对hsp90-抑制剂的易感性的制作方法

专利名称：对hsp90-抑制剂的易感性的制作方法
对HSP90-抑制剂的易感性本项发明涉及一种挑选对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或者培养细胞的方法。另外还描述了一种测定哺乳动物的肿瘤细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂治疗的反应情况的方法。尤其是，本项发明提供了一种体外诊断方法以筛选出那些对HSP90抑制剂具有易感性的患者，其中包括应用可以用于检测KRAS基因中激活性突变的寡核苷酸或者多聚核苷酸。本项发明还涉及对一种癌症的疗效进行检测评估或监测的方法，此类癌症以 KRAS基因中至少出现一处激酶激活性突变为特征，也可能但非必须在EGFR和/或者BRAF 基因中也至少出现一处激活性突变。此外，还介绍了一种对癌症尤其是具有上述基因突变特征的癌症的疗效进行预测的方法。最后，应用具有上述基因突变特征的(转基因)非人类动物模型或者(转基因)细胞模型对抗癌药物进行筛选和/或者验证，并提供了一套可以实现上述各种检测功能的试剂盒。现阶段，人们正试图对各种主要癌症类型的基因组进行完全注释标记，而这正与 “人类基因组计划”的工作有所关联；因此在不久的将来，分析体细胞的基因拷贝数变化和与癌症有关的基因突变(这里两者统称为病变)可以为我们提供与人类癌症相关的遗传图谱。在治疗遗传学定义的肿瘤方面，分子靶向的治疗方法已经取得了不少成功以ERBB2/ Her2基因为靶点的曲妥珠单抗可以缩小因ERBB2基因扩增而罹患乳腺癌的妇女体内的肿瘤(Slamon等，2001)；在携带BCR/ABL转位的慢性粒细胞白血病患者(Druker等，2001a ； Druker等，2001b)和带有KIT基因突变或者PDGFRA基因突变(Heinrich等，200 的胃肠道间质瘤和黑色素瘤患者(见Hodi等，NEJM，2008)体内，ABL/KIT/PDGFR基因抑制剂伊马替尼可以诱导有效的药物反应；最后，由EGFR基因突变导致的肺癌对EGFR基因抑制剂吉非替尼和埃罗替尼具有高度敏感性(Lynch等，2004 ；I3aez等，2004 ；Pao等，2004)；这些成功的例子足以说明前述遗传标记工作在临床治疗方面的意义。在绝大多数情况下，此类抑制剂的疗效都是在临床试验完成后被发现的，然而目前尚无固定的机制可以依循，于是人们无法在对患者进行临床试验之前系统性地鉴定出导致特定原癌基因依赖性的“损伤”。另一方面，靶点导向疗法常常依赖于某个癌基因激活的信号通路，因此被认为与癌症当中发生的体细胞遗传背景改变(损伤)具有因果效应。然而，目前还没有办法可以系统性地将此类“损伤”与治疗靶点联系起来。K-Ras蛋白是一个与细胞分裂调节有关的GTP酶。携带KRAS基因突变的癌症患者(例如，非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤、肉瘤等)不仅预后发展很差，而且生存率极低。由于无法有效地治疗这些病症，鉴定出携带KRAS基因突变的肿瘤/肿瘤细胞对之具有易感性的药物/化合物便成了当务之急， 尤其是迫切需要在临床试验开始/完成之前鉴定出来以避免用人体试验。本说明所说的 “KRAS”指的是K-Ras、k-ras以及类似的字母组合，并且它们都被作为同义词使用。然而， “KRAS”多数情况下是指编码K-feis GTP酶的基因，而词组“K-ras”、“K-feiS”或者“K-RAS” 多数情况下是指该基因编码的蛋白。为了鉴定携带上述KRAS基因突变的肿瘤/肿瘤细胞对之具有易感性的药物/化合物，相应的癌细胞系经常被用在鉴定试验当中；但是这些广为使用的细胞模型其可靠性
5和临床适用性受到了一些质疑。另外，细胞系的遗传背景不稳定并且经常发生改变，因此对各种原发肿瘤的代表性可能会差一些。再一点，组织病理学定义的各类肿瘤其遗传多样性通常较为复杂；例如临床诊断的肿瘤“非小细胞肺癌”(NSCLC)包括携带EGFR基因或者KRAS 基因突变的肺腺癌和携带KRAS基因突变的鳞状上皮细胞肺癌。因此，任何一个代表性的临床前模型都需要把握原发肿瘤病变的本质以及这些病变在以组织病理学定义的人群里的分布。最近有文献报道证明了癌细胞系在临床前药物靶点验证试验中的作用(Lin等， 2008 ；McDermott等，2007 ；Neve等，2006 ；Solit等，2006)。但是，这些研究均有不足之处， 它们或者使用了多个肿瘤来源的癌细胞系(Solit等，2006)，或者只着力于对癌细胞系进行大尺度上的基因组分析(Lin等，2008)，又或者仅仅通过建立高通量细胞系谱来寻找对肿瘤抑制剂具有强烈易感性的细胞系而忽视了对细胞系进行基因组分析(McDermott等， 2007)。另一方面，由于具有抗癌作用的化合物/药物往往只能在临床试验结束后才能被鉴定出来，因此不仅费时，而且成本很高。同时，一个特定的肿瘤体(例如“肺癌”)可能是由具有不同遗传谱和/或者转录谱特征的多种肿瘤组成；所以，即便是“同一个”肿瘤(来自同一个肿瘤体的不同肿瘤，例如肺癌)也不一定能用同一种药物/化合物进行治疗。因此， 找出特定类型的肿瘤对特定药物/化合物的易感性的“标记”或者“预测器”，将会使患有同一种癌症的更多患者从中受益。因此，本项发明所要解决的技术问题在于提供用于评价细胞尤其是肿瘤细胞对于抗肿瘤治疗的敏感性和反应性的手段和方法。此技术问题在权利要求书的实施方案中得到解决。因此，本项发明涉及一种挑选对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或者培养细胞的方法，主要步骤有(a)在待检测细胞、组织或者培养细胞中确认至少存在一处KRAS 基因突变；(b)挑选出这些携带有至少一处KRAS基因突变的细胞、组织或者培养细胞。本方法还可以包括其他步骤(i)用HSP90抑制剂接触待测细胞、组织或者培养细胞；(ii)检测这些接触了 HSP90抑制剂的细胞、组织或者培养细胞的存活率。需要注意的是，步骤(i) 和(ii)可以在步骤(a)之前进行，也可以在步骤(a)之后或者步骤(b)之后进行。以上步骤(i)和(ii)尤其可作为证明挑选出的携带有KRAS基因突变的细胞、组织或者培养细胞在存活率上对HSP90抑制剂具有易感性的进一步实验证据。这些KRAS基因突变最好是“激活性基因突变“。本文所指的“细胞、组织和培养细胞”不仅限于分离的细胞、组织和培养细胞，也包括使用的各种样品，亦即由含有这些细胞、组织或者培养细胞的液体所构成的生物学的、医学的或者病理学的液体样品。另外，此种样品液体可能是体液或者排出物，也可以是一种培养物，例如取自细胞培养或者组织培养的培养基。体液可以包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、关节液、脊髓液、脑脊液、泪液、粪便以及其他类似物但不仅限于以上各项。因此，本项发明的关键点在于提供一种测定特定的细胞、组织或者组织细胞(或者培养细胞或者培养细胞中的单个细胞，或者如下所述来自某一生物学/医学/病理学样品的细胞)对于HSP90抑制剂抗癌或抗增生处理的敏感性的方法。正如在附加例子中所描述的，我们很意外地发现，在KRAS基因中带有一处激活性突变的细胞对HSP90抑制剂的处理格外敏感。同时，我们的在体实验例子也表明HSP90抑制剂能成功地用于治疗与KRAS基
