹结构。拟抑制的基因的一部分被使用，并以正义和反义方向克隆，在正义和反义部分具有一定的间隔。 该部分基因的大小应至少为20个核苷酸长，间隔可能为13个核苷酸长(Kermerdell and Carthew, 2000)，可能是内含子序列，编码或非编码序列。
反义是一种常见的方法，即目标基因，或其中一部份，以一种反义方向表达，导致内源基因表达和活性的抑制。反义部分不需要一个全长基因，也不需要100%相同。只要反义序列与内源目的基因至少大约70%或更多相同，核苷酸长度至少为19，20，21，22，23， 24，25，30，40，50，60，70，75，80，90，100，或150。优选的是，核苷酸长度为50或更长，将取得预期的抑制作用。
在制备构建体时，编码野生型PK220基因及其中的部分序列对于PK220抑制是有用的，包括以下序列，例如，SEQ ID 序列号:1，7，9，11，12，13，24，25,27, , 31，33，35，37， 39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，84，86，
88，90，92，94，96，98，100，153，161和193。为了下调PK220的表达或活性，对于构建体有用的模版序列由以下序列号所述SEQ ID 12，13，147，149，153，161，168和174。
当使用反义策略下调，抑制内源基因的活性可有选择性的针对特定基因或所选的基因群，通过合适的选择用于反义表达的片段或部分基因。选择目的基因序列中存在，而相关基因群(非目的基因)中不存在或与非目的序列保守性小于70%的序列将会导致特异性基因抑制作用。
另外，amiRNA抑制可以用来抑制基因的表达和活性，以一种比其他RNAi方法更特异的方式。与需要小分子RNA和目标mRNA之间完美匹配的siRNA相反，amiRNA允许多达 5个不匹配，只要不超过2个连续不匹配。amiRNA的构建需要满足一定的标准，如Schawab
8et al. (2006)所述。这就提供了一种下调目的基因表达或活性的方法，使用的基因片段包含冊220中的至少21个核苷酸序列。
显性/阴性抑制类似于生化反应中的竞争性抑制。修饰的或突变的缺乏全功能的多肽的表达会与野生型或内源性多肽竞争，从而降低总的基因/蛋白的活性。例如，一个表达的蛋白质可能会结合到蛋白复合体或酶亚基上从而产生一个非功能复合物。或者，表达的蛋白可能与底物结合，但没有活性去执行天然的功能。非活性蛋白的表达水平足以降低或抑制整体功能。
表达PK220基因产生缺失活性的H(220蛋白可用于基因活性的显性/阴性下调。 这类似于竞争性抑制。例如，产生的PK220蛋白可能与目的分子联合或绑定，但缺乏内源性活性。这样的无活性H(220的一个例子是，分离自hwell6突变体的AtPK220序列，如序列号SEQ ID N0:3所示。目的分子可以是核酸序列的相互作用蛋白。在这种方式下，内源性蛋白PK220被有效稀释，下游响应将被衰减。
体内位点的特异性突变是可得到的，据此，可以在细胞的基因组中引入一个突变来产生特异性突变。该方法可见Dong et al. O006)详细描述，或者在美国专利申请公布号 20060162024中，其中提到了寡核苷酸定向基因修复的方法。另外一种方法，可以利用嵌合 RNA/DNA寡核苷酸，如Beetham(1999)所描述。因此，可能在细胞的内源性基因中产生未成熟终止密码，从而产生一种特异性无效突变。另外，突变可能会干扰初始转录的拼接，从而产生无翻译能力的mRNA，或者是一种产生可变多肽的mRNA，该多肽不具备内源性活性。优选的突变，能够造成PK220表达或活性减少或降低，包括，在核酸位点874处的C到T的转变，与序列号SEQ ID NOs :1或3—致，或者核酸突变导致了氨基酸位点292处的氨基酸转变，从亮氨酸(L)编码(CTT)变成了苯丙氨酸(F)编码(TTT)，与序列号SEQ ID NOs :2或4 一致。
TILLING是一种在已知基因中分离突变的方法，来自于EMS-诱变库群。使用 (Greene et al. ,2003)所详细描述的方法筛选诱变库群。
基因抑制的其他策略，对于本领域熟练的工作者，包括那些在这里没有讨论的以及未来发展的，都将是显而易见的。
AtPK220同源性的鉴定 拟南芥H(220(AtPK220)的同源性通过使用数据库序列搜索工具被确定，例如基本局部比对搜索工具(BLAST) (Altschul et al.，1990 and Altschul et al.，1997)。 该tblastn或blastn序列分析程序使用BL0SUM-62得分矩阵进行工作(Henikoff and Henikoff, 1992)。BLAST报告的输出提供一个分数，考虑到类似或相同的残基，以及为了保持序列对齐所需的任何间隙。得分矩阵指定一个分数用于对齐任何可能的序列对。P值反映的是希望看到一个分数偶然出现的次数。优选分数较高者，以及低阈值P值。这些都是序列相似性的标准。tblastn序列分析程序是用于查询数据库中的多肽序列，与核苷酸数据库中的六道翻译序列比对。选中P值小于-25，优选少于-70，更优选不到-100的，确定为同源序列(模板序列选择标准)。Blastn序列分析程序是用于查询核苷酸序列数据库中的核苷酸序列。在这种情况下，也优选得分较高者，首选P阀值小于-13，优选小于-50，更优选小于-100。
通过标准的PCR扩增技术可以分离PK220基因。使用PK220基因的保守区域引物和PCR扩增产生所需基因的片段或全长拷贝。模板可以是DNA，基因组或cDNA文库，或是 RNA或mRNA，使用逆转录PCR(RtPCR)技术。保守区域，可使用如BLAST或如CLUSTALW序列对比工具来确定。合适的引物被应用，并在本申请的其他地方进行了描述。
或者，一个来自于H(220基因的序列片段被随机引物进行32P放射性标记 (Sambrook et al.，1989)，用于筛选植物基因组文库(模板检测核苷酸)。作为示例，根据 Stockinger等人的方法，分离了来自于拟南芥，烟草，番茄，苦茴芹，甜樱桃，桃樱，黄瓜，或水稻的总植物DNA (Stockinger et al.，1996)。每种DNA样品大约取2到10微克进行限制性消化，转印至尼龙膜上(Micron Separations, ffestboro, Mass)进行杂交。杂交条件为 420C，50%甲酰胺，5X SSC，20mM磷酸缓冲液1 XDenhardt，s，10%硫酸葡聚糖和100微克/ 毫升鲱鱼精DNA。室温下用2XSSC，0. 05%肌酸钠和0. 02%焦磷酸钠缓冲液低严格清洗四次，然后在下使用0. 2 X SSC, 0. 05%肌酸钠和0. 01%焦磷酸钠缓冲液高严格清洗，直到按照Walling等人的方法，在冲洗液中检测不到(Walling et al.，1988)。阳性分离物进行鉴定，纯化和测序。其他方法也可用于杂交，例如Clonetech公司提供的ExpressHyb 杂交溶液。
PK220重组表达载体以及宿主细胞 本发明的另一个方面涉及到载体，优选的表达载体，含有一种编码H(220蛋白质的核酸，PK220基因或基因组序列或其中的部分类似序列或其同源序列。本文中所使用的术语表达载体包括被设计用于提供核酸序列转录的载体。转录序列可以被设计用于抑制与转录序列相关的内源性表达或内源性基因的活性。或者，转录核酸不需要翻译，而是以反义或发夹下调的方法抑制内源性基因的表达。此外，转录的核酸可能被翻译成多肽或蛋白质产物。多肽可能是一个非全长，突变或修饰后的内源性蛋白的变体。本文中所使用的术语 “载体”是指一种核酸分子，具有运送被链接于其上的另一种核酸的能力。一种载体类型是 “质粒”，它指的是环形双链DNA，附加的DNA片段可以被连接到其中。另一种载体类型是病毒载体，其中，附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体)。其他载体整合到被导入的宿主细胞的基因组中，并因此随宿主细胞的基因组的复制而被复制。此外，某些载体能够指导被操作连入的基因的表达。这种载体，在此统称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中通用的表达载体效用往往是质粒的形式。在目前的规范中，“质粒”和“载体”可以互换使用， 因为质粒是载体最常用的形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，如病毒载体或植物转化载体，二元的或其他方式，它们提供相同的功能。
