专利名称：提高水稻光合固碳的方法
提高水稻光合固碳的方法
水稻(Oriza sativa)是全球种植的最重要谷物，是全世界约一半人口的主食。由 于世界人口的增长和全球可耕地需求压力的增大，需要不断提高土地的作物产量。因此，继 续需要新的提高作物生产力的解决办法，而作为最重要的谷物的水稻(rice)是此类解决 办法的一个主要目标作物。作物的产量受多种因素的影响，一方面是影响植物产生生物质能力(光合作用、 营养物和水摄取)的因素，另一方面是影响植物对抗某些应激状态，例如生命应激(昆虫、 真菌、病毒等)或非生命应激(干旱、含盐度)能力的因素。影响生物质产量的一个重要因素是光合作用。光合作用的机制是植物通过它捕获 大气二氧化碳将其转化成糖，然后掺入植物组织中产生生物质。大多数植物具有光合作用机制，其中叶绿体酶RuBisCo (核酮糖-1，5_ 二磷酸羧化 酶/加氧酶)是捕获二氧化碳将其转化成糖的主要酶。那些植物称为C3植物，水稻就是C3 植物。已知C3植物光合作用机制中的一个问题是固碳效率在某些环境条件下不是最优，此 时所固碳的一部分因RuBisCo的另一活性(称为氧合作用)而损失。RuBisCO能催化核酮糖-1，5-二磷酸的羧化和氧合。这两种活性之间的平衡主 要取决于叶片中的co2/o2比率，植物对某些环境条件反应后该比率可能改变。每次羧化反 应产生两分子的磷酸甘油酸进入卡尔文循环，最终形成淀粉和糖并产生核酮糖-1，5-二磷 酸。氧合反应产生一分子磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。后者通过光呼吸作用再循环产生磷酸 甘油酸(Leegood R. C.等，1995)。每产生两分子磷酸乙醇酸放出一分子CO2,导致净损失一 个固定碳，最终减少了产生的糖和生物质量。该反应中还损失了氨，需要叶绿体通过耗能反 应再固定。已有报道将克服光呼吸作用作为提升光合作用最大效率和提高生产力的目标 (Zhu等.，2008)，迄今已描述了为减少植物碳损失从而提高糖和生物质产量所作的多种尝 试。一些植物种类已获得一些有希望的结果，但迄今对于水稻尚无正面结果报道。Kebeish等报道了可在叶绿体中引入细菌的光呼吸作用底物乙醇酸盐分解代谢途 径来缓解拟南芥(Arabidopsis thaliana)的光呼吸损失(W003/100066 ；Kebeish R.等， 2007)。该作者先将大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇酸脱氢酶的3个亚基靶向(引 入)拟南芥叶绿体，然后引入大肠杆菌乙醛酸聚醛酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶 (tartronic semialdehyde reductase)从而完成了与内源性光呼吸途径相平行的将乙醇 酸转化成甘油酸的途径。这种利用5种大肠杆菌基因的逐步核转化可导致拟南芥植物叶绿 体乙醇酸直接转变为甘油酸。这些转基因植物生长较快，产生更多的嫩枝和根生物质，含有 更多的可溶性糖。在仅过表达乙醇酸脱氢酶此3个亚基的拟南芥植物中可见此作用但程度 较轻。另一策略是将C4-或C4-样途径或该途径的组分转移给C3植物。1996年，Gehlen J.等报道在最佳温度时，能表达谷氨酸棒状杆菌 (C. glutamicum)的PEPC(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因的转基因马铃薯其光合特征有所改变。
1999年，Ku等利用玉米PEPC将该方法应用于水稻。然而，在转基因水稻植物中， CO2的同化速度无显著改变，对植物生理学和生长性能仅有微弱影响，虽然检测到PEPC活性 水平升高达 100-倍(Matsuoka 等.，2001 ；也参见 EP-A 0 874 056)。另一项研究报道，过表达靶向水稻叶绿体的类黍尾稃草(Urochloapanicoides) 磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PCK)可导致诱生单个细胞内的内源性PEPC和建立C4-样循环。 然而，未观察到生长参数升高(Suzuki等.，2000 ；也参见WO 98/35030)。最近(2008)， Y. Taniguchi等将轮叶黑藻(Hydrillaver ticillata)的C4-样途径引入水稻植物的叶肉细 胞。产生了独自过表达或组合过表达4种C4酶，即磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、正磷酸双激酶 (orthophosphatedikinase)、NADP-苹果酸酶和NADP-苹果酸脱氢酶的不同转基因水稻植 物。