6因相关的或者由其引发的癌症，例如KRAS基因驱动的肺腺癌，即在KRAS基因中带有一处激活性突变的癌症。所以，本项发明不仅解决了挑选出对HSP90抑制剂具有易感性的细胞/组织/培养细胞的问题，还提供了一种方法来评估一个患病的人或者动物个体在用HSP90抑制剂进行抗癌或者抗增生治疗时可能的药物反应。本项发明不仅为挑选出对HSP90抑制剂处理具有易感性的细胞、组织和培养细胞提供了可能性(也就是说，本项发明所使用的研究手段可以用于新型HSP90抑制剂的性能测试，或者用于筛选与HSP90抑制剂具有相同功能的其他化合物)，也可以用于评价HSP90抑制剂疗法对一个需要治疗和预防增生性疾病的特定 (人类)患者是否有效。在最优化方案中，患者对以下几种HSP90抑制剂的药物反应得到了检测格尔德霉素(geldanamycin)或者其衍生物，尤其是17-AAG或者IPI-504。这些连同其他一些可以被检测的HSP90抑制剂将在后文给予详细说明。在挑选出对HSP90抑制剂有响应性的细胞或者患者的过程中，需要先找出在KRAS 基因中至少带有一处突变的细胞、组织或者培养细胞。这些细胞/组织可以取自某一人的样品或者是含有至少一个这样的细胞(例如癌细胞)的体液样品；如这样的细胞、组织或者培养细胞中KRAS基因含有激活性突变，则表明此细胞、组织或者培养细胞对HSP90抑制剂有易感性，即能够被HSP90抑制剂有效地杀死。这里所说的“激活性突变”是指某一基因 (尤其是KRAS基因)中的一处突变，而这个突变导致了该基因的相应产物、也就是蛋白(尤其是KRAS蛋白)的活性提高。检测蛋白尤其是KRAS蛋白(提高的)活性的方法在相关技术领域中已广为人知，后文也将予以阐述。另外，后文还将介绍KRAS基因中典型的(激活性)突变；再重复一次，本发明的方法中优先使用“(激活性)突变”。正如上文以及备选实施方案所指的，本项发明主要涉及一种测定哺乳动物肿瘤细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂处理的药物反应情况的方法，此方法需要在相应的肿瘤细胞中鉴别出KRAS基因至少一处突变，并且以这种突变来标示该细胞是否可能对抑制剂处理有所响应。这样一个测定的过程可以在分离的单一肿瘤细胞上实现，也可用于检测诸如体液、分离的机体组织样品以及与之类似的各类生物学/医学/病理学样品，并且这些样品往往含有待分析的细胞或者细胞成分。正如在上文涉及的技术问题时指出的，本领域急迫需要一个有效标志物，用于在治疗前和治疗过程中预测使用HSP90抑制剂进行抗癌治疗的结果；同时，我们也需要将接受HSP90抑制剂抗癌治疗的患者或考虑接受HSP90抑制剂抗癌治疗的患者加以分类，以区别HSP90抑制剂的“敏感者”患者和“非敏感者”患者。本项发明的主要目的是为即将接受或者正在接受某种抗癌或者抗增生治疗的个体提供一种诊断方法，此方法可评测患者在接受HSP90抑制剂治疗前、治疗过程中和/或者治疗后对HSP90抑制剂疗法的反应情况。此过程的主要步骤包括(a)在生物学/医学/病理学样品中鉴定出KRAS基因至少一处(激活性)突变，并且以这种突变作为在接受HSP90 抑制剂治疗前、治疗过程中以及治疗后对HSP90抑制剂具有药物反应的标志，如KRAS基因含有激活性突变则表明此患者对HSP90抑制剂有易感性，即HSP90抑制剂治疗会有效；(b) 根据患者样品中发现的KRAS基因的不同突变情况将其分为“响应者”和“非响应者”。在优选方案中，所依据的KRAS基因突变是激活性突变。因此，本项发明的意义在于首次发现和提供了能够在用HSP90抑制剂进行抗癌/
7抗增生治疗前、治疗过程中以及治疗后准确预测治疗的效果。本项发明之所以能解决上述技术性问题，其原因正如后文以及附加案例中所提到的，我们很意外地发现，在那些细胞(群)、组织(群)或者培养的细胞(群)当中(或者在某种由细胞或者细胞成分组成的生物学样品中)所发现的KRAS基因至少一处突变，可以准确预测这些这些细胞、组织或者培养细胞(或者提供上述生物学样品的个体)对HSP90抑制剂的易感性。目前，由于缺少相应的治疗手段，以KRAS基因发生至少一处突变为特征的这些癌症尚无法得到有效治疗；因此，患有此类癌症或者肿瘤性疾病的患者的预后发展很不乐观(详见KDerhardtQOOfe)，J. Clin. Oncol.)。这类肿瘤性疾病或者癌症可包括非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃肠癌(包括胃癌和食道癌)、肾细胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤等等，并且所有这些疾病都是相关领域内所熟知的。一般而言，除了上述各种肿瘤病之外，一个相关领域内的专业人员还会注意到本发明适用于其他一些典型的肿瘤性疾病， 例如神经内分泌瘤、畸胎瘤等等。本项发明不仅着力于评测HSP90抑制剂治疗恶性肿瘤疾病的成功率，也可用于评测HSP90抑制剂对良性肿瘤疾病的疗效，例如脂肪瘤、纤维瘤、肌瘤、息肉、疣、扁平湿疣以及其他类似的疾病。但是，对恶性肿瘤/癌症的HSP90抑制剂疗效进行评测仍然是本项发明的首要关注点。在本项发明中，KRAS基因的突变可作为对HSP90抑制剂处理具有响应性或者易感性的标记物/预测标记，这使我们深感意外。这里所指的“标记物”和“预测标记”可以交叉使用，都是指基因的某一种等位突变型，这里的“基因”是指KRAS基因，也可以是EGFR 基因和/或者BRAF基因。这些基因典型的突变类型将在后文给予说明。