本发明的重组表达载体包括本发明中的核酸以一种合适的形式在一个宿主细胞中进行表达，这意味着重组表达载体包括一个或多个调控序列，该序列基于对用于表达的宿主细胞的选择，也就是操作链接到被表达的核酸序列上。在一个重组表达载体中，“操作链接”是为了表示插入的核苷酸序列是被链接到调控序列上，以一种允许核苷酸序列表达的方式(例如，在一种体外转录/翻译系统中或者在宿主细胞中，当载体被导入到宿主细胞中时)。
术语“调控序列”意在包括启动子，增强子和其他表达调控元件(例如，多聚腺苷酸(polyA)信号)。例如，这种调控序列在Goeddel (1990)被描述。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列进行组成型表达的序列，以及那些只在某些宿主细胞中指导核苷酸表达的序列(如组织特异性调控序列)或诱导启动子(例如，对非生物因素的响应诱导，如环境条件，热，干旱，营养状况或细胞的生理状况，或生物的例如病原响应)。 合适的启动子的例子包括，例如组成型启动子，ABA诱导型启动子，组织特异性启动子以及非生物或生物诱导的启动子。这对于设计表达载体的技术人员将是不胜感激的，他们可以依靠这样的因子，选择被转化的宿主细胞，选择目的蛋白的表达水平，以及选择表的的时间和位置，等等。本发明的表达载体可以被引入到宿主细胞，从而产生由本发明所述的核酸编码的蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，PK220蛋白，PK220蛋白突变形式，融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可被设计用于在原核或真核细胞中表达H(220基因， PK220蛋白质，或其中的部分。例如，PK220基因或H(220蛋白质可以在细菌细胞中表达，如大肠杆菌，昆虫细胞(用杆状病毒表达载体)，酵母细胞，植物细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞中在Goeddel (1990)进一步讨论。另外，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
在一个实施例中，使用植物表达载体，本发明的核酸在植物细胞中表达。植物表达载体系统的例子包括肿瘤诱导(Ti)质粒，或部分来自于农杆菌，花椰菜花叶病毒 DNA(CaMV)，以及如 pB1121 载体。
对于植物表达，重组表达盒将包含，除冊220核酸外，还有能在植物细胞中发挥功能的启动子区域，转录起始位点(假如缺乏转录编码序列)，和可选的转录终止/加尾序列。 终止/加尾区域可从与启动子序列相同的基因或不同的基因中获得。在表达盒的5’和3’ 端引入独特的限制性内切酶位点，为便于允许插入一个预先存在的载体。
合适的启动子的例子包括来自于植物病毒启动子，如来自于从菜花花叶病毒 (CaMV)的35S启动子(Odell et al.，1985)，来自于基因的启动子，例如水稻肌动蛋白 (McElroy et al·，1990)，泛素(Christensen et al.，1992)，pEMU(Last et al.，1991)， MAS (Velten et al.，1984)，玉米 H3 组蛋白(Lepetit et al. , 1992 and Atanassvoa et al.，1992)，衍生自农杆菌T-DNA的5'-或3'-启动子，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(U. S. Pat. No. 5，683，439)，Nos启动子，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶启动子， GRP1-8启动子，ALS启动子(W0 96/30530)，合成启动子，例如Rsyn7，SCP和UCP启动子，核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶，水果特异性启动子，热休克启动子，种子特异性启动子以及其他来自于各种植物基因的转录起始区域，例如，包括不同的植物碱转录起始区域，例如，章鱼碱，甘露碱和胭脂碱。在某些情况下，与插入基因(如H(220)相关的启动子可能被用来表达插入的结构目的基因，例如野生型AtfK220启动子(PpK)。与冊220编码核酸序列连接的用于在植物细胞中表达的调控元件包括，终止子，加尾序列和核酸序列编码信号肽，使蛋白在植物细胞中定位或从细胞中分泌。这些调控元件的添加以及将这些元件与H(220基因的调控元件进行交换的方法是已知，包括但不限于，3’终止和/或加尾区域，例如，农杆菌胭脂碱合成酶基因(Nos)的3’终止和/或加尾区域(Bevan et al. , 1983)；马铃薯蛋白酶抑制基因II (PIN II) (Keil et al.，1986)，以及此处引用的文献)；以及An et al. (1989)； 以及 CaMV 19S 基因(Mogen et al.，1990)。
植物信号序列，包括但不限于，信号肽编码DNA/RNA序列，引导蛋白至植物细胞外的基质中(Dratewka-Kos et al.，1989)和皱叶烟草的延伸基因(De Loose et al.，1991)，或是将蛋白引导至液泡中的信号肽，如甘薯储藏蛋白基因(Matsuoka et al. , 1991)和大麦外源凝集素基因(Wilkins et al.，1990)，或是造成蛋白质分泌的信号，例如1 (Lund et al.，1992)，或那些引导蛋白至质体的信号，例如油菜籽enoyl-ACP还原酶(Verwoert et al. , 1994)对于本发明都是有用的。
在另一个实施方案中，重组表达载体，能够指导优选核酸序列在特定细胞型中表达(例如，组织特异性调控元件用于表达核酸)。组织特异性调控元件在本领域中众所周知。例如，与1々顶数据库中定义为At2g44790(P4790)的编码序列相关的启动子是一个根特异性启动子。与本发明中的核酸序列尤其有关的是在植物中具有可操作性的表达系统。 其中包括，在组织特异性启动子控制下的表达系统，以及那些在各种植物组织中具有可操作性的启动子所涉及的系统。各种发起人于各种植物组织可操作.. 器官特异性启动子也是众所周知的。例如，查尔酮合成酶-A基因(van der Meer et al. ,1990)或二氢黄酮醇_4_还原酶(dfr)启动子(Elomaa et al. , 1998)指导的在特定花卉组织中表达。此外，同样可用的启动子还包括patatin class I启动子，仅在马铃薯块茎转录激活，可用于目的基因在块茎(BeVan，1986)中的表达。另一个马铃薯特异性启动子是颗粒-绑定的淀粉合成酶(GBSS)启动子(Visser et al.，1991)。
适合目的器官的其他器官特异性启动子可以利用已知的程序进行分离。这些控制序列通常在目的器官中伴随着基因独特的表达。在典型的高等植物中，每个器官含有成千上万的mRNA，而这些mRNA在其他器官系统中是没有的(Goldberg综述，1986)。
由此产生的表达系统被连接入或者构建引入德奥重组载体中，该载体适用于植物转化。载体可能还包含一个选择标记基因，通过它可以培养鉴定转化的植物细胞。标记基因可以编码抗生素抗性。这些抗性标记包括G418，潮霉素，博莱霉素，卡那霉素和庆大霉素。 或者标记基因可以编码除草剂抗性基因，能够耐受草铵膦或草甘膦类型的除草剂。转化植物细胞后，那些含有载体的细胞可以通过它们在含有特定抗生素或除草剂的培养基中的生长能力来确定。通常，也包括允许载体被克隆至细菌或噬菌体宿主中的细菌或病毒的复制起始序列，优选包括广泛宿主范围的原核起始复制。对于细菌，还应包括合适的选择标记， 允许进行含有目标构建体的细菌细胞的筛选。合适的原核筛选标记还包括对于如卡那霉素或四环素等抗生素的抗性。
其他的编码附加功能的DNA序列也可以含在载体中，在本领域中是众所周知的。 例如，在农杆菌转化的情况下，也将包括T-DNA的序列，用于随后的植物染色体的转化。
