专利名称：免疫球蛋白编码核酸的测定的制作方法
免疫球蛋白编码核酸的测定本发明涉及免疫球蛋白编码核酸即RNA和DNA的测定方法，和用于免疫球蛋白编码核酸的PCR测定的引物。
背景技术：
目前的生物技术方法应用遗传工程改造的微生物以提供高产量的治疗多肽。在制备重组多肽特别是治疗免疫球蛋白中广泛使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。此细胞系能够提供翻译后修饰，最重要的，CHO细胞系能够将重组产生的多肽分泌至培养基， 使下游过程操作更加容易(Jiang, Ζ.，等人，Biotechnol. Prog. 22 (2006) 313-138 ；Yee, J. C.，等人，Biotechnol. Bioeng. 102(2009)246-263)。为了提高重组细胞系的生产率， 必须优化例如亲本细胞系、培养基或培养条件等参数Wee，J. C.，等人，Biotechnol. Bioeng. 102(2009)246-263)。基于对重组细胞系基因组中整合的异源核酸的位置、结构和拷贝数的分析，应当建立用于决定重组细胞系特性的指示物(Wurm，F. Μ.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 782 (1996)70-78).编码异源多肽的核酸以脱氧核糖核酸(DNA)整合至重组细胞系的基因组，在转录过程中其被转录为核糖核酸(RNA)。在翻译过程中RNA又作为模板用于蛋白质的生物合成。由于RNA对基因表达的重要性，对此核酸的分析非常重要(kth，G.，等人， Biotechnol Bioeng. 97(2007)933-951)。在WO 2008/094871中报导了选择高产细胞系的方法。Chusainow，J.，等人 (Biotechnol. Bioeng. 102(2009) 1182-1196)报导了制备单克隆抗体的CHO细胞系的研究。 Barnes, L. Μ.，等人(Biotechnol. Bioeng. 85(2004) 115-121)报导了在重组 NSO 骨髓瘤细胞中蛋白质稳定表达的预测指示物的分子定义。发明概述本发明的一个方面为使用聚合酶链式反应和绝对定量测定编码IgGl或IgG4亚类的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链的mRNA的量的方法，通过a)对免疫球蛋白轻链进行聚合酶链式反应，使用SEQ ID NO 23和M的引物和具有FAM染料的TaqMan水解探针类型(format)的SEQ ID NO 33的探针，和/或b)对免疫球蛋白重链进行聚合酶链式反应，使用SEQ ID NO 19和21的引物和具有Cy5染料的I1aqMan水解探针类型的SEQ ID NO 40的探针，和C)进行效率为2. 0的绝对定量。本发明的另一个方面为包含SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24禾口 SEQ IDNO :33的核酸的第一个试剂盒和包含SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :40的核酸的第二个试剂盒。另一个方面为SEQ ID而23，对和33或SEQ ID NO 19，21和40的核酸在聚合酶链式反应中的用途。本发明的另一个方面为测定异源多肽表达细胞生产率的方法，其包含按以下顺序的以下步骤-在已知生产率的细胞中测定编码所述异源多肽的mRNA的量，-在未知生产率的细胞中测定编码所述异源多肽的mRNA的量，
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-计算在所述未知生产率的细胞中和所述已知生产率的细胞中测定的编码所述异源多肽的mRNA量的比率，-将所述已知生产率细胞的生产率乘以所述计算的比率，由此测定异源多肽表达细胞的生产率。在一个实施方案中所述异源多肽为免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在另一个实施方案中对所述mRNA量的所述测定通过聚合酶链式反应(PCR)进行。在一个实施方案中mRNA量的测定通过使用SEQ ID NO 23和M的引物和具有FAM染料的TaqMan水解探针类型的SEQID NO :33的探针的聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO 19和21的引物和具有Cy5染料的I1aqMan水解探针类型的SEQ ID NO 40的探针的聚合酶链式反应。