实验数据表明， 我们所定义的“标记物” / “预测标记”与HSP90抑制剂处理的响应性/易感性显著相关(P < 0. 05)。在具体实施方案中，任何一个KRAS基因激活性突变都预示着用HSP90抑制剂对恶性增生(例如癌症)进行治疗(或者预防)的成功。KRAS基因突变可作为肿瘤细胞对HSP90抑制剂尤其是17-AAG具有易感性的标记， 这第一次为此类癌症(KRAS基因发生突变)患者提供了一条治疗途径。患者接受HSP90抑制剂治疗后，临床有效率可在原有基础上提高80%，并且存活率可大约提高100%。在之前用EGFR抑制剂埃罗替尼和吉非替尼治疗含EGFR基因突变的肺癌时，也得到过类似的临床有效率和患者存活率提高的结果。HSP90与发生突变后的原癌基因的成熟过程有关，例如变异的BRAF基因和EGFR基因(ShimamuraU005) Cancer Res ;Grbovic (2005)PNAS)。在此研究领域内有假说认为，在 RAS-RAF通路上的某些基因发生突变的肿瘤细胞依赖于Hsp90的分子伴侣作用，也有人试图通过研究来证实这一假说(Banerji等，2008 ；Hostein等，2001)。在BRAF基因和EGFR基因中带有突变的肿瘤对HSP90抑制剂具有高度易感性，这是因为此类肿瘤的生长和发展需要有HSP90在这些发生了突变的BRAF和EGFR蛋白的成熟过程中发挥其作用。因此，有关这方面的研究者推测，BRAF基因和EGFR基因的突变可以作为对HSP90抑制剂的易感性的一个预测性标记。有人进行过一个临床试验(NCT004310M)来探究HSP90抑制剂IPI-504在治疗非小细胞肺癌患者过程中的安全性和有效性问题(Smith, Drug Discovery Today Therapeutic Strategies，2008)。然而，相关研究既没有提及KRAS基因的突变，也未提出
8此基因突变作为肿瘤细胞/肿瘤对HSP90抑制剂的易感性标记的可能性。相反，在对癌症进行单一化疗或者联合了 EGFR抑制剂例如埃罗替尼(Eberhard(2005) J Clin Oncol 23， 59005909)的化疗时，KRAS基因突变被认为是抗疗性的预测性标记(Pao等，200 )，也就是说，研究者普遍将KRAS基因的突变视作EGFR抑制剂易感性的负标记。换句话说，业内普遍认为带有KRAS基因突变特征的肿瘤细胞/肿瘤对EGFR抑制剂(例如埃罗替尼或者吉非替尼)处理具有抗性。HSP90甚至不被认为与发生变异的KRAS蛋白的成熟过程有关，人们只知道HSP90 分子可能是通过其受质蛋白BRAF(受质蛋白是指HSP90使之稳定的蛋白)来调节依赖于 K-RAS的信号通路激活过程。但是，HSP90可以使之稳定的“受质蛋白，，还有很多。早前始于黑色素瘤患者的一些研究(Banerji等；Mol Cancer Ther, Apr ；7 (4) 737-9 2008)认为，NRAS基因突变和BRAF基因突变有可能是HSP90抑制剂的生物响应标记物。但是，由于仅有六名患者参与了此项研究，其数据所代表的意义便非常有限。具体地说，两位患有转移性黑色素瘤的病人对HSP抑制剂有药物反应；并且其中一位带有BRAF 基因突变而另一位则是NRAS基因发生了突变(Banerji等；Mol Cancer Ther, Apr ；7 (4) 737-9 2008)。然而考虑到在所有黑色素瘤患者中约有45-60%的患者带有BRAF基因突变， 约有20-30%的患者带有NRAS基因突变，并且这两种基因的突变在人群中分布广泛，仅仅两名患者在此种疗法中有效的事实，还不足以证明此类癌症都集中发生在那些对HSP90抑制剂有响应的患者身上。与之形成对照的是，本发明中的研究则是在分析了一批近似于自然分布状态下的肺癌患者病例的基础上，得出带有KRAS基因突变的肿瘤对HSP90抑制剂具有显著的易感性。在这一批肿瘤患者里，带有KRAS基因突变的肿瘤都集中分布在对HSP90 抑制剂有易感性的癌症患者范围内。另外，KRAS蛋白作为HSP90的一个新型受质蛋白，这本身也是一个意料之外的惊人发现。通常，典型的HSP90受质蛋白是具有复杂四级结构的大蛋白，需要进行充分的折叠和加工；变异的BRAF激酶就是这样一个典型的例子。相反，KRAS蛋白是一个非常小的蛋白，不需要充分的结构重构来实现活化。需要注意的是，尽管KRAS和NRAS在结构上具有相似性，它们是不同的蛋白。实际上，这些变异蛋白的任何一种致癌性转变，都离不开特定的细胞内环境。例如，BRAF, EGFR和HER2(这些都是结构高度复杂的蛋白)都是分子伴侣的作用对象，而分子伴侣则在复杂大蛋白的正确折叠过程中起着必不可少的作用。但是，像 KRAS这样一个四级结构相对简单的小蛋白，却未被业内研究者认为(甚至是根本想不到) 是HSP90可能的受质蛋白/底物。我们将在后文解释为什么变异的KRAS蛋白不能与变异的BRAF或者EGFR蛋白一同归类为HSP90的受质蛋白，因此不可能被业内研究人员考虑到有可能是HSP90受质蛋白。有文献表明，变异的KRAS与变异的BRAF或者EGFR(Siimamura T等，Can Res2005 ； Grbovic OM等，PANS 2006)之间存在显著的差别；这表明变异的KRAS不能同变异的BRAF 或者EGFR —起归类为HSP90的受质蛋白。相反，本发明者发现KRAS显然是一个新型的、 非典型的Hsp90受质蛋白。在后面附上的实验说明中可以看到，变异的KRAS蛋白结合到 Hsp90上面，并且用HSP90抑制剂(17-AAG)也不能将变异的KRAS从复合体中去除。在附加案例中还可以看到，突变型和野生型KRAS都能与Hsp90结合，并且这种结合过程不会受到像17-AAG这样的HSP90抑制剂的抑制。然而在相同的实验条件下，我们发现用17-AAG处