发现所有4种酶组合过表达略微改善了光合作用，但同时导致转基因植物生长发生轻 微但可重现的发育障碍。因此，仍需要提高水稻固碳的有效方法，以刺激植物生长和/或提高生物质产量 和/或种子产量。本发明涉及提高水稻植物生物质产量和/或种子产量和/或固碳的方法，包括将 编码具有乙醇酸脱氢酶活性的一种或多种多肽的一种或多种核酸引入水稻植物细胞的基 因组，引入的所述一种或多种核酸可导致从头表达一种或多种具有乙醇酸脱氢酶活性的多 肽，而所述的一种或多种多肽定位于所产生的水稻植物的叶绿体中。就本发明而言，生物质产量是个体植物或种植植物地表面积所产生的物质量。可 检测几种参数以测定生物质产量是否提高。此类参数的例子有，植物高度、叶片面积、枝条 干重、根干重、种子数、种子重量、种子大小等。就该方面而言，种子产量或种子产率是生物 质产量的一种特定指标。可测定每个植物或种植植物土地单位表面积的种子产量或种子 产率。通常在土壤中生长确定时期后或在生长的特定阶段检测这些参数，例如在营养期结 束时，在用一种或多种本发明核酸转化的植物与未用一种或多种核酸转化的植物之间作比 较。可通过检测气体交换和叶绿素荧光参数来测定植物固碳的提高。一种方便的 方法是利用LI-6400系统(Li-Cor)和生产商提供的软件，可参见通过引用纳入本文的 R. Kebeish 等，2007 的描述。本发明方法所涉及的核酸编码具有乙醇酸脱氢酶活性的一种或多种多肽。可利用有机辅因子氧化乙醇酸形成乙醛酸来测定乙醇酸脱氢酶的活性，而且，例 如，植物过氧化物酶体中存在的乙醇酸氧化酶能利用分子氧作为辅因子并释放过氧化氢。根据辅因子性质的(不同)，乙醇酸脱氢酶和乙醇酸氧化酶之间如此明显的差异 并非总是这样，例如以前曾将gel操纵子编码的大肠杆菌乙醇酸脱氢酶称为乙醇酸氧化酶 (Bari 等.，2004)。可采用本申请实施例4描述的技术，按照Lord J. Μ. 1972检测乙醇酸脱氢酶的活性。或者，可对缺乏形成活性内源性乙醇酸脱氢酶3个亚基的大肠杆菌突变株进行互 补分析。这些大肠杆菌突变株不能利用乙醇酸作为唯一碳源生长。当这些缺陷型突变株的 某种酶过表达使该菌在含有乙醇酸作为唯一碳源的培养基上恢复生长时，则意味着该酶编 码大肠杆菌乙醇酸脱氢酶的功能等价物。互补分析的方法和工具可参见通过引用纳入本文的Bari等，2004中的描述。已鉴定到各种来源，包括细菌、藻类和植物的具有乙醇酸脱氢酶活性的多肽和编 码它们的核酸。表1 已知乙醇酸脱氢酶的例子
权利要求
1.一种提高水稻植物生物质产量和/或种子产量和/或固碳的方法，包括将编码具有 乙醇酸脱氢酶活性的一种或多种多肽的一种或多种核酸引入水稻植物细胞中，引入的所述 一种或多种核酸可导致从头表达具有乙醇酸脱氢酶活性的一种或多种多肽，所述的一种或 多种多肽定位于所产生的植物的叶绿体中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的一种或多种核酸被引入到水稻植物 细胞的核基因组中，所述的一种或多种核酸编码一种或多种多肽，这种多肽含有使所述多 肽靶向叶绿体的氨基酸片段。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种或多 种多肽衍生自大肠杆菌(E. c0li)glc操纵子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多肽包含与SEQID N0:2、4或6所示 序列至少有60%序列相同性的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸包含与SEQID ΝΟ:1、3或5所示 多核苷酸序列至少有60%序列相同性的多核苷酸序列。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述多肽是植 物乙醇酸脱氢酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述多肽是拟南 芥乙醇酸脱氢酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多肽包含与SEQID NO :8所示序列至 少有60%序列相同性的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述一种或多种核酸序列包含与SEQID NO 7所示多核苷酸序列至少有60%序列相同性的多核苷酸序列。