在另一个实施方案中编码所述异源免疫球蛋白的所述mRNA量为编码所述异源免疫球蛋白轻链的mRNA量和编码所述异源免疫球蛋白重链的mRNA量的平均值。在另一个实施方案中所述生产率为以Pg/细胞/天为单位的比生产率。在另一个实施方案中所述聚合酶链式反应为多重聚合酶链式反应。发明详述在本发明中发现编码免疫球蛋白的核酸(DNA)拷贝数和其产生的转录物(RNA)的量可用于测定表达异源免疫球蛋白的重组CHO细胞系的生产率。还发现编码异源多肽的 mRNA的量可用于测量所述细胞的比生产率。本发明包含测定免疫球蛋白表达细胞的生产率的方法，包含a)使用SEQ ID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应， 由此在已知生产率的细胞中测定编码免疫球蛋白的mRNA的量，b)使用SEQ ID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应， 由此在未知生产率的细胞中测定编码免疫球蛋白的mRNA的量，c)计算在未知生产率的细胞中和已知生产率的细胞中测定的编码免疫球蛋白的 mRNA量的比率，d)将已知生产率细胞的生产率乘以计算的比率，由此测定表达免疫球蛋白的细胞
的生产率。对实施本发明有用的本领域技术人员已知的方法和技术描述于例如Ausubel， F. Μ. ,He, Current Protocols in Molecular Biology，I 至 III 卷(1997)，Wiley 和 Sons ; Sambrook,等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。如本申请中使用的术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸组，其可直接或以前体形式由核酸编码。单独的氨基酸由3个核苷酸组成的核酸编码，称为密码子或碱基三联体。每个氨基酸由至少1个密码子编码。将不同密码子编码相同的氨基酸称为“遗传密码的简并”。如本申请中使用的术语“氨基酸”指天然存在的羧基α-氨基酸，包含丙氨酸(3字母编码ala，单字母编码A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(s er，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr,Y)和缬氨酸 (val, V)。在此申请中可互换使用的术语“核酸”或“核酸序列”指由单个核苷酸(又称碱基) A、C、G和T (或在RNA中为U)组成的聚合分子，例如DNA、RNA或其修饰物。此多核苷酸分子可为天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子，或一种或多种天然存在的多核苷酸分子和一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。此定义还包含下述天然存在的多核苷酸分子，其中一个或多个核苷酸被改变(例如通过突变)、缺失或添加。核酸可为分离的或整合至另一种核酸例如表达盒、质粒或细胞染色体中。本领域技术人员熟知将氨基酸序列例如多肽的氨基酸序列转化至对应的编码此氨基酸序列的核酸序列的程序和方法。因此，核酸的特征在于其由单个核苷酸组成的核酸序列，也在于由其编码的多肽的氨基酸序列。“多肽”是通过肽键连接的由氨基酸组成的聚合物，天然产生的或者是合成的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由2种或多种多肽组成的分子，或包含超过100 个氨基酸残基的多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽也可包含非氨基酸成分，例如糖基、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可通过表达多肽的细胞添加，并可随细胞种类而变。此处根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸定义多肽。一般不对添加物例如糖基进行特别说明， 但是可能存在。