9理可以将变异的EGFR从复合体中去除掉，这也与早先研究发现的结果一致(Shimamura T 等；Can Res 2005)。此外，复合体之外的KRAS水平也不会受到影响。然而，用HSP90抑制剂进行处理后，c-Raf和AKT的水平都发生了变化；倘若不受现有理论限制，这个现象也许可以说明抑制HSP90的功能可以杀死KRAS基因发生突变的细胞，因为抑制HSP90的功能阻断了 KRAS下游的两条主要的信号通路(c-Raf和AKT通路)。在不考虑现有理论的情况下，我们认为，KRAS蛋白(尤其是此文中提及的发生激活性突变的KRAS蛋白)是HSP90的一个受质蛋白/底物，HSP90协助完成(被激活的)KRAS 蛋白的折叠过程。可以想见，HSP90是通过其分子伴侣的功能阻止变异的KRAS蛋白(也就是带有激活性突变的KRAS蛋白)被降解掉；因此，有活性的KRAS蛋白水平会提高并且得以保持，而这样一种高水平的活性KRAS蛋白则有可能促成了本文提及的各种癌症的发展和/ 或者恶化(例如肿瘤发生或者肿瘤生长)。我们还可以确信，本文提及的各种HSP90抑制剂是通过干扰HSP90的分子伴侣功能来阻止激活的/变异的KRAS蛋白的正确折叠，从而导致其水平降低。因此，一个显而易见的事实是，HSP90抑制剂在治疗本文提及的各种癌症以及在本项发明提供的各种方法手段中都是很有用的。我们还需要注意到，变异的KRAS蛋白一直未被视作KSP90的受质蛋白，同样与之相关的激活性KRAS基因突变也未被认为或者未被推测可能与肿瘤/癌细胞对HSP90抑制剂的易感性有关。例如,Smith (Drug Discovery Today :The Strategies, 2008)认为，由于 HSP90的受质蛋白种类多样并且HSP90具有多种细胞功能，因此相应的抑制剂也会起到各种不同的作用。尽管先前的研究都将精力集中在分析依赖于HSP90的原癌基因Akt的成熟过程，却没有一项研究系统性地分析过带有KRAS基因突变的细胞对HSP90抑制剂作用的易感性。此外，由于缺乏具有完整遗传标记的大批量细胞系，针对“基因型-表现型”相互关系的大规模临床前研究也难以进行。而本项发明所创立的各种方法和手段都有针对大量肿瘤细胞系的研究作为基础，并且这些细胞系都是属于某一特定类型的肿瘤，因此使得鉴定出对HSP90抑制剂处理具有易感性/响应性的标记物成为可能。例如，Smith (Drug Discovery Today therapeutic Strategies, 2008)指出了 NQOl 基因表达与 17-AAG 易感性之间的相关性。Solit (2008) Drug Discovery Today 13， 8-43页也说明了在HSP90抑制剂试验的设计过程中需要考虑病人的选择性。Solit进一步认为，到目前为止，对于HSP90抑制剂只进行过有限的动物实验，因此关于17-AAG或者其他 HSP90抑制剂可以降解经典HSP90受质蛋白的能力，尚需通过在体试验加以证实。因此，相关文献从未提及KRAS基因突变与HSP90抑制剂易感性的关系，并且人们也不知道变异的KRAS蛋白可作为HSP90的作用靶点。所以，关于KRAS突变作为HSP90抑制剂的敏感性的标记物的发现是始料未及的也是现有技术领域里没有预见到的。如前文所述，罹患携带有KRAS基因突变的癌症的病人存活率非常低、预后发展很糟糕，并且已知的各种疗法都不太有效。因此，将KRAS基因的突变作为对HSP90抑制剂易感性的标记物鉴定出来，将使这些患者从中大为受益。另外，此处提及的诊疗方法还可以在对患者进行临床试验之前鉴定出HSP90的“响应者”(对HSP90敏感的患者)。附加案例所记述的实验对本项发明进行了详细阐述。这些实验意外地发现，对于 HSP90抑制剂尤其是格尔德霉素(geldanamycin)衍生物例如17-AGG的易感性，KRAS基因的突变可作为这种易感性的预测信号。在附加案例中可以看到，研究人员是通过使用具有代表性的NSCLC (非小细胞肺癌)细胞系系列来发现KRAS基因突变可作为HSP抑制剂易感性的预测物/标记物。这些研究结果在另一个基于NCI-60细胞系列的研究中得到了进一步证实(Garraway 等，2005 ；Shoemaker, 2006) (ρ 值< 0. 05)。而 NCI-60 细胞系系列由来自多种肿瘤的细胞系组成，代表了绝大多数人类肿瘤类型；因此可以说，KRAS基因突变是对 HSP90抑制剂具有易感性(对HSP90处理有响应性)的通用预测物/标记物。所以，根据本项发明的设计，除了 NSCLC癌症，任何一种以KRAS基因发生突变为标志的癌症(例如含有 KRAS基因突变的非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、脑瘤、小儿肿瘤、肉瘤等等)都能得到治疗。当然，这里所提的KRAS基因突变最好是激活性的突变。因此在这里所述实施方案中，优先对激活的KRAS基因突变进行寻找、识别或者评估。附加例子中也提供了动物实验数据，表明激活性突变确实预示着对HSP90抑制剂的易感性。这些动物实验应用了一种转基因老鼠模型；这种带有l0X-st0p-l0XKRASG12D 的转基因老鼠由于在肺部表达了一个突变型的KRAS等位基因，因此患有侵入性的肺腺癌 (Jackson EL等；Genes Dev 2001)。接下来，研究人员用一种典型的HSP90抑制剂—— 17-DMAG(文中给予其描述和定义)来处理这种患有肺部肿瘤的老鼠，这种17-AAG衍生物具有更好的可溶性。值得注意的是，处理一周之后，患有肿瘤的四只老鼠有三只的肿瘤发生了消退。尽管这种消退反应是短时的，但明显证实了带有激活性KRAS基因突变的肿瘤对 HSP90抑制剂具有药物反应；这也从在体实验方面确证了针对带有遗传标记细胞系的大规模筛选实验的结果。本项发明所具有的一个优势是，可以离体筛选出那些对HSP90抑制剂敏感或者对 HSP90抑制剂处理有响应性的细胞(群)、组织(群)或者培养细胞。正如文中所指出的， 我们使用的是带有基因组标记的NSCLC细胞系，这种细胞系在遗传多样性、转录谱以及表型特征等方面都具有原发NSCLC(非小细胞肺癌)肿瘤的代表性。一项全范围的基因组集成谱系分析表明，非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的基因组在基因拷贝数、原癌基因突变以及基因表达空间等方面，对在外科手术中从患者身上分离出来的原发性NSCLC肿瘤具有高度代表性。因此，用这样一种NSCLC细胞系便可以避免使用动物或者患有癌症的志愿者进行活体试验。同时，与业内现有技术不同的是，使用这类细胞系还可以使得鉴定出KRAS基因突变作为HSP90抑制剂易感性标记物的结果可靠。我们的构想是，其他的细胞系只要能够高度模拟原发性NSCLC肿瘤，尤其是在基因拷贝数、原癌基因突变以及基因表达空间等方面进行模拟，同样可以用在此处。此外，文中说明过的并在附加案例中得以使用的算法也可用到本项发明当中，尤其是用于评测实验数据，以及/或者鉴定代表着(肿瘤)细胞、(肿瘤)组织、或者(肿瘤)培养细胞对HSP90抑制剂易感性的预测物/标记物。这些算法在相关领域内已广为使用，主要有K-邻近算法以及统计学检验，例如Fisher精确检验。业内专业人员会知晓如何在本项发明中使用这些算法，并且可以根据发明的需要和自身的知识背景采用更多的算法。后文的阐述以及附加案例说明了如何选择细胞系或者细胞系组合， 以便在药物敏感性标记物的评测实验中合理地设计实验组合。为了确认这样一种细胞系是否反映了原发性NSCLC肿瘤的遗传多样性，我们对一大组NSCLC细胞系的基因组进行了系统的分析标注。正如附加案例中所显示的，这些细胞系的表型很稳定，因而证明了非小细胞肺癌(NSCLC)的细胞系对原发性NSCLC肿瘤具有高