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种或多种 多肽是藻类乙醇酸脱氢酶。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种或多 种多肽是衣藻属(Chlamydomonas)或集胞蓝细菌(Synechocystis)乙醇酸脱氢酶。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述一种或多种多肽包含与选自下组的 序列有至少60%序列相同性的氨基酸序列SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 16。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述一种或多种核酸序列包含与选自下 组的多核苷酸序列有至少60%序列相同性的多核苷酸序列SEQ ID NO=IUSEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :15ο
14.一种转基因水稻植物，其包含编码具有乙醇酸脱氢酶活性的一种或多种多肽的一 种或多种核酸，其中所述一种或多种多肽定位于所述水稻植物的叶绿体中。
15.如权利要求14所述的水稻植物，其特征在于，所述的一种或多种多肽各自含有使 所述多肽靶向叶绿体的氨基酸序列。
16.如权利要求14或15所述的水稻植物，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述 多肽衍生自大肠杆菌glc操纵子。
17.如权利要求16所述的水稻植物，其特征在于，所述多肽包含与SEQIDNO :2、4或6 所示序列至少有60%序列相同性的氨基酸序列。
18.如权利要求16所述的水稻植物，其特征在于，所述一种或多种核酸序列包含与SEQ ID NO :1、3或5所示多核苷酸序列至少有60%序列相同性的多核苷酸序列。
19.如权利要求14所述的水稻植物，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种 或多种多肽是植物乙醇酸脱氢酶。
20.如权利要求19所述的水稻植物，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种 或多种多肽是拟南芥乙醇酸脱氢酶。
21.如权利要求20所述的水稻植物，其特征在于，所述一种或多种多肽包含与SEQID NO 8所示序列至少有60%序列相同性的氨基酸序列。
22.如权利要求20所述的水稻植物，其特征在于，所述一种或多种核酸序列包含与SEQ ID NO 7所示DNA序列至少有60%序列相同性的多核苷酸序列。
23.如权利要求14所述的水稻植物，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种 或多种多肽是藻类乙醇酸脱氢酶。
24.如权利要求23所述的水稻植物，其特征在于，具有乙醇酸脱氢酶活性的所述一种 或多种多肽是衣藻属或集胞蓝细菌乙醇酸脱氢酶。
25.如权利要求24所述的水稻植物，其特征在于，所述一种或多种多肽包含与选自下 组的序列有至少60%序列相同性的氨基酸序列SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14和SEQ ID NO :16。
26.如权利要求24所述的水稻植物，其特征在于，所述一种或多种核酸序列包含与选 自下组的DNA序列有至少60%序列相同性的多核苷酸序列SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :1ο
27.水稻种子，其特征在于，该种子获自权利要求书14-26中任一项所述的转化植物。
28.通过加工权利要求27所述水稻种子获得的水稻谷物。
29.通过加工权利要求27所述水稻种子或权利要求28所述水稻谷物获得的粗粉。
30.从权利要求29所述粗粉获得的食品。
全文摘要
本发明涉及刺激植物生长和/或改善植物生物质产量和/或提高植物固碳的方法，包括将一种或多种核酸引入水稻植物细胞、水稻植物组织或水稻植物中，引入的一种或多种核酸可导致叶绿体从头表达具有乙醇酸脱氢酶活性的一种或多种多肽。
文档编号C12N15/82GK102105591SQ200980130462
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月30日 优先权日2008年8月1日
发明者C·彼得汉森尔, F·库扎勒, J·范瑞, M·梅兹拉夫, M·涅辛, R·柯贝希 申请人:拜耳生物科学股份有限公司