本发明的另一个方面涉及到宿主细胞，本发明的重组表达载体被引入其中。术语 “宿主细胞”和“重组宿主细胞”是可以互换使用的。据了解，这些术语不仅指特定的主体细胞，同样也指此细胞的后代或潜在的后代。由于要么突变或环境影响，某些修饰可能存在于随后的子代中，这样的后代事实上可能不会与亲代细胞相同，但仍然包括在此处所用的这个词的范围内。
载体DNA可以被引入到原核或真核细胞中，通过传统的转化或转染技术。如本文所用的，术语“转化”和“转染”的本意指的是各种公认的技术，用于将外来的核酸(如DNA) 引入宿主细胞。
本发明的宿主细胞，例如培养中的原核或真核宿主细胞，可用于生产(即表达)本发明所述的多肽，该多肽由本发明所述的多核苷酸的开放阅读框所编码。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞用于生产多肽的方法。在一项具体实施方案中，该方法包括在合适的培养基中，培养本发明的宿主细胞(其中编码本发明的多肽的重组表达载体已被引入)，使细胞产生多肽。在另一项实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离多肽的方法。
许多的细胞类型可以作为合适的宿主细胞用于表达本发明中的多肽，多肽由多核苷酸形式的开放阅读框编码。植物宿主细胞包括，例如，能够作为合适的宿主细胞用于表达本发明的多核苷酸的植物细胞，包括，表皮细胞，叶肉和其他地面组织，叶片、茎、花器官中的维管组织，和各种植物的物种的根，如拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、玉米、水稻、棉花和大豆。
编码非全功能的PK220蛋白的PK220核酸的表达，在显性/隐性抑制方法中会很有用。PK220突变多肽，或其部分，在植物中表达，使其拥有部分的功能。突变的多肽，例如， 可以具有结合到其他分子的能力，但阻止复合体的适当活性，从而造成PK220活性的总体抑制。
转化的植物细胞以及转基因植物 本发明包括原生质体，植物细胞，植物组织和植物(如单子叶和双子叶植物)，使用PK220核酸、含有PK220核酸的载体或含有PK220核酸的表达载体进行转化。本文所用的“植物”是指不仅包括完整植物，同样也包括其中的部分(即，细胞和组织，包括例如叶， 茎，芽，根，花，果实和种子)。
该植物可以是任何植物类型，包括，例如，来自于以下属类的物种拟南芥，油菜， 水稻，玉米，高粱，短柄，芒草，棉花，小麦，大豆，豌豆，绿豆，番茄，红车轴，大麻，南瓜，罗莎， 葡萄，核桃，草莓，莲花，苜蓿，红豆草，葫芦，豇豆，柑橘，亚麻，天竺葵，木薯，胡萝卜，萝卜， 芥，颠茄，辣椒，曼陀罗，天仙子，烟草，马铃薯，矮牵牛，洋地黄，马约喇纳，菊苣，向日葵，莴苣，雀麦，芦笋，金鱼草，萱草，Nemesis,天竺葵，稷，狼尾草，毛茛属，千里光，美人襟，黄瓜， Browaalia,黑麦草，燕麦，大麦，黑麦，云杉，可可，胡杨。
本发明还包括细胞，组织，例如包括叶，茎，芽，根，花，果实和种子，以及从转化的植物中衍生的后代。
已知有多种方法用于将外源基因引入植物中，这些方法可用于将基因插入到植物宿主中，包括生物和物理的植物转化标准步骤(见，例如Miki et al. , (1993) "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants，，，In :Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc. , Boca Raton, pages 67-88 ；Andrew Bent in,Clough SJ and Bent AF, (1998)“Floral dipping :a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”)。随宿主植物的不同选择不同的方法，包括化学转染方法，例如钙磷酸，聚乙二醇(PEG)转化， 微生物介导的基因转移，如农杆菌(Horsch et al.，1985)，电穿孔转化，原生质体转化，微注射，花浸渍和基因枪法。
农杆菌介导的转化 将表达载体引入植物中最广泛使用的方法是建立于根瘤农杆菌和发根农杆菌的天然转化系统上的，农杆菌是植物病原细菌，病原细菌可遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒，分别携带用于植物遗传转化的响应基因(见，例如，Kado,1991)。农杆菌载体系统的详述和农杆菌介导的基因转移的方法请见Gruberet al. (1993) 禾口 Moloney et al.，(1989)。
转基因拟南芥植株可容易制备，通过浸泡开花植物到农杆菌培养基中的方法，该方法是建立在Andrew Bent in, Clough SJ and Bent AF，1998的方法基础上的。《花卉浸渍一种简化方法用于农杆菌介导转化拟南芥》。野生型植物生长到同时含有未开和已开的花朵。将植物倒置如农杆菌培养溶液中1分钟，该溶液含有合适的基因构建体。然后将植物向左水平放置在托盘中，加盖两天保持湿度，然后向右翻转装到袋子中，继续生长和萌发种子。然后收获成熟的种子。
直接基因转移 一个普遍适用的植物转化方法是基因枪微粒介导的转化，其中DNA置于大小为1 至4微米的微粒表面。使用基因枪装置将表达载体引入到植物组织中，基因枪将微粒加速到300-600米/秒，足以穿透植物细胞壁和细胞膜(Sanford et al.，1993 ；Klein et al.，
1992)。
植物转化也可以通过气溶胶束注入器(ABI)的方法来实现，见 U. S. Pat. 5，240，842和U. S. Pat. 6，809，232所述。气溶胶束技术是用来加速湿或干粒子的速度使粒子穿透活细胞。气溶胶束技术利用惰性气体射流扩展，它从一个高气压区域通过一个小孔，进入低气压区。膨胀气体加速气溶胶液滴，其中包含的核酸分子被导入细胞或组织中。加速粒子定位于冲击首选的目标，例如植物细胞。这些粒子被构建成一个个尺寸足够小的液滴，使得细胞能忍受渗透压。使用本应用领域中人员所周知的标准技术，使转化的细胞或组织生长来制备植物。
转化子的再生 从任一单一植物原生质体或不同的外植体开发或再生植株的技术是众所周知的 (ffeissbach and ffeissbach, 1988) 0这种再生和成长过程通常包括的步骤有，转化细胞的选择，通过植株扎根阶段的胚胎发育，培养这些分化的细胞。转基因胚胎和种子以同样方式再生。由此产生的转基因根苗然后种植于适当的植物生长培养基中，如土壤等。
可以通过本领域熟知的方法，见(Horsch et al，1985)，实现含有外源基因的植物的开发和再生，该基因编码的有益多肽是由农杆菌介导从叶片外植体引入的。在此过程中， 在含有筛选试剂的培养基中培养转化子，培养基能够诱导被转化的植株的根系的再生，如 (Fraley et al.，1983)所述。特别的是，U. S. Pat. No. 5，349，124 (本文特别纳入参考文献) 详细介绍了基因转化的生菜细胞和由此的得到的植株的制备方法，该植物表达了对鳞翅目幼虫具有杀虫活性的杂种晶体蛋白。
此过程通常会在两到四个月内生芽，然后将这些芽转移到适当的根诱导培养基中，培养基含有选择性试剂剂和抗生素，以防止细菌滋生。为了形成植株，然后将在含有选择性试剂下生根的小芽转培至土壤或其他培养基中来促使在根的生产。这些步骤不尽相同，主要依赖于所用的特定植株，这些不同的方法是本领域众所周知的。
优选的是，再生植株是自花授粉，以提供纯合转基因植物，或者由再生植株的获得花粉，与重要农艺性状的种-生植物杂交，优选自交系植物。相反地，来自于重要系品植物的花粉用于给再生植株授粉。本发明中含有目的多肽的转基因植物的种植使用的是本领域技术人员所周知的方法。
14 优选的转基因植物是一种独立分裂的，能够将PK220基因构建体转移至其后代。 更优选的是，转基因植物对于基因构建体是纯合的，能够在性状分配时，将此基因构建体转移至所有的后代。从转基因植物得到的种子可以生长在外地或温室中国，以及由此产生的性成熟的转基因植物是自授粉的从而产生真正的的自交产生真正的育种植物。从这些植物得到的后代变成了真正的育种系，可用于评估PK220基因表达的降低。