术语“免疫球蛋白”包含各种形式的免疫球蛋白结构，包括完整的免疫球蛋白和免疫球蛋白缀合物。在本发明中应用的免疫球蛋白在一个实施方案中为人抗体，或人源化抗体，或嵌合抗体，或T细胞抗原排除(Cbpleted)抗体(见例如WO 98/33523，WO 98/5四76和 WO 00/34317)。免疫球蛋白的遗传工程改造描述于例如Morrison，S. L.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5，204，244 ；Riechmann, L.，等人， Nature 332(1988)323-327 ；Neuberger, M. S.，等人，Nature 314(1985)268-270 ；Lonberg, N. ,Nat. Biotechnol. 23(2005) 1117-1125。免疫球蛋白可以各种类型存在，包括例如Fv，Fab 和 F(ab)2 以及单链(scFv)或双抗体(例如 Huston, J. S.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. Ε.，等人，Science 242(1988)423-426 ；in general, Hood 等人’ Immunology, Benjamin N. Y.,第二版(1984)；和 HunkapiIler, Τ.和 Hood, L. , Nature 323(1986)15-16)。术语“完整的免疫球蛋白”指包含2条名为轻链和2条名为重链的免疫球蛋白。完整的免疫球蛋白的各重链和轻链包含可变结构域(可变区)(一般为多肽链的N端部分)， 其包含能够与抗原相互作用的结合区。完整的免疫球蛋白的各重链和轻链包含恒定区(一般为C端部分)。重链的恒定区介导抗体结合至i)具有Fc γ受体(Fe y R)的细胞，例如吞噬细胞，或ii)具有新生Fc受体(Fcfoi)又称Brambell受体的细胞。其也介导抗体与一些因子包括经典补体系统例如成分(Clq)因子的结合。免疫球蛋白轻链和重链的可变结构域依次包含不同的区段，即4个框架区(FR)和3个高变区(CDR)。术语“免疫球蛋白缀合物”指包含经肽键与其他多肽缀合的免疫球蛋白重链或轻链的至少1个结构域的多肽。其他多肽为非免疫球蛋白肽，例如激素，或生长受体，或抗融合肽，或补体因子，等等。示例免疫球蛋白缀合物在WO 2007/04M63中报导。术语“异源免疫球蛋白”指哺乳动物细胞或宿主细胞不天然产生的免疫球蛋白。根据本发明的方法产生的免疫球蛋白通过重组方法产生。这些方法在本领域内是众所周知的，包含在真核细胞中表达蛋白质，之后回收和分离异源免疫球蛋白，通常纯化至可药用的纯度。为了产生即表达免疫球蛋白，通过标准方法将编码轻链的核酸和编码重链的核酸分别插入表达盒。使用传统程序可容易的分离和测序编码免疫球蛋白轻链和重链的核酸。杂交瘤细胞可作为所述核酸的来源。可将表达盒插入表达质粒，之后将表达质粒转染至宿主细胞，否则宿主细胞不会产生免疫球蛋白。在合适的原核或真核宿主细胞中进行表达，从裂解后的细胞或培养上清中回收免疫球蛋白。“分离的多肽”为基本不含污染的细胞成分的多肽，所述细胞成分例如糖、脂或其他天然与多肽关联的蛋白质杂质。一般的，分离多肽制品包含高纯度形式的多肽，即至少约 80 %纯，至少约90 %纯，至少约95 %纯，高于95 %纯，或高于99 %纯。显示特定蛋白质制剂含有分离多肽的方法是在蛋白质制剂的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色之后出现单一条带。然而，术语“分离的”不排除相同的多肽以另一种物理形式存在，例如二聚体或另外的糖基化或衍生形式。“异源DNA”或“异源多肽”指在给定的宿主细胞中不天然存在的DNA分子，或多肽，或DNA分子群或多肽群。对特定宿主细胞为异源的DNA分子可包括宿主细胞物种来源的DNA(即内源DNA)，只要宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)结合。例如，认为下述DNA 分子为异源DNA分子，其包含与含有启动子的宿主DNA区段有效连接的编码多肽的非宿主 DNA区段。相反的，异源DNA分子可包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。由非宿主 DNA分子编码的肽或多肽为“异源”肽或多肽。术语“细胞”或“宿主细胞”指可将核酸，例如编码异源多肽的核酸，转染至其中的细胞。