专利名称：糖化酶组合物及其糖化方法
糖化酶组合物及其糖化方法交叉引用本申请要求分别于2008年6月6日和2009年4月1日提交的美国临时专利申请 序列号61/059，535和61/165，856的优先权，此两篇专利申请均并入本文作为参考。序列表附上包括SEQ ID NOs :1_34的序列表，其全部内容并入本文作为参考。 发明领域本发明公开了，包含葡糖淀粉酶和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) α -淀粉酶 (AmyE)或其变体的组合物对例如由淀粉底物生产可发酵糖是有用的。本发明也公开了使用 葡糖淀粉酶和AmyE或其变体例如由淀粉生产乙醇的方法。
背景技术：
植物淀粉例如玉米淀粉广泛用于产品例如糖浆和生物燃料的工业制造中。例如， 高果糖玉米糖浆(HFCQ是玉米糖浆的加工形式，具有高果糖含量和与糖相当的甜度，这使 得HFCS可以作为代糖在软饮料和其他加工食品中使用。HFCS生产目前是十亿美元的工业。 类似地，从植物淀粉生产乙醇也是个快速扩张的产业。乙醇自身作为工业化学品、汽油添加 剂或液体燃料具有广泛的应用。乙醇作为燃料或燃料添加剂的用途明显减少空气排放，同 时保持或甚至提高发动机性能。另一方面，乙醇是可再生燃料，以至于其应用可减少对有限 的化石燃料源的依赖。此外，乙醇的使用可减少二氧化碳在大气中的净蓄积。糖浆和生物燃料可以通过催化淀粉分解成葡萄糖的酶促工艺由淀粉生产。该酶促 工艺一般涉及一系列酶催化的反应(1)液化α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)首先催化淀粉悬浮液降解为麦芽糖糊精， 所述淀粉悬浮液可以包含30-40% w/w干固形物(ds)。α-淀粉酶是内切水解酶，催化 内部a-l，4_D-糖苷键的随机断裂。因为液化一般在高温例如90-100°C进行，所以热 稳定的α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)的α-淀粉酶优选用于这 个步骤。目前用于这个步骤的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis) (AmyL)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)和嗜热脂肪地芽孢杆菌(GecAacillus stearothermophilus) (AmyS)的α -淀粉酶，不产生显著量的葡萄糖。相反，所得到的液化 物(Iiquefact)具有低葡萄糖当量(DE)，并且包含麦芽糖和具有高聚合度(DPn)的糖。(2)糖化葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α -淀粉酶催化在液化后形成的麦芽糖 糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。糖化作用产生富含葡萄 糖或高麦芽糖的糖浆。在前面一种情况下，葡糖淀粉酶一般在酸性条件下在升高的温 度，例如60°C，pH 4.3催化糖化。在这个过程中使用的葡糖淀粉酶一般得自真菌，例如 在OPTIDEX L400中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐质霉 (Humicolagrisea)葡糖淀粉酶。脱支酶例如支链淀粉酶可以帮助糖化作用。生麦芽糖α-淀粉酶可替代地可以催化糖化作用，以形成高麦芽糖糖浆。生麦芽糖α -淀粉酶一般具有比葡糖淀粉酶更高的最适PH和更低的最适温度，并且生麦芽糖淀粉 酶一般需要Ca2+。目前用于这种应用的生麦芽糖α-淀粉酶包括枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、 植物淀粉酶和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α -淀粉酶，CLARASE L的活性 组分。用于产生各种产物的示例性糖化反应描述如下
权利要求
1.用于糖化淀粉的组合物，其包含葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶为枯 草芽孢杆菌α -淀粉酶(AmyE)或AmyE变体，具有与SEQID NO 1有至少约80 %序列同一 性的氨基酸序列。
2.权利要求1的组合物，其中所述α-淀粉酶包含示于SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO :33 或 SEQ ID NO: 34 的氨基酸序列。
3.权利要求1的组合物，其中所述AmyE变体与具有SEQID NO :1的氨基酸序列的AmyE 相比具有一种或多种改变的性质。
4.权利要求3的组合物，其中所述一种或多种改变的性质是底物特异性、底物结合、 底物断裂模式、热稳定性、PH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化作用的稳定性、在较低 的钙离子(Ca2+)水平下的稳定性、比活性或其任意组合。
5.权利要求1的组合物，其还包括植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、 蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶或其任意组合。
6.加工淀粉的方法，其包括混合权利要求1的组合物达足以糖化所述淀粉的时间。
7.权利要求6的方法，其还包括生产高果糖玉米糖浆。
8.权利要求7的方法，其中高果糖玉米糖浆生产通过混合葡萄糖异构酶来实现。
9.权利要求6的方法，其还包括发酵所述淀粉以生产乙醇。
10.权利要求9的方法，其中同时进行糖化和发酵。
11.权利要求9的方法，其还包括回收乙醇。
12.权利要求9的方法，其还包括蒸馏所述淀粉以获得乙醇，其中发酵和蒸馏同时地、 分开地或相继地进行。
13.糖化淀粉的方法，其包括将葡糖淀粉酶和α-淀粉酶与寡糖或淀粉底物混合，其中 所述α -淀粉酶为枯草芽孢杆菌α -淀粉酶(AmyE)或AmyE变体，具有与SEQ ID NO 1有 至少约80%序列同一性的氨基酸序列。
14.权利要求13的方法，其中所述α-淀粉酶包含示于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32, SEQ ID N0:33，或 SEQ ID NO :34 的氨基酸序列。
15.权利要求13的方法，其中所述AmyE变体与具有SEQID NO :1的氨基酸序列的AmyE 相比具有一种或多种改变的性质。
16.权利要求15的方法，其中所述一种或多种改变的性质是底物特异性、底物结合、 底物断裂模式、热稳定性、PH/活性曲线、pH/稳定性曲线、针对氧化作用的稳定性、在较低 的钙离子(Ca2+)水平下的稳定性、比活性或其任意组合。
17.权利要求13的方法，其中所述葡糖淀粉酶以不高于每克干固形物0.11葡糖淀粉酶 单位(GAU/g ds)的量使用。
18.权利要求13的方法，其还包括将植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉 酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶或其任意组合与寡糖或淀粉 底物混合。
19.权利要求13的方法，其还包括生产高果糖玉米糖浆。
20.权利要求19的方法，其中高果糖玉米糖浆生产通过混合葡萄糖异构酶来实现。
21.权利要求13的方法，其还包括发酵所述淀粉以生产乙醇。
22.权利要求21的方法，其中同时进行糖化和发酵。
23.权利要求21的方法，其还包括回收乙醇。
24.权利要求21的方法，其还包括蒸馏所述淀粉以获得乙醇，其中发酵和蒸馏同时地、 分开地或相继地进行。
全文摘要
本发明涉及枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyE)或其变体。AmyE或其变体可用于更有效地由淀粉生产可发酵糖。本发明还公开了包含葡糖淀粉酶和AmyE或其变体的组合物及利用所述酶组合物加工淀粉的方法。
文档编号C12P7/00GK102112618SQ200980129999
公开日2011年6月29日 申请日期2009年6月4日 优先权日2008年6月6日
发明者J·K·舍蒂, S·H·李, S·布莱尼曼, V·夏尔马 申请人:丹尼斯科美国公司