制备转基因植物的方法 本发明还包括生产转基因植物的方法，相对于野生型植物，转基因植物具有以下特点增加的水分利用效率，降低的低温敏感性以及在低氮条件下，幼苗生长抑制减少。该方法包括在一个或多个植物细胞中引入一种化合物，该化合物抑制或降低植物中PK220基因的表达或活性，产生转基因植物细胞，以及从转基因细胞中再生转基因植物。该化合物可以是，例如，(i)PK220多肽；(ii)PK220核酸，类似物，同系物，同源基因，部分基因，变种或其互补序列；(iii)降低PK220核酸表达的核酸。降低PK220核酸表达的核酸可以包括启动子或增强子元件。该PK220核酸可以是内源性的或外源性的，例如，拟南芥的PK220核酸可以导入甘蓝型油菜和玉米种中。优选的是，对于被转化物种，该化合物是H(220内源性核酸序列。另外，对于被转化物种，该化合物可以是H(220外源性核酸序列，并且，相对于内源性靶序列，该化合物具有至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %或更高的同源性。
与野生型植物(即未转化的)相比，转基因植物在不同的方面的有不同的表型。通过不同的表型，意味着该植物具有一个或多个特点，与野生型植物不同。例如，当转基因植物与一种化合物接触，该化合物降低了 PK220核酸的表达或活性，那么该植物相对于野生型植物，具有一种表型，如增加的水分利用效率，降低的低温敏感性以及在低氮条件下，幼苗生长抑制减少。
该植物可以是任何植物类型，包括，例如，来自于以下属类的物种拟南芥，油菜， 水稻，玉米，高粱，短柄，芒草，棉花，小麦，大豆，豌豆，绿豆，番茄，红车轴，大麻，南瓜，罗莎， 葡萄，核桃，草莓，莲花，苜蓿，红豆草，葫芦，豇豆，柑橘，亚麻，天竺葵，木薯，胡萝卜，萝卜， 芥，颠茄，辣椒，曼陀罗，天仙子，烟草，马铃薯，矮牵牛，洋地黄，马约喇纳，菊苣，向日葵，莴苣，雀麦，芦笋，金鱼草，萱草，Nemesis,天竺葵，稷，狼尾草，毛茛属，千里光，美人襟，黄瓜， Browaalia,黑麦草，燕麦，大麦，黑麦，云杉，可可，胡杨。
实施例 高水分利用效率突变株hwel 16的鉴定 一株拟南芥EMS突变体(哥伦比亚背景)最初被确定为具有耐旱属性。该突变体用于测试最佳和干旱条件下的水分利用效率。结果表明，该突变体耐旱的性质是由于其具有较高的水分利用效率，无论在水胁迫或最佳水分条件下。因此，此突变株被命名为 hwell6。
基于图谱的hwell6克隆 通过hwell6突变株与拟南芥的兰茨贝格生态型(Ler)交叉，产生F2种群，用于基于图谱的克隆，通过测定突变株的耐旱性，以及因此确认突变株具有高水分利用效率特点。 经5天干旱处理，测定F2种群的单位干重失水率水，得到的数据进行常规化，用于QTL分析，与hwell6突变株和两种野生型生态型对比，每单位F2植株干燥失重是衡量一在5天的干旱处理和数据分析的QTL是相对于twel 16突变体和野生型的两个生态型，兰茨贝格株和哥伦比亚株。收集表型实验中来自于所有的F2和对照植物的叶片组织，用于基因型分析。 用Mapmaker3. 0和WinQTLCart2进行QTL分析。为了进一步确定QTL峰内的突变，使用了芹菜内切酶I (CEL I)。
使用CEL I核酸酶的突变检测 芹菜内切酶I (CEL I)，能够在碱基对替换的位点高度的异性的切割DNA，而碱基对替换造成了野生型和突变体的等位基因之间的错配，因此芹菜内切酶I被报道用于检测 EMS 突变株中的突变位点(Yang et al. ,2000 ；Oleykowski et al.，1998)。
使用hwell6或亲代哥伦比亚株基因组DNA为模板，通过优化的PCR扩增得到约 5kb的DNA片段。扩增产物等量混合在一起，然后进行一个变性和退火循环形成异源双链 DNA。42°C下使用CEL I温浴20分钟，在异源双链DNA的突变点处切割。使用琼脂糖凝胶电泳和EB染色观察DNA片段。
使用此方法扩增51Λ的PCR产物，引物为SEQ ID NO :102和SEQ ID N0:104，模板为hwell6，和哥伦比亚型对照。形成的异源双链PCR产物经CEL I酶切后产生了小片段 (1.4和3. 6kb)。使用引物SEQ ID NO :104和SEQ ID NO 105扩增重叠的亚片段(约3kb)， 进一步确定突变位点。亚片段经测序后，发现hwell6中的C核苷酸突变为T核苷酸。
由于核酸序列SEQ ID NO :1和3中的874位核苷酸的C到T的转变，产生了氨基酸的改变，292位的氨基酸由亮氨酸(L)的密码子(CTT)改变为苯丙氨酸(F)的密码子(TTT)， 因此有益突变被鉴定。含有突变的基因被确定是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr PK) 0野生型基因被确定为与GenBank登录号At2g25220相同。该丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在本文中被称为AtH(220，hwell6的确定突变形式被称为AtPK22oL292F。
转录评估 Northern分析和RT-PCR检测表明，相对于野生型对照，tiwe 116中的AtH(220基因的表达水平和转录尺度未发生改变。
部分AtPK220L292F和AtPK220序列的初始克隆 基于TAIR 的注释，AtPK220L292F(AtPK220L292F(p))的部分序列和 AtPK220AtPK220 (P))的部分序列采用RT-PCR反应进行扩增，使用如下引物SEQ ID NO: 106和SEQ ID NO :107，分别含有BamH I和I^st I酶切位点用于克隆，模板的RNA分别分离自tiWell6和对照植物(哥伦比亚型)。产生的部分AtfK220I^92F核苷酸序列见SEQ ID NO :5，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO :6。产生的部分AtH(220核苷酸序列见SEQ ID NO: 7，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO :8ο 大肠杆菌表达的部分AtfK220I^92F蛋白的激酶活性分析 PCR产物用BamH I和I3St I消化，并插入到表达载体pMAL_c2 (New England Biolabs,Beverly,ΜΑ)中与malE基因形成一种符合读码框的融合蛋白，用于表达麦芽糖结合蛋白MBP-AtPK220L292F(p)和MBP_AtPK220 (P)。融合蛋白在大肠杆菌中表达，采用淀粉亲和层析法进行纯化，如制造商(New England Biolabs)所述。含有融合蛋白的组分经汇集和浓缩(Centripr印-30浓缩器，Amicon)。采用SDS-PAGE电泳方法分析其表达水平，融合蛋白的大小和纯度。
活性分析参照(Huang et al. ,2000)的方法进行。激酶自动磷酸化分析混合物 (30 μ 1)包含激酶反应缓冲液中蛋白激酶(50mM Tris, pH 7. 5，IOmM MgCl2, IOmM MnCl2),IyCi [γ -32ρ]ΑΤΡ 以及 IOng 纯化的 AtPK220L292F (P)或 MBP_AtPK220 (P)。对于反磷酸化分析，每个检测反应中添加髓鞘碱性蛋白(3yg)。通过添加酶起始反应。室温下孵育30 分钟后，加入30 μ 1 Laemmli样品缓冲液终止反应(Laemmli，1970)。样品在95°C反应5分钟，然后上样于15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。使用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色，然后脱色，烘干。采用Kodak X-Omat AR膜检测32P标记的条带。
野生型的MBP_AtPK220(p)融合蛋白能够在体外活性检测中磷酸化人工底物，表明检测系统是有效的，MBP-AtPK220(p)融合蛋白具有活性能力。与此相反，hwell6的突变形式，MBP-AtPK220L292F(p)，不能催化模式底物的磷酸化反应。单点突变足以消除hwell6 的AtfK220(p)基因的活性。
AtPK220全长cDNA序列的分离 1々顶数据库中AtPK220(At2g25220)的注释确定了 5'起始密码子，终止信号和 3' UTR序列。注释序列的5'部分分析表明了可选的5'序列和启动子的位置。为了确定 AtPK220基因的5'区域以及类似的起始密码子，使用了 SMART RACE方法(快速cDNA末端扩增，CloneTech)。