术语“细胞”包括用于增殖质粒的原核细胞和用于表达核酸和产生编码的多肽的真核细胞二者。在一个实施方案中，真核细胞为哺乳动物细胞。在另一个实施方案中哺乳动物细胞为CHO细胞，优选CHOKl细胞(ATCC CCL-61或DSM ACC 110)，或CHO DG44细胞(又称 CHO-DHFR[-]，DSM ACC 126)，或 CHO XL99 细胞，CHO-T 细胞(见例如 Morgan, D.，等人， Biochemistry 洸(1987)四59_2963)，或 CH0-S 细胞，或 Super-CHO细胞(Pak, S. C. 0.，等人， Cytotechnology. 22 (1996) 139-146)。如果这些细胞不适应在无血清培养基中或在悬浮中生长，在用于本发明的方法前需要进行适应。如此处使用的，措辞“细胞”包括所述细胞和其后代。因此，词语“转化体”或“转化细胞”包括原代所述细胞和以其为来源的培养物，不考虑转移或继代培养的次数。还应理解，由于故意或非故意突变，所有后代可能在DNA含量上不完全相同。也包括与筛选的原始转化细胞具有相同功能或生物学活性的变体后代。如此处使用的术语“表达”指在细胞中发生的转录和翻译过程。在细胞中目的核酸序列的转录水平可基于细胞中存在的对应mRNA的量进行测定。例如，从目的序列转录的 mRNA可通过RT-PCR或通过Northern杂交(见上面的Sambrook，等人，1989)定量。目的核酸编码的多肽可通过多种方法定量，例如通过ELISA，通过测定多肽的生物学活性，或通过应用不依赖这些活性的试验，例如蛋白质印迹或放射性免疫测定，使用识别并结合至多肽的免疫球蛋白(见上面的Sambrook，等人，1989)。基因的表达通过瞬时或永久表达进行。目的多肽一般为分泌的多肽，因此包含 N-端延伸(又称信号序列)，其对多肽通过细胞壁进入细胞外培养基的运输/分泌是必需的。一般来说，信号序列可来自任意编码分泌多肽的基因。如果使用异源信号序列，优选的
7其被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)。例如用于在酵母中的分泌，可使用来自分泌基因的同源酵母信号序列替换待表达的异源基因的天然信号序列，所述酵母信号序列例如酵母转化酶信号序列、α-因子前导序列(包括酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属和汉森氏酵母属的α-因子前导序列，在US 5,010, 182中描述了第二个)，酸性磷酸酶信号序列或白色念珠菌(C. albicans)葡糖淀粉酶信号序列(见EP 0 362 179)。在哺乳动物细胞表达中，目的蛋白质的天然信号序列是符合要求的，但是其他哺乳动物信号序列可为合适的， 例如相同或相关物种的分泌多肽，例如人或鼠来源的免疫球蛋白的信号序列，以及病毒分泌信号序列，例如单纯疱疹病毒糖蛋白D信号序列。编码前区段的DNA片段依读框的，即有效连接至编码目的多肽的DNA片段。根据本发明方法的例如CHO细胞的转染通过转染和选择的相继步骤进行。根据本发明方法的合适的CHO细胞为例如CHO Kl细胞，或CHO DG44细胞，或CHO XL99细胞， 或CHO DXBll细胞，或CHO DP12细胞，或super-CHO细胞。在本发明的范围内，转染的细胞可使用本领域已知的基本上任意类型的转染方法得到。例如，通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞。可选的，可使用脂质体转染试剂例如FuGENE 6 (Roche DiagnosticsGmbH, Germany), X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH, Germany),LipofectAmine(Invitrogen Corp.，USA)，和核转染(ΑΜΑΧΑ Corp)。可选的，使用基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴随病毒的合适的病毒载体系统将核酸引入细胞(Singer，0.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(2004)5313-5314)。通常DNA或RNA水平的基因表达谱通过多步骤程序在常规基础上监测。首先，从培养容器中移除各个细胞样品。