11度代表性。同时，这些细胞系还可以用在针对基因组损伤的药物疗效的系统性分析当中。在附加案例中，研究人员通过使用系统性相似谱系分析证实了 EGFR基因突变可用来预测对EGFR抑制剂的易感性(埃罗替尼，PDI68393，凡德他尼)(Arao等，2004 ；Lynch 等，2004 ；Paez等，2004 ；Pao等，2004 ；Sos等，2008)，而这个结果与业内已有的观测结果相一致。同时，已有研究发现在带有EGFR-基因突变的NSCLC细胞系中具有很高的EGFR抑制剂活性(McDermott等，2007 ；Paez等，2004 ；Tracy等，2004)。这些发现都是使用无偏差算法对遗传性损伤进行系统性全局测量而得到的。此外，EGFR基因突变作为EGFR抑制剂易感性的预测物/标记物这一业内已有发现，在本项发明中也得到了证实；因此，这也说明在发现KRAS基因突变作为HSP90抑制剂易感性预测物/标记物的案例实验中，所使用的算法具有全局功能性的生物学可靠性。例如，通过基于细胞的系统性化合物筛选发现EGFR基因突变作为EGFR抑制作用易感性的标记物/预测物(ρ < 0. 0001)，随后根据损伤谱系分析对易感性强弱进行预测。然而出人意料的是，不仅是EGFR基因突变被发现并且证实作为对 EGFR抑制剂易感性的预测物/标记物，KRAS基因突变也被发现并且证实作为对HSP90抑制剂易感性的预测物/标记物。不难理解，在对针对肿瘤细胞的抗癌治疗效果进行深度临床前分析时，不仅需要对取自某一肿瘤体的足量细胞系进行详尽的基因组分析，还需要进行高通量细胞系谱分析，然后根据本文所述对化合物活性进行预测。类似于附加案例所述的凡德他尼/埃罗替尼结合于EGFR激酶结构域，化合物结合于HSP90这个过程的结构模型可以进一步证明发现KRAS基因突变作为对HSP90抑制剂易感性预测物/标记物的准确性。在表达有T790M抗性等位基因的Ba/F3细胞中，相应化合物活性的缺失确证了凡德他尼(Vandatinib)/埃罗替尼(Erlotinib)是EGFR抑制剂。EGFR 基因突变也被发现可作为对SRC/ABL抑制剂达沙替尼(dasatinib)易感性的预测物/标记物。在不受现有理论限制的情况下，这一发现证明了突变的EGFR基因是达沙替尼的确切作用靶点(Song等，2006)。在本项发明中，词组“对HSP90抑制剂的易感性”和“对HSP90抑制剂处理的响应性”可以相互交叉使用。任何关于“对HSP抑制剂的易感性”的解释都适用于“对HSP90抑制剂处理的响应性”，反之亦然。确定药物易感性的技术手段和方法在业内已较为成熟，此类方法主要包括细胞或者组织培养实验。一个非最优选但仍应予以考虑的情况是，应该同时测定两种或者多种 HSP90抑制剂(也就是说，HSP90拥有各种具有不同化学式、有时甚至不具结构相关性的抑制剂)。然而，一次最好只测定一种HSP90抑制剂。后文将对本项发明中优先使用和测定的 HSP90抑制剂予以陈述说明。在此文中，对HSP90抑制剂处理的响应性的测定包括一个接触步骤，后文将对此步骤进行更为细致的说明。这里所说的“HSP90抑制剂处理”是指让一种细胞例如哺乳动物肿瘤细胞或者癌细胞与相应的抑制剂相接触。当然，后文提及的其他各种细胞也可用HSP90 抑制剂进行处理。上述方法还可以包括一个评测/测定步骤，例如，测量用HSP90抑制剂处理过的细胞、组织或者培养细胞或者哺乳动物细胞的存活率。例如，上面提及的各种细胞、组织或者培养细胞在用HSP90抑制剂处理后，存活率可能会下降。理想情况下，这些细胞、组织或者培养细胞相对于未经处理的对照组细胞、组织或者培养细胞而言，存活率可能下降至少
1210%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，最多可达到 90%。除去不用 HSP90 抑制剂进
行处理这一点，对照组细胞、组织或者培养细胞最好与实验组细胞、组织或者培养细胞完全相同。因此，如上文所述，这些经过了 HSP90抑制剂处理并且增殖减少的细胞、组织或者培养细胞，就可被视作对HSP90抑制剂具有易感性。同样地，经过HSP90抑制剂处理并且出现增殖减少的哺乳动物细胞，也被认为对HSP90抑制剂处理具有响应性。后文将阐述测定 KRAS基因中至少一处突变以及相应各种突变的步骤。如前文所述，我们意外地发现，KRAS 基因中这样一个突变可以预示着用HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞是否会对 HSP90抑制剂具有易感性或者对HSP90抑制剂处理具有响应性。存活率的降低可能反映在细胞增殖的减少，例如相对于未经HSP90抑制剂处理的对照组细胞、组织或者培养细胞，实验组细胞、组织或者培养细胞的增殖减少了 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %， 最多可达到90%。这种增殖的减少程度可通过使用标准技术测量总细胞体积、组织体积或者培养细胞体积来进行定量。如上所述，经处理和对照组细胞、组织或者培养细胞的增殖差异，可通过使用标准技术测量细胞、组织或者培养细胞的体积来警醒测定/估计。这种测定可在不同的时间点进行，例如在用HSP90抑制剂处理相应细胞、组织或者培养细胞15分钟、30分钟、60分钟、2 小时、5小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天以及/或者7天之后进行测定。同时，还应进行重复测定，例如，在处理15分钟、30分钟和60分钟后进行测定。需要注意的是， 这些细胞、组织或者培养细胞可在不同的条件下(例如，相同浓度的抑制剂，不同浓度的抑制剂，含有不同稳定剂、稀释剂以及/或者载体的抑制剂等等)进行多次测定(例如2次、 3次、5次、10次或者20次)，而不是只测一次。相应地，重复测定可以在最后一次用HSP90 抑制剂处理之后进行，或者在上述不同处理次数之间进行。