设计特异性的引物SEQ ID NO :108，用于5，RACE，得到了 450bp的PCR产物。由 450bp的PCR产物测序得到的数据表明，TAIR中注释的AtPK220缺失了 5，端的186bp，其中包括39bp的5' UTR区序列和147bp的编码序列。在TA^的基因组注释中，还缺失了一个位于AtPK220起始密码ATG的上游324bp的内含子。
将5 ‘ RACE结果和TA^数据库注释相组合，得到全长的AtfK220的cDNA序列 (SEQ ID NO 9)。该序列被确定长度为lM2bp，其中包括39bp的5' UTR, 204bp的3' UTR 和1299bp的编码区。该AtH(220编码区被确定为序列SEQ ID NO :1，编码432个氨基酸的蛋白质，如序列SEQ ID N0:2所示。比较AtfK220和其最接近的同源基因，At4g32000，结果显示在AtH(220中存在51bp的额外序列，包括序列SEQ ID NO 9的368-418核苷酸序列。 这个序列提供了一个用于下调构建体的靶序列，该构建体被设计用来专门下调AtfK220基因，而不是非-靶基因，如At4g32000。
AtPK220的序列分析表明，该丝氨酸/苏氨酸激酶属于类受体蛋白激酶家族，具有信号肽(1-29)，胞外域(30-67)，单跨膜域(68-88)，ATP结合域(152-175，由Prosite 测定)，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域067-279，由MterPro法测定)以及一个激活环 (289-298,303-316)。
AtPK220 恢复 hwell6 突变株 构建野生型AtPK220表达的构建体，并将之转化至hwell6突变株。构建体在CaMV 35S启动子作用下进行组成型表达，并称构建体为35S-AtPK220。
35S-AtPK220 使用引物对SEQ ID NO :109和SEQ ID NO :110，扩增的片段包含全长的AtPK220开放阅读框(ORF)。使用引物对SEQ ID NO :111和SEQ ID NO :110，扩增的片段包含AtH(220 的一部分0RF。扩增的片段用限制性内切酶Sma I和BamH I消化，并克隆至经相同的限制性内切酶消化的PEGAD载体。经PCR及随后的限制性酶切产生的包含AtPK220全长开放阅读框的片段如序列SEQ ID N0:10所示。经PCR及随后的限制性酶切产生的包含部分AtfK220 的ORF的片段如序列SEQ ID NO 11所示。
35S-AtPK220构建体转化至拟南芥hwell6中。转基因株被恢复并推进到T3纯合品系。测试这些品系的抗旱性和水分利用效率特征。35S-AtPK220构建体恢复了野生型的表型。
T-DNA敲除品系及生理评估 AtPK220及两个相近的的同源基因的SALK T-DNA敲除品系，通过ABRC获得并推进纯合性。两个基因的 TAIR 登录号为 AT4G32000(SEQ ID NO :16)和 AT5G11020 (SEQ ID NO: 18)。它们如下所列； AtPK220 :SALK147838 ； AtPK32000 (AT4G32000) :SALK_060167，SALK_029937 and SALK_121979 ； AtPKl 1020(AT5G1 1020) :SAIL_1260_H05 经RT-PCR或Northern检测分析基因的表达水平，结果表明，敲除株的目的基因显着减少或者完全消失。这些基因敲除品系用于生理评估。只有AtfK220(SAL_147838)的基因敲除品系具有有显着的抗旱性和较高的水分利用效率，表明AtPK220是目的基因并负责 hwell6的水分利用效率表型。密切相关的基因AT4G32000和AT5G11020是非功能性冗余的，这些基因的抑制不足以产生hwell6表型型。
拟南芥中冊220蛋白活性的抑制 基因活性的抑制可以通过多种方式的技术方法获得，例如，反义表达，RNAi或发夹结构，体内突变，显性负向途径或者制备突变种群，通过筛选方法选择适当的品系等。所提供的例子说手段，这里提供的所述方法的离子用于制备具有抑制PK220基因的表达或活性的植物。
通过RNAi 下调 PK220 使用发夹(HP)构建体设计用于H(220的RNAi抑制。构建体由AtH(220 cDNA序列的 288bp 或 154bp 组成，分别称之为(270)PK220 和(150)PK220。288bp ^ (270)PK220 片段含有IObp的内含子序列，在构建这些PCR产物的过程中包含在PCR引物中。可以使用这些片段构建载体，在所选的启动子的控制下来驱动表达，此过程对于本领域的技术人员是显而易见。在这些实施例中，组成型启动子(35S CaMV)，或天然AtfK220启动子(PPK)被使用。AtPK220基因的两个片段，或部分被选择，以最接近的同源At4g32000为对照，AtPK220 的不同区域被选定，首先是的Q70)PK220片段(SEQ ID NO 13)，第二是154bp的 (150)PK220 片段(SEQ ID NO: 12)。
35S-HP-At(270)PK220 及 35S_HP_At(150) H(220 发夹结构(HP)35S-HP-At Q70) PK220 和 35S_HP_At (150) PK220 构建体的生成如下。分别采用引物对 SEQ ID NO :134/SEQ ID NO :115 禾口 SEQ ID NO :114/SEQ ID NO :115 进行RT-PCR扩增，得到(270)PK220和(150) ΡΚ220的正义片段。PCR产物经&ic I酶切，并分别插入到二元载体pBI121t⑶S的Mc I位点。由此产生的载体随后用于亚克隆O70) PK220和(150) PK220的反义片段，反义片段分别采用引物对SEQ ID NO :112/SEQ ID NO: 117和SEQ ID NO :116/SEQ ID NO :117进行RT-PCR扩增得到。载体和PCR产物都用BamH I和Xba I消化用于亚克隆。
Pre-HP-At (270) PK220 及 Pre-HP-At (150) PK220 Ppk-HP-At (270) PK220 和 Pre-HP-At (150) PK220 构建体分别由；35S-HP_At (270)
18PK220 或;35S-HP-At(150)PK220 制备得到，通过使用 AtPK220 启动子序列(SEQ ID NO 14) 替换35S启动子序列。通过Hind III和)(ba I双酶切将35S启动子序列从35S_HP_At (270) PK220和35S-HP-At (150)PK220除去。线性化的质粒然后用DNA聚合酶I的Klenow片段产生平末端并自我连接，形成一个新的质粒，其中的)(ba I位点恢复，而Hind III位点消失。 使用该恢复的)(ba I位点，一个AtfK220启动子的NheI DNA片段被克隆至HP-At (270)和 HP-At (150)序列的上游，产生最终的质粒 Pre-HP-At (270)H(220 和 Pre-HP-At (150)H(220。 AtfK220启动子序列(SEQ ID NO 14))从拟南芥(哥伦比亚型)的基因组中进行PCR扩增， 使用引物对 SEQ ID NO :135/SEQ ID N0:136。
P4790-HP-At (270) PK220 为了特异性下调内源性AtfK220，强力的根系启动子P479tl被鉴定发现在拟南芥的根中能高表达，特别是在内皮层，周皮层和轴管中。P479tl启动子与At2g44790编码序列相关， P4790的表达特征与野生型AtPK220的表达是相似的。该P479tl用于替换35S-HP-At (270) PK220 中的35S启动子。以拟南芥(Col)为模板，使用引物SEQ ID NO :151和SEQ ID NO :152扩增At2g44790。扩增的启动子片段为1475bp长，正好位于TA^注释中At2g44790的起始密码子ATG的上游。1475bp的P479tl片段被确定为SEQ ID N0:150。通过引物设计在启动子的 5’和3’端引入Hind III和Xba I酶切位点。通过HindIII/Xbal双酶切，将启动子序列替换35S-HP-At(270)H(质粒中的35S启动子，得到最终的构建体pBI-P4790-HP_At (270) H(。