在粘附细胞的情况下，可通过胰酶消化(用胰酶-EDTA溶液处理)帮助收集以将粘附细胞从固体支持物上分离。其次，将收集的细胞沉淀并进行细胞裂解。第三步通常需要至少部分纯化样品中的总RNA、mRNA或DNA(例如见EP 0389063)。 之后，如果需要，使用RNA依赖性DNA聚合酶例如AMV或MoMULV逆转录酶(Roche Applied Science, Germany)进行第一链cDNA合成的步骤。之后，通过定量PCR (Sanger，G. and Goldstein, C.，Biochemica 3(2001) 15-17) 或通过扩增和之后在DNA微阵列上的杂交(Kawasaki，Ε. S.，Ann. N. Y. Acad. Sci. 1020(2004)92-100)定量DNA或生成的cDNA的量。在聚合酶链式反应(PCR)的情况下， 可进行一步RT-PCR，其特征在于第一链cDNA合成和之后的扩增由相同的聚合酶例如T. th 聚合酶(Roche Applied Science Cat. No. 11 480 014, Germany)催化。在一个实施方案中基因表达分析基于实时PCR。所述实时监测的特征在于实时监测和定量PCR反应中核酸的扩增进展。不同的检测类型是本领域已知的。下述检测类型已被证明对PCR有用，因此为基因表达分析提供了简单和直接的可能性。a) TaqMan水解探针类型单链杂交探针用2种成分标记。根据荧光共振能量转移原理，当合适波长的光激发第一种成分时，将吸收的能量转移至第二种成分，即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤，杂交探针与靶DNA结合并在之后的延伸期被Taq聚合酶的5’ _3’外切酶活性降解。 结果激发的荧光成分和猝灭剂在空间上彼此分离，因此可以测量第一种成分的荧光发射。 在 US5, 210，015，US 5，538，848 和 US 5，487，972 中详细报导了 TaqMan 探针试验。在 US 5，804，375中报导了 TaqMan杂交探针和试剂混合物。
b)分子信标这些杂交探针用荧光成分和猝灭剂标记，标记物优选的位于探针的两端。因为探针的二级结构，在溶液中两种成分在空间上接近。在与靶核酸杂交后两种成分彼此分离，从而在用合适波长的光激发后，可以测量第一种成分的荧光发射(US 5，118，801)。c) FRET 杂交探针FRET杂交探针检测类型对所有种类的同源杂交试验特别有效(Matthews，J. Α.和 Kricka,L. J.，Anal. Biochem. 169(1988) 1-25)。其特征在于同时使用2种单链杂交探针，所述探针与扩增靶核酸同一条链的相邻位点互补。两种探针用不同的荧光成分标记。当两种杂交探针与待检测靶分子的相邻位置结合时，在合适波长的光激发下，根据荧光共振能量转移(FRET)原理第一种成分将吸收的能量转移至第二种成分从而可测量第二种成分的荧光发射。除了监测FRET接受体成分的荧光增加以外，也可以监测FRET供体成分的荧光降低作为杂交事件的定量测量。特别的，FRET杂交探针类型可用于实时PCR以检测扩增的靶DNA。在实时 PCR领域已知的所有检测类型中，已证明FRET-杂交探针类型是高度敏感、准确和可信的(见 WO 97/46707 ；WO 97/46712 ；WO 97/46714)。除了 2 种 FRET 杂交探针以外， 也可以使用荧光标记的引物和单个标记的寡核苷酸探针(Bernard，P. S.，等人，Anal. Biochem. 255(1998) 101-107)。其中可任意选择用FRET供体或FRET接受体化合物标记引物。d) SYBR Green 类型如果实时PCR在添加剂存在下进行，其中使用双链核酸结合基团检测扩增产物， 也属于本发明的范围内。例如，根据本发明可通过荧光DNA结合染料检测各扩增产物，在与双链核酸相互作用后，所述染料在合适波长的光激发下发射对应的荧光信号。已证明染料 SYBR Green I 和SYBR Gold (Molecular Probes，USA)特别适用于此应用。可选的可使用嵌入染料。然而，在此类型中为了区分不同的扩增产物，必须进行各自的解链曲线分析 (US 6，174，670)。e)多重类型将在一个反应容器中同时测定不同的核酸称为多重实时PCR。一般来说为了测定各个核酸，需要荧光染料不干扰其他使用的染料或与其他使用的染料仅少量重叠。