上述典型的测定/评测步骤，包括测定经HSP90抑制剂处理的细胞、组织或者培养细胞的增殖情况的步骤，可用于此文提及的以及更多其他测定/评测过程(例如测定HSP90基因的表达水平)。业内技术人员应该知晓此类检测方法，这类方法可对细胞凋亡、衰老或者其他细胞生物学表型进行定量，而这些表型都与肿瘤细胞存活率或者增殖数降低的现象有关。测定对HSP90抑制剂处理的响应性的方法还包括测定HSP90的活性水平，这一活性预示着细胞、组织或者培养细胞是否对HSP90抑制剂具有易感性或者是否对HSP90抑制剂处理具有响应性。正如后文关于测定KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因活性的说明，这里所指的“活性”是指例如在蛋白水平测定酶活力以及/或者测定其表达水平(例如mRNA 或者蛋白质)。文中提及的活性测定方法在相关研究领域已较为成熟，后文也将给予更多的说明。本项发明所说的“HSP90”( “热休克蛋白90”)是指一种真核生物不可缺少的分子伴侣。作为一种分子伴侣，热休克蛋白90起着修正错误折叠的蛋白的作用，因此在健康细胞中发挥着重要的分子控制机能作用。人们发现，在肿瘤细胞中，由于发生突变而激活的原癌基因例如BRAF或者EGFR都需要借助HSP90实现其熟化过程。尽管HSP90本身的功能是保护细胞，肿瘤细胞却也能借助这种保护功能稳定原癌基因，促使致癌性转变的发生。人类HSP90基因的各种转录子序列见SEQ ID第137、139、141、143以及145号；同时相应的各种同型HSP90蛋白的氨基酸序列见SEQ ID第138、140、142、144以及146号。业内有人怀疑编码HSP90AA2蛋白(SEQ ID第145号)的核酸序列可能是个假基因。总体而言，这里提及的HSP90可以指任何一个带有(部分)HSP90活性的氨基酸序列以及编码相应氨基酸序列的核酸序列。除了这里提及的人类HSP90序列，业内技术人员也可以使用已有的手段鉴定出其他哺乳动物或者非哺乳动物(尤其是老鼠、黑猩猩、猕猴、线虫、果蝇)的HSP90核酸序列； 这些鉴定手段包括例如核酸测序、杂交检测、使用人工或者后文将予以说明的计算机程序进行序列比对，在上述计算机程序中对“杂交”和同源度进行了定义。在一项实施案例中， 编码人类HSP90同源物的核酸序列与SEQ ID第137、139、141、143以及145号核酸序列具有至少40%的同源性；在其他更好的情况下，此同源性可达到至少45 %、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或者 98%，并优先选取较高值；而在极端情况下，上述同源性可达到99%以上。对已知核酸序列/启动子的同源序列进行杂交检测的方法在业内已较为成熟；相关技术可以参见 Sambrook、Russell “Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001) ；Ausubel，"Current Protocols in Molecular Biology，，，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N. Y. (1989)。这里所说的“杂交过程”或者“杂交”可以在严苛的或者非严苛条件下进行；如果没有特别要求， 一般使用非严苛的反应条件。这些反应体系可以根据常规的实验方案来建立，例如上面提 R^] Sambrook (2001) ；Ausubel (1989) ； 1 Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach "I RL Press Oxford, Washington DC, (1985)。反应条件的设置应为技术人员所熟知，并且可以根据已有的实验方案进行安排调整。因此，当我们要检测特异性的杂交序列时，就需要使用严格的杂交反应和洗脱条件，例如0. Ix的SSC、 0. 1%的305、反应温度65摄氏度或者&的55(、60摄氏度、0. 1%&SDS。对于检测一般同源性或者非严格匹配的序列，则可以使用较为宽松的杂交反应条件，例如6x的SSC、1%的 SDS、反应温度65摄氏度。此外，探针长度和待检测核酸的化学组成都应在设计反应条件时予以考虑。在本项发明中，涉及到两条或者多条核酸序列时所说的“同源性” “百分比同源性《‘一致《‘百分比一致《‘百分之几一致”或者“序列一致性”，是指这两条或者多条序列或者子序列完全相同、或者某一百分比的核苷酸完全相同(理想情况下至少有40%的一致性， 更好的情况下可至少有 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%或者98%的一致性，最好时可达到99%以上的一致性)； 这些比对结果可通过使用比对窗口进行最大匹配比较或者比对获得，也可使用已有的序列比对算法对指定区域进行比对获得，或者进行人工比对和肉眼检查。举例来讲，具有75%到 90%或者更高的序列一致性的序列，便可被认为是基本相同的。这种定义同样适用于检测序列的互补性。理想情况下，某一段含有至少15-20个核苷酸的序列是完全一致的；更好的情况是至少50到100个核苷酸的序列一致；最好时可至少有800到1200个核苷酸完全一致。业内技术人员将会熟知如何使用各种算法，例如基于CLUSTALW计算机程序(Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994)，4673-4680)或者 FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245)的算法来测定序列之间的一致性百分比。虽然FASTDB算法通常不会考虑序列当中不能匹配的核苷酸缺失或者添加(也就