使用RNAi下调油菜中的BnPK220 35S-HP-Bn(340)PK 为了下调油菜种属中的AtfK220同源基因，制备了一个发夹结构，采用BnPK220的 338bp的片段(SEQ ID NO ；153)作为正义和反义部分，pBI300t⑶S作为载体。根据&JK220 序列设计两对具有独特酶切位点的引物SEQ ID NO :154/SEQ ID NO :155;以及SEQ ID NO: 156/SEQ ID N0:157。以甘蓝型油菜的cDNA为模板分别用两对引物扩增338bp长的PCR 片段。McI片段插入到pBI300t⑶S载体的McI位点，以反义方向位于t⑶S间隔区的下游。产生的质粒，随后在)(bal和BamHI位点用于以正义的方向克隆^CbaI-BamI片段。载体pBI121t⑶S经内部的NPTII筛选标记基因修饰，命名为pBI300。pBI121载体内的NPT II基因含有一个点突变(3383位置的G到T，氨基酸改变E182D)。为了将基因恢复到野生型版本，该载体的NheI-BstBI片段Q715-3648位置)被来自于质粒pRD400的相应的 NheI-BstBI 片段所替换(PNAS，87 :3435-3439,1990 ；Gene, 122 :383-384,1992)。
P4790-HP-Bn (340) PK At2g44790的P479tl启动子用于控制发夹结构的表达来下调油菜种属的内源性 BnPK220o 质粒;35S-HP_Bn (340) I3K 经 Hind III 和 Xba I 酶切后，用 P479tl 启动子替换 35S 启动子。
通过反义下调H(220 制备构建体35S—antisenseAtPK220用来通过反义下调AtH(220的表达。使用引物对SEQ ID NO :106/SEQ ID NO 113进行PCR产生反义片段。合成的产物用BamHI和XbaI 消化产生一个1177bp的序列，含有1160bp的AtH(220基因(SEQ ID NO: 11)。包括有，5' 端IObp的内含子序列，以及从PCR引物中保留的3'端7bp的3' UTR序列。以与35S启动子反义的方向，将1177bp的片段克隆到pBI121 w/o⑶S载体上的BamHI和)(baI位点。
通过AmiRNA 下调 PK220 构建一个人造小RNA(amiRNA)用于在拟南芥中下调AtPK220的表达。以拟南芥(Col)基因组为模板，利用PCR扩增拟南芥中包含micr0RNA319a基因的DNA片段(SEQ ID NO :148)，引物为 SEQ ID NO :141 和 SEQ ID NO :142。miR319a 的骨架然后用于构建 amiRPK220 (SEQ ID NO 149)，其中，利用重组PCR方法将miRNA319a中正义及反义方向的 21bp的片段用AtPK220中的21bp的DNA片段替换。设计三对引物用于构建过程SEQ ID NO :141/SEQ ID NO :144 ；SEQ ID NO :143/SEQ ID NO :146 以及 SEQ ID NO :145/SEQ ID NO 142。最后的PCR产物用BamHI和)(baI酶切，然后克隆到载体pBI121w/o⑶S中，用于转化拟南芥或选择的其他植物物种。
通过显性-隐性策略抑制冊220 35S-AtPK220L292F 为了非功能AtPK220序列的表达，用RT-PCR扩增来自hwe 116的AtPK220L292F， 采用正向和反向引物SEQ ID N0:118和SEQ ID NO 1100 PCR产物用限制性内切酶BamHI 和XbaI消化(SEQ ID NO :121)，连入双元载体pB1121w/oGUS。SEQ ID NO :121的序列包含 AtPK220L292F开放阅读框(SEQ ID NO :3)，在5'端多了 3bp，以及3'端多了 7bp，这是从 UTR序列(SEQ ID NO :121)中衍生出来的。最终的构建体，35S_AtPK220L292F，用于产生拟南芥和油菜转基因植株，进一步得到纯合体用于生理评估。此外，载体用来转化所选的植物品种，可以是双子叶植物或单子叶植物。
P4790-AtPK220L292F 根启动子P479tl的HindlII-XbaI酶切片段，用于替换pBI300中的35S启动子，然后 AtPK220L292F序列通过XbaI和BamHI消化置于P479tl的下游，来产生P479tl-驱动的显性-隐形构建体。所得的质粒，然后用于油菜的转化。此外，载体用来转化所选的植物品种，可以是双子叶植物或单子叶植物。
利用RNAi下调单子叶植物的AtfK220同源基因 PBdUBQ—HP—Bd(272)PK 构建一个表达盒，插入到连个不用的载体骨架中，第一个是插入到pUCAP载体的 PacI-AscI 位点，第二个是插入到 pBF012 载体的 PacI-AscI 位点。pBF012 与 pBINPLUS/ARS 是基本相同的，除了通过FseI消化及自我连接，切除了马铃薯-Ubi3驱动的NPTII表达盒。
二穗短柄草的H(220(BdPK220)被扩增，使用不同的引物组合SEQ ID NO :158(bffET XbaI F)加SEQ ID NO :159 (bffET BamHI R)，引物中分别含有XbaI位或BamHI位点，以及 SEQ ID NO :158(bWET XbaI F)力口 SEQ ID NO 160 (bWET ClaI R)，引物中分别含有XbaI 位或 ClaI位点。PCR产物经相应的限制性内切酶消化后，得到272bp的片段(SEQ ID NO :161)。
发夹间隔序列，BdWx内含子1 (SEQ ID NO :164)，被扩增，使用引物SEQ ID N0: 162 (bffx BamHI F)加 SEQ ID NO :163(bffx ClaI R)，引物中分别含有 BamHI 位点或 ClaI 位点，然后用相应的限制性内切酶消化。二穗短柄草的fe基因是水稻蜡质基因GBSS的同源基因，尽管内含子的保守性较小。
三个片段连接到一起，插入到pUCAP载体的多克隆位点，产生了两侧分别为方向相反的BcK272)PK220靶序列包围的Bdffx内含子1序列。二穗短柄草泛素(BdUBQ)启动子包含一个内部的BamH I位点，因此，使用引物SEQ ID NO :200 (WET BamH I endl)和SEQID NO :165 (WET BamH I end2)扩增RNAi结构盒，这会产生BamH I粘性末端而不需要消化。RNAi的BamH I片段，然后连接至pUCAP的BamH I位点，载体中已经包含BdUBQ启动子和BdUBQT终止子，产生中间克隆pBF067。使用引物SEQ ID NO 166 (BdUBQ PvuI F)和SEQ ID NO 167 (BdUBQT PacI R)扩增pBF067中完整的插入片段，经PVuI和PacI消化，随后连接至pUCAP或pBF012载体的I^acI位点，载体中在AscI-PacI位点处已经包含一个BdG0S2 驱动的突变NPTII筛选标签，分别得到质粒PBF108和pBF109。该NPTII突变基因常见于克隆载体。只有一个碱基对与野生型不同。
此表达盒位于pUCAP的I^acI-AscI位点，用于构建穿梭/轰炸载体PBF108，以及位于pBF012的I^acI-AscI位点用于构建双元载体raF109。
PBdUBQ—HP—Pv(251)PK 构建了一个表达盒插入到两个不同的载体骨架中，第一个是插入到pUCAP载体的 PacI-AscI位点，第二个是插入到pBF012载体的I3acI-AscI位点。柳枝稷的PK220基因中长 25Ibp的片段(Pv(251)PK220)被定义为SEQ ID NO 168，用不同的引物组合进行扩增=SEQ ID NO 169 (PvffET XbaI F)力口 SEQ ID NO 170 (PvffET BamHI R)以及 SEQ ID NO 169 (PvffET XbaI F)力口 SEQ ID NO 17l(PvWET ClaI R)。PCR产物经相应的限制性内切酶消化。因为关于PVWx内含子1序列的信息不存在，所以在本构建物中BdWx内含子1被用来作为间隔序列。该序列使用引物 SEQ ID NO 162 (bffx BamHI F)加 SEQ ID NO :163(bffx ClaI R)进行扩增并用相应的限制性内切酶消化。