在本发明中使用的PCR引物也是本发明的方面，所述引物使用软件eprimerf设计，根据以下参数-与待扩增序列的特异性结合，-不形成或不大可能形成引物二聚体，-长度在18和25个核苷酸之间，-G/C 含量约 50%，-解链温度约60°C，-扩增子为500碱基对或更短，在一个实施方案中在100和260碱基对之间，-优选的引物应与相邻的外显子结合，PCR产物应跨越至少一个内含子以区分基因组DNA和cDNA的扩增。与设计的引物互补的核酸位于在IgGl和IgG4型免疫球蛋白中相同的免疫球蛋白重链和轻链的恒定区内。在方法中使用的探针也是本发明的一个方面，所述探针使用软件eprimerf设计， 根据以下参数-解链温度约70°C，-在5'端没有G，-与引物或其他探针不形成或不大可能形成二聚体，-优选的计划用于RT-PCR的探针应与2个不同的相邻外显子结合以区分基因组 DNA和cDNA的扩增。在一个实施方案中与设计的引物互补的核酸位于在IgGl和IgG4型免疫球蛋白中相同的免疫球蛋白重链和轻链的恒定区内。探针按如下标记以用于多重RT-PCR反应-轻链荧光染料FAM，在465nm激发，在5IOnm检测，-参考基因YakimaYellow染料，在533nm激发，在580nm检测，-重链荧光染料IRD700或Cy5，在618nm激发，在660nm检测。设计了表1中所列的引物和探针，单独或组合作为本发明的一个方面。表1:引物和探针。
#弓丨物/探针序列(5’-3')x-merTm [ ]SEQ ID NO:37CAGGAGAGTGTCACAGAGC1958.81338CTCTTTGTGACGGGCGAG1858.21462CTCCCTCAGCAGCGTGGTG1963.11563GCTCACGTCCACCACCAC1860.51664GCATTATGCACCTCCACGC1958.81765GCGGCTTTGTCTTGGCATTAT2157.91866GCGTCCTCACCGTCCTGC1862.81967CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG2360.62068CCATTGCTCTCCCACTCCAC2161.421131CTGTTGTGTGCCTGCTGAAT205822132GACTTCGCAGGCGTAGACTT206023133TCACAGAGCAGGACAGCAAG206024134TGCTTTGCTCAGCGTCAG185625139CTGGAACTGCCTCTGTTGTG206026145TGACGCTGAGCAAAGCAGAC206027146CAGGCCCTGATGGGTGAC186128147(FAM)-ACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGA-(TAMRA)287029148CAAAGGCACAGTCAAGGCTGAGAA246530
权利要求
1.测定mRNA量的方法，包含a)提供样品，b)使用SEQID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或c)使用SEQID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应，和d)用2.0的效率定量。
2.测定表达免疫球蛋白的细胞的生产率的方法，包含a)提供未知生产率的细胞和已知生产率的细胞，b)对已知生产率的所述细胞RNA使用SEQID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO: 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应，由此在已知生产率的细胞中测定编码所述免疫球蛋白的mRNA的量，c)对未知生产率的所述细胞RNA使用SEQID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针进行聚合酶链式反应，和/或使用SEQ ID NO: 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针进行聚合酶链式反应，由此在未知生产率的细胞中测定编码所述免疫球蛋白的mRNA的量，d)计算在未知生产率的所述细胞中和已知生产率的所述细胞中测定的编码所述免疫球蛋白的mRNA量的比率，e)将已知生产率的所述细胞的生产率乘以所述计算出的比率，由此确定表达免疫球蛋白的细胞的生产率。