14是空缺)，但是在其计算过程中，可以人工修正这种偏差以免过高估计序列的一致性百分比。然而，CLUSTALW程序则将序列空缺纳入了一致性计算的考虑范围。此外，还有其他算法可供此领域的技术人员选择，例如BLAST和BLAST2. 0算法(Altschul，(1997)Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402 ；Altschul(1993)J. Mol. Evol. 36 :290-300 ；Altschul (1990)J. Mol. Biol. 215 :403-410)。进行核酸序列比对时，BLASTN程序预设字长(W)为11，期望值(E)为 10, M= 5, N = 4，并且比对核酸的两条链。BL0SUM62打分矩阵(Henikoff (1989) PNAS 89 10915)设置比对值⑶为50，期望值(E)为10，M = 5，N = 4，并且比对核酸的两条链。为了确定一条核酸序列中的某一个核苷酸残基是否对应着该核苷酸序列(例如 SEQ ID第137、139、141、143和145号序列)中的某一个位置，技术人员可采用已知的各种方法和手段，比如人工比对或者使用上述各种计算机程序进行比对。比如BLAST2. 0，全称是 Basic Local Alignment Search Tool (见上文提及的 Altschul (1997) ；Altschul (1993)； Altschul (1990))，可用来进行局部序列比对。如上所述，BLAST可以生成核苷酸序列的比对，以此来确定序列的相似性。由于其比对的“局部”性特征，BLAST在确定精确匹配或者鉴别相似序列方面特别有用。BLAST算法结果输出的基本单位是“高分匹配片段”(HSP)。 一个HSP结果由两条序列片段构成，这两条片段是任意选取的，长度相同，并且在局部比对中得分最高或者其比对得分达到或者超过了用户设置的阈值或者临界分值。因此可以说， BLAST方法就是用来在一条待查询序列和一条数据库序列之间寻找HSP，然后对找到的任意一种匹配情况的统计学显著性进行测算，然后将那些达到了用户设置的显著性标准的匹配结果报告出来。参数E确定统计学显著性阈值，该阈值决定着是否报告某一条数据库序列匹配情况。因此，E值也可以理解为在整个数据库中搜索到一个HSP(或者一批HSP)的概率期望值的上限。任何一个数据库的序列只要匹配值满足E，都将输出到程序结果当中。基于BLAST(见上文提及的 Altschul (1997) ；Altschul (1993) ；Altschul (1990)) 的类似计算机技术也可用来在核苷酸数据库中搜索相同的或者有关联的分子，例如 GenBank或者EMBL。这种分析方法比需要使用多层膜的杂交方法快速得多，而且计算机搜索的敏感度可以进行修正，以便确定某一个匹配应当归类于“精确一致”还是“相似”。搜索结果以下列算式的得分为基础
%序列一致性X % BLAST最高得分 100同时，还综合考虑了两条序列之间的相似度和匹配序列的长度。例如，一个得分为 40分的匹配结果可能有1-2%的错配；而一个70分的匹配就会很精确。通常情况下，得分在15分到40分之间的匹配会被认为是相似的分子，而更低的分数则有可能会鉴别出有关联的分子。另一个可用作序列比对程序的例子是CLUSTALW计算机程序(Thompson (1994) Nucl.Acids Res. 2 :4673-4680) # FASTDB(Brutlag(1990)Comp. App. Biosci.6 237- ，这些都是业内熟知的例子。"HSP90抑制剂”一词在本文中是指某种可以抑制上述提及的“HSP90”的表达或者活性的化合物。例如，某种HSP90抑制剂可以是干扰HSP90基因的转录、基因产物(未剪切或者部分剪切的mRNA)的加工(例如剪切、从细胞核向外转运等类似过程)和/或者基因产物(成熟mRNA)的翻译的化合物。HSP90抑制剂还可以是干扰对HSP90基因编码的多肽/
15蛋白的修饰过程(例如糖基化)，从而完全或者部分抑制前述HSP90蛋白的活性的化合物。 更进一步地，HSP90抑制剂也可以是干扰HSP90蛋白与其他蛋白的相互作用，尤其是那些通过HSP90活性来得到稳定的变异蛋白的化合物。此外，针对编码HSP90的核酸分子而设计的siRNAs/RNAis、反义核酸分子以及核酶都被纳入了本项发明所使用的HSP90抑制剂的范围。同时，上面提及的HSP90拮抗剂/ 抑制剂还可能是一种辅助抑制性的核酸。siRNA 方法在诸如 Elbashir ((2001)，Nature411，494-498)的文献中有所记载。根据本项发明的设计需要，像短发夹RNA(shRNAs)这样的RNA也会作为药物组分被使用在本项发明当中。使基因静默的shRNA方法在业内已广为人知，同时也可能会涉及到st (small temporal) RNAs 的使用，可参见 Paddison Q002) Genes Dev. 16,948-958。如前文所述，业内已有的使基因静默的途径有利用“RNA”的方法，例如 RNAi (iRNA)或者siRNA。成功应用这些方法的例子可参见前文提及的I^addisonQ002)， VX R Elbashir (2002)Methods26,199-213 ；Novina(2002)Mat. Med. June 3,2002 ； Donze (2002)Nucl. Acids Res. 30, e46 ；Paul (2002)Nat. Biotech 20,505-508 ；Lee (2002) Nat. Biotech. 20，500—505 ；Miyagashi(2002)Nat. Biotech. 20，497—500 ；Yu(2002)PNAS 99,6047-6052 或者 Brummelkamp Q002)，Science 296,550-553。这些方法可能使用了遗传载体比如pSUPER载体，或者使用了 RNA聚合酶III载体，可参见前文提及的Υι^2002)； Miyagishi (2002)或者 Brummelkamp (2002)。业内研究还使用过更多种类的HSP90抑制剂，相关例子可参见Gharp and Workman, 2006 ； Sol it and Rosen, 2006) 然而，本项发明所使用的HSP90抑制剂却不仅限于已知的各种类型；也就是说，本项发明也可以用于对今后发现的HSP90抑制剂抗癌疗效的预测。这些抑制剂可通过本文介绍的各种方法或者业内已有的手段鉴定出来，例如针对HSP90抑制作用的高通量生化检测手段(Sharp and Workman, 2006 ； Sol it and Rosen, 2006)。以已有的知识背景为基础，业内技术人员可以很容易地鉴定出这类抑制剂，或者检测出疑似HSP90抑制剂化合物的抑制活性。这些检测过程可能需要使用到附加案例中描述过的各种细胞或者培养细胞，还可能会用到其他各种细胞/组织/培养细胞，例如从活组织检查中获得的细胞/组织/培养细胞。本项发明的优选案例所使用的HSP90抑制剂是格尔德霉素或者其衍生物。格尔德霉素(IUPAC 命名为([18S-(4E,5Z,8R*,9R*, 10E, 12R*, 13S*, 14R*, 16S*, )]_9_[(氨基羧基) 氧]-13-羟基-8，14，19-三甲氧基-4，10，12，16-四甲基-2-氮杂双环[16. 3. 1. ] 二十二碳-4，6，10，18，21-戊烷-3，20，22trion)是一种由吸水链霉菌产生的苯醌安莎霉素类抗生素。格尔德霉素能特异性地与HSP90(热休克蛋白90)结合并且影响其功能。通常情况下， Hsp90能够使蛋白的折叠趋于稳定，尤其是肿瘤细胞中过量表达/变异的蛋白，例如v-Src、 Bcr-Abl以及p53等等；而Hsp90抑制剂格尔德霉素则可以引起这些蛋白的降解。以下是格尔德霉素的化学式
1权利要求
1.一种可以鉴定出对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或是培养的细胞的方法， 包括如下步骤(a)确定待测细胞、组织或培养细胞是否在KRAS基因中至少有一处激活突变；(b)挑选出在KRAS基因中至少有一个激活突变的细胞、组织或培养细胞。
2.如权利要求1所述的方法，此外还包括如下步骤(i)将上述待测细胞、组织或培养细胞用某种HSP90抑制剂进行处理；( )测定上述经某种HSP90抑制剂处理的待测细胞、组织或培养细胞的存活率。
3.一种测定某种哺乳动物肿瘤细胞或癌细胞对某种HSP90抑制剂处理的响应性的方法，该方法包括测定上述肿瘤细胞中至少一处KRAS基因的激活性突变，该突变预示着此细胞是否会对上述处理发生响应或者具有响应性。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，此外还需测定EGFR基因和/或者BRAF 基因中的激活性突变。
5.一种体外鉴别某种HSP90抑制剂的响应者或者对其具有易感性的患者的方法，包括如下步骤(a)从疑似患有或者易患某种癌症的患者处获得样品，此种癌症以在KRAS基因中、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处激激活性突变为特征；(b)鉴定上述KRAS基因、以及EGFR基因和/或BRAF基因中的至少一处激激活性突变； 其中，仅仅在KRAS基因中有一个激激活性突变、或者在EGFR基因和/或BRAF基因中也有激激活性突变，将标志着某个响应性患者，或者表示该患者对某种HSP90抑制剂具有敏感性。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所说的HSP90抑制剂为格尔德霉素或其某种衍生物。
7.如权利要求6所述的方法，所说的格尔德霉素衍生物为17-AAG或者IPI-504。
8.如权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所说的HSP90抑制剂为NVP-AUY922。
9.如权利要求1至8中任意一项所述的方法，其中所说的KRAS基因突变选自以下一组突变情况KRAS_G12C，KRAS_G12R, KRAS_G12D, KRAS_G12A, KRAS_G12S, KRAS_G12V, KRAS_ G13D, KRAS_G13S, KRAS_G13C, KRAS_G13V, KRAS_Q61H, KRAS_Q61R, KRAS_Q61P, KRAS_Q61L, KRAS_Q61K, KRAS_Q61E, KRAS_A59T 以及 KRAS_G12F。
10.如权利要求4至9中任意一项所述的方法，其中所说的EGFR基因突变选自以下一组突变情况EGFR_D770_N771 > AGG ；EGFR_D770_N771insG ；EGFR_D770_N771insG ； EGFR_D770_N77IinsN ；EGFR_E709A ；EGFR_E709G；EGFR_E709H ；EGFR_E709K ；EGFR_E709V ； EGFR_E746_A750del ；EGFR_E746_A750del, T751A ；EGFR_E746_A750del, V ins ；EGFR_E746_ T751del, I ins ；EGFR_E746_T751del，S752A ；EGFR_E746_T751del，S752D ；EGFR_E746_ T751del, V ins ；EGFR_G719A ；EGFR_G719C ；EGFR_G719S ；EGFR_H773_V774insH ；EGFR_H773_ V774insNPH ；EGFR_H773_V774insPH ；EGFR_H773 > NPY ；EGFR_L747_E749del ；EGFR_L747_ E749del, A750P ；EGFR_L747_S752del ；EGFR_L747_S752del, P753S ；EGFR_L747_S752del， Q ins ；EGFR_L747_T750del, P ins ；EGFR_L747_T751del ；EGFR_L858R；EGFR_L861Q ；EGFR_ M766_A767insAI ；EGFR_P772_H773insV ；EGFR_S752_I759del ；EGFR_S768I ；EGFR_T790M ； EGFR_V769_D770insASV ；EGFR_V769_D770insASV ；以及 EGFR_V774_C775insHV。
11.如权利要求4至10中任意一项所述的方法，其中所说的BRAF基因突变选自以下一组突变情况BRAF_D594G，BRAF_D594V, BRAF_F468C, BRAF_F595L, BRAF_G464E, BRAF_G464R, BRAF_G464V,BRAF_G466A,BRAF_G466E,BRAF_G466R,BRAF_G466V,BRAF_G469A,BRAF_G469E, BRAF_G469R, BRAF_G469R, BRAF_G469S,BRAF_G469V,BRAF_G596R,BRAF_K601E,BRAF_K601N, BRAF_L597Q,BRAF_L597R,BRAF_L597S,BRAF_L597V, BRAF_T599I, BRAF_V600E, BRAF_V600K, BRAF_V600L和 BRAF_V600R。
12.如权利要求4至11中任意一项所述的方法，其中所说的KRAS基因、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的突变可以