三个片段连接到一起，插入到pUCAP载体的多克隆位点的^CbaI处，产生了两侧分别为方向相反的Pv 051) PK220靶序列包围的BdWx内含子1序列。因为没有可用的PvUBQ启动子序列，因此在本构建体中使用了 BdUBQ的启动子和终止子。该BdUBQ子含有一个内部的 BamH I 位点，因此，使用引物SEQ ID NO 172 (PvffET BamHI endl)禾口 SEQ ID NO 173 (PvffET BamHI end2)扩增RNAi结构盒，这会产生BamH I粘性末端而不需要消化。RNAi的BamH I 片段，然后连接至PUCAP的BamH I位点，载体中已经包含BdUBQ启动子和BdUBQT终止子，产生中间克隆 PBF152。使用引物 SEQ ID NO 166 (BdUBQ PvuI F)和 SEQ ID NO 167 (BdUBQT PacI R)扩增pBF152中完整的插入片段，经PVuI和I^acI消化，随后连接至pUCAP或pBFO 12 载体的PacI位点，载体中在Asc I-PacI位点处已经包含一个BdG0S2驱动的野生型NPTI，分别得到质粒pBF169和pBF170。
PsbUBQ—HP—Sb(261)PK 构建了一个表达盒插入到两个不同的载体骨架中，第一个是插入到pUCAP载体的 PacI-AscI位点，第二个是插入到pBF012载体的PacI-AscI位点。双色高粱H(220基因 (SbPK220)中长沈Ibp的片段(SbQ61)H(220)被定义为SEQ ID NO :174，用不同的引物组合进行扩增:SEQ ID NO 175 (SbffET XbaI F)加 SEQID NO 176 (SbffET BamHI R)以及 SEQ ID NO 175 (SbffET XbaI F)加 SEQ ID NO 177 (SbffET ClaI R)。PCR 产物经相应的限制性内切酶消化得到Sb(261)PK220片段。发夹间隔序列，Sbffx内含子1 (SEQ ID NO :178)，被扩增， 使用引物 SEQ ID NO 179 (SbffxBamHI)加 SEQ ID NO 180 (Sbffx ClaI R)，然后用相应的限制性内切酶消化。三个片段连接到一起，插入到PUCAP载体的多克隆位点的^CbaI处，产生了两侧分别为方向相反的SbTOT靶序列包围的Sbffx内含子1序列。使用引物SEQ ID NO 181 (SbffET BamHI end 1)和 SEQ ID NO 182 (SbffET BamHI end2)，通过 PCR 扩增在 RNAi 表达盒上加上BamH I粘性末端。RNAi的BamH I片段，然后连接至pUCAP的BamH I位点，载体中已经包含BdUBQ启动子和BdUBQT终止子，产生中间克隆pBF151。使用引物SEQ ID NO: 192 (SbUBQ PvuI F)和 SEQ ID NO :167 (BdUBQT PacI R)扩增 pBF151 中完整的插入片段， 经PVuI和I^acI消化，随后连接至pUCAP或pBF012载体的I^acI位点，载体中在AscI-PacI 位点处已经包含一个BdG0S2驱动的野生型NPTII，分别得到质粒pBF158和pBF171。
使用引物SEQID NO :184(SbG0S2 HindlII F)禾口 SEQ ID NO 185 (SbG0S2 HindlII R)，利用PCR扩增来自于高粱基因组序列中被鉴定为SbG0S2启动子的序列，G0S2启动子的一个IOOObp的片段，被确定SEQ ID NO 183，用PCR扩增并使用HindlII酶切位点克隆。
使用引物SEQID NO 187 (SbUBQ PstI F)禾口 SEQ ID NO 188 (SbUBQ PstI R)，利用 PCR扩增来自于高粱基因组序列中被鉴定为SbUBQ启动子的序列，UBQ启动子的一个IOOObp 的片段，被确定SEQ ID NO: 186，用PCR扩增并使用Pst I酶切位点克隆。
使用引物SEQ ID NO 190 (SbUBQT KpnI F)和 SEQ ID NO 191 (SbUBQT KpnI R)， 利用PCR扩增来自于高粱基因组序列中被鉴定为SbUBQ终止子的序列，UBQ终止子的一个 239bp的片段，被确定SEQ ID NO 189，用PCR扩增并使用Kpn I酶切位点克隆。
巨芒草(MgH(220)RNA 干扰 通过发夹策略设计用于下调的表达载体的构建可遵循同样的策略制定，如上所述。得到的构建体可能包含以下元件，一个BdG0S2-wtNPT11-BdUBQT筛选标签表达盒以及一个BdUBQ-(MgPK220发夹-RNAi表达盒)_BdUBQT，位于所选的载体中，例如pUCAP和 PBF012。
AtPK220启动子的分离和克隆 使用拟南芥(哥伦比亚生态型)基因组DNA为模板，用PCR的方法分离AtPK220 启动子。5'端引物，SEQ ID NO :119，依据相邻基因设计，3'端引物，SEQ ID N0:120，位于 AtPK220基因起始密码子ATG上游25bp处。将扩增产物用BamH I和Sma I消化，克隆至 PBllOl中。酶切消化片段，SEQ ID NO 14，长度为1510bp。得到的构建体命名为PAtPK22(1-GUS。
使用⑶S分析检测AtfK220启动子的活性 利用花朵浸渍法将PAtPK22(rGUS转化至拟南芥植物中，转基因植株进步至T3纯合性。收集T3开花植物的各种组织，包括幼苗，叶，茎，花，角果和根，在X-Gluc溶液中37°C过夜染色，用乙醇溶液脱色，在显微镜下检查。结果表明，AtPK220启动子主要在根组织的内皮层和周皮层细胞中表达，也在叶毛和萌发种子的种皮中有所发现。观察结果的重要意义在于，PAtPK220-GUS基因的表达是受到水分胁迫抑制的。
拟南芥AtfK220蛋白的亚细胞定位 在转基因拟南芥中表达一个全长野生型AtfK220-GFP用于测定天然蛋白的亚细胞定位。由引物对SEQ ID NO :109和SEQ ID NO :110扩增产生的片段用Sma I和BamH I 消化，得到一段含有AtfK220全长开放阅读框的片段，如SEQ ID NO 10所示，克隆至pEGAD 质粒的SmaI和BamHI位点，位于绿色荧光蛋白(GFP)下游，编码框相对应。此外，使用引物对SEQ ID NO :198和SEQ ID NO :199，扩增AtPK220编码序列，通过Age I酶切pEGAD质粒及扩增的AtPK220片段，将AtPK220插入GFP的上游，并与GFP编码框相对应。
将35S-GFP-AtPK220和35S_AtPK220_GFP构建体，转化至拟南芥植株中，纯合的转基因植株(根组织)被用于在荧光共焦显微镜下进行GFP信号的筛查。结果发现，沿细胞质膜检测到绿色荧光，这表明AtPK220蛋白是与根的细胞膜有关，并且AtfK220的功能可能是，作为对感知的受体激酶或环境信号传感器。
通过5'和3' RACE分离甘蓝型油菜的&JK220 为了从油菜中分离AtfK220的同源基因，利用AtfK220序列在NCBI核苷酸数据库 (nr/nt,est)以及TIGR(DFCI)甘蓝型油菜EST数据库中进行BLAST搜索(BlastN)。基于最高相似度的序列，设计一对引物，SEQ ID NO :122和SEQ ID NO 123，用来PCR扩增BnPK220 的一部分片段。使用甘蓝油菜叶片中分离的mRNA和基因组DNA作为这些扩增反应的模板。 通过PCR，以油菜基因组DNA为模板，得到一个约500bp的DNA片段。该PCR产物序列分析表明，它与AtPK220的核苷酸序列以及内含子组成方面具有高度同源性。
基于&ιΗ(220的部分序列，进行了 5'和3' RACE用来分离&ιΗ(220的全长cDNA。 对于3' RACE，使用正向引物SEQ ID NO 124，以及嵌套引物SEQ ID NO :125。对于5' RACE, 设计了向引物SEQ ID NO 126，以及嵌套引物SEQ ID N0:127。用于3' RACE或5' RACE 的RACE-ready cDNA是由甘蓝型油菜嫩叶片中分离的RNA制备的。
5' RACE产生的扩增DNA片段长度约为650bp ;3' RACE产生的约为Ikb大小。这两种RACE片段额序列分析表明，其与AtfK220具有高度的序列相似性。通过组合5' RACE、 部分BnPK220片段以及3' RACE产物，得到BnPK220序列的全长mRNA。
使用PCR 引物 SEQ ID NO :128 和 SEQ ID NO 129，通过 RT-PCR 方法扩增 BnPK220 的全长cDNA。该cDNA含有1302个核苷酸组成的开放阅读框(SEQ ID NO 25)，编码433个氨基酸的蛋白质(SEQ ID N0:26)。使用来自甘蓝型油菜的cDNA，进行RT-PCR扩增，得到另一个 BnPK220 的全长 cDNA。该 cDNA(SEQ ID N0:193)与 SEQ ID NO :25 的同源性为 98. 6%， 编码的蛋白质(SEQ ID NO 194)与SEQ ID NO 26的同源性为99. 3%0 利用5' RACE分离大豆的全长GmPK220 通过NCBI的EST数据库的BlastN分析检索，发现一个AtfK220的同源物，是大豆 (橹豆)的EST基因，登录号为CX709060. 1。根据这个同源物，从大豆EST数据库中检索到含有13个EST的单一基因簇。由这13个EST组成的一个重叠群，涵盖了大多数的基因序列。
通过该重叠群以及5' RACE和3' RACE结果的组合，确定了 GmPK220的全长序列(SEQ ID N0:41)。进行 5' RACE，引物 SEQ ID NO 130 用于首次 RACE PCR，引物 SEQ ID NO :131用于嵌套RACE PCR。进行3' RACE，引物SEQ ID NO :137用于首次RACE PCR，引物 SEQ ID NO :138用于嵌套RACE PCR。GmPK220编码的蛋白质如SEQ ID NO :42所示。
通过数据库检索分离0sPK220 (大米)序列 水稻基因组(Oryza sativa，粳稻品种)已经完全测序并公开提供。通过水稻EST 数据库的BLAST搜索以及基因组序列数据库的BLASTp搜索，确定了 AtPK220在水稻中的同源基因。具有最高得分的目的序列被确定为登录号0s05g0319700。
0s05g0319700 简称为 0sPK220，如 SEQ ID NO :59 所示，编码的蛋白质如 SEQ ID NO 60所示。
ZmPK220 (玉米)序列的分离 通过TIGR的EST数据库的BLAST搜索，发现了两个候选同源基因，一个是单一基因登录号TC333547，第二个登录号是C0439063。
登录号TC333547的长度为2125个核苷酸，包含一个1377个核苷酸的开放阅读框 (SEQ ID NO :77)，编码458个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO :78)。翻译的蛋白是全长的，比 AtPK220稍大。C-端激酶结构域与拟南芥和玉米的蛋白序列是高度保守的，然而，N-端序列的变数较多。
C0439063是一个简短的EST序列，缺少了 5 ‘端的序列。通过RACE方法获得缺失的序列。依据C0439063和AtPK220之间的对比校准，设计两个5 ‘ RACE引物。首次5 ‘ RACE 引物为SEQ ID NO :132和嵌套5' RACE引物为SEQ ID N0:133。同样进行3' RACE，引物 SEQ ID NO :139 用于首次 RACE PCR，引物 SEQ ID NO :140 用于嵌套 RACE PCR。基于 5，RACE 和3，RACE结果以及C0439063EST序列，组合得到ZmPK220(SEQ ID NO :79)序列。相应的蛋白质序列如SEQ ID NO 80所示。
序列分析表明，与TC333547相比，C0439063与水稻0sH(220有较高的序列相似性。
二穗短柄草(Bd)BdPK220序列的分离 短柄草是模式单子叶植物之一，主要用于功能基因组研究。从公共ESTs或GSk 组合得到重叠群，根据同源比对，它涵盖了 BdPK220的3'部分。根据重叠群设计引物 Bd8IRARl (SEQ ID NO 195)和 Bd81RAR2 (SEQ ID NO 196)，使用短柄草叶片的 cDNA 进行RACE反应，得到了约650bp的单一片段。将RACE序列和重叠群进行组合，得到了全长 BdPK220序列(SEQ ID NO : )，它编码一个461个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO :197)。
通过数据库检索确定(}SH(220 (棉花)序列 通过棉花(Gossypium) TIGR-EST数据库的BLAST搜索，确定了一个序列簇，定义登录号TC79117，其与AtPK220具有很高的相似性。这个序列簇具有有两个重叠的EST序列， TC79117在这里被称为(}SH(220，由1086个核苷酸的开放阅读框组成(SEQ ID NO :81)。最大的开放阅读框编码361个氨基酸的蛋白质(SEQ ID N0:82)。
在限水条件下，hwell6突变体耐旱表型的发现，以及在干旱和最适条件下具有高水分利用效率 两组植物生长(每个3英寸的盆5株，装有等量的无土栽培混合液)在最适条件的生长箱中(22°C，18hr光照，150uE，相对湿度70% )，直到开花的第一天(n = 6/项目/处理)。从第一朵花开，所有的植物提供相同数量的水(最优级)，但一组植物用于最适处理， 另一组用于干旱处理。在最适处理中，每天称量盆重，测定每日的水分损失，然后浇水回升到最适水平。在干旱处理中，每天称量盆重，测定水分损失，并允许干旱。在第0，2和4天收获干旱和最适处理条件下的植物，来进行芽苗生物量测定。与对照相比，在干旱条件下， 相对于芽苗干重，较低的水分损失表示耐旱的表型。在处理期间，累积的芽苗干重与水分损失的比率，提供了水分利用效率(WUE)的测定方法。植物hwell6推迟了 1至2天开花。在干旱条件下，hwell6的相对芽苗生物量的水损失值，明显比亲本对照低(22%)。这一结果表明，该突变体是耐旱的。另外还发现，在最适条件下，hwell6突变株的相对芽苗生物量的水损失值，同样明显比亲本对照低(41%)。这一结果与较高的水分利用效率的表型是一致的。效率的计算表明，在干旱(表1)和最适(表2)两种条件下，突变体hwell6水分利用更有效，因为它用较少的水积累了更多的芽苗生物量(干旱)，或同样的生物量而使用较少的水(最适)。
表1干旱条件下的水分利用效率(WUE)
权利要求
1.一种制备转基因植物的方法，包含使用载体来转化植物、植物组织培养物、或植物细胞，载体中含有一种核酸构建物能够抑制PK220基因的表达或活性，从而获得PK220表达或活性水平降低的植物、组织培养物或植物细胞。从植物组织培养物或植物细胞中培育或再生所述的植物，其中水分利用效率提高的植物被制备。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述的核酸构建体包含一个编码H(220多肽的核酸序列的反义序列。
3.根据权利要求1的方法，其中，所述的核酸构建体包含一个组成型启动子，诱导型启动子或组织特异性启动子。
4.根据权利要求3的方法，其中，组织特异性启动子是一个根启动子。
5.根据权利要求1的方法，其中核酸构建体包含长度至少为21个核苷酸的H(220序列或其互补序列。
6.由权利要求1-5中任一方法制备的植物。
7.—种转基因种子，由权利要求6所述的转基因植物制备，其中，所述的种子产生的植物具有相对于野生型植物增加的水分利用效率。
8.一种植物，该植物在H(220基因中具有一个非天然存在的突变，其中，所述的植物具有降低的PK220表达或活性，并且所述的植物相对于野生型对照，具有提高的水分利用效率。
9.一种种子，由权利要求8所述的转基因植物制备，其中，所述的种子产生的植物具有相对于野生型植物增加的水分利用效率。
全文摘要
本发明涉及通过对植物内部基因表达的操作，获得所需植物表型的方法。该方法涉及抑制PK220基因的表达水平或者活性的手段，相对于野生型对照植物，其中所需的表型例如水分利用率有所提高。本发明还涉及到核酸序列以及有用的构建物等方法，以及构建和分离具有降低的PK220表达或活性的植物的方法。
文档编号C12N15/82GK102203261SQ200980131323
公开日2011年9月28日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者万江欣, 黄雅凡, 杨书军, 蒙妮卡·库泽马 申请人:波夫曼斯种植公司