3.选择制备免疫球蛋白的细胞的方法，包含a)提供细胞，b)分离所述细胞的RNA，c)使用SEQID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应，d)使用SEQID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针对分离的RNA进行聚合酶链式反应，e)如果在步骤c)和d)中得到聚合酶链式反应产物，则将细胞选择为制备免疫球蛋白的细胞。
4.选择制备免疫球蛋白的细胞的方法，包含a)提供多种细胞，b)分离各所述细胞的RNA，c)使用SEQID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针对各分离的RNA分别进行聚合酶链式反应，d)使用SEQID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针对各分离的RNA分别进行聚合酶链式反应，e)基于在步骤c)和d)中形成的聚合酶链式反应产物的量，选择细胞作为制备免疫球蛋白的细胞。
5.制备免疫球蛋白的方法，包含a)提供多种细胞，b)分离各所述细胞的RNA，c)使用SEQID NO 23和M的引物和SEQ ID NO 33的探针对各分离的RNA进行聚合酶链式反应，d)使用SEQID NO 19和21的引物和SEQ ID NO 40的探针对各分离的RNA进行聚合酶链式反应，e)基于在步骤c)和/或d)中形成的聚合酶链式反应产物的量选择细胞，f)培养选择的细胞，g)将免疫球蛋白从细胞或培养基中回收，由此制备免疫球蛋白。
6.根据权利要求4或5的方法，其特征在于选择在步骤d)中具有最高聚合酶链式反应产物量的细胞。
7.根据权利要求3至6中任一项的方法，其特征在于提供的单种细胞或多种细胞已转染了编码免疫球蛋白的核酸。
8.根据权利要求2的方法，其特征在于用因子0.925乘以所述比率。
9.根据前面权利要求中任一项的方法，其特征在于聚合酶链式反应为TaqMan水解探针类型。
10.根据前面权利要求中任一项的方法，其特征在于SEQID而23和对的引物用于免疫球蛋白轻链，SEQ ID NO 19和20的引物用于免疫球蛋白重链。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于所述轻链引物用染料FAM标记，重链引物用染料Cy5标记。
12.根据前面权利要求中任一项的方法，其特征在于进行聚合酶链式反应的步骤另外包含实时测量扩增的核酸以测定扩增的核酸量。
13.根据前面权利要求中任一项的方法，其特征在于所述聚合酶链式反应为逆转录酶聚合酶链式反应。
14.试剂盒，其包含a)SEQ ID NO :23 的核酸，b)SEQID NO 24 的核酸，和c)SEQ ID NO 33 的核酸。
15.试剂盒，其包含a)SEQ ID NO :19 的核酸，b)SEQID NO :21 的核酸，和c)SEQ ID NO 40 的核酸。
16.SEQ ID NO :23，M和33的核酸或SEQ ID NO :19，21和40的核酸在聚合酶链式反应中的用途。
全文摘要
本发明报导了测定编码免疫球蛋白的mRNA量的方法，包含a)提供样品，b)使用SEQ ID NO23和24的引物和SEQ ID NO33的探针进行聚合酶链式反应扩增轻链，和/或c)使用SEQ ID NO19和21的引物和SEQ ID NO40的探针进行聚合酶链式反应扩增重链，和d)用2.0的效率定量。具有SEQ ID NO 23和24的引物分别结合在CL 247-266和CL166-185的位置，具有SEQ ID NO33的探针结合在人IgG 链的189-212。SEQ IDNO19的引物结合在CH 2区220-237位，SEQ ID NO21的引物结合在CH 3区114-133位。最后，SEQ ID NO40的引物结合在从CH2的315位到CH3的7位。
文档编号C12Q1/68GK102203286SQ200980142092
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月21日 优先权日2008年10月23日
发明者A·奥斯特勒纳尔, M·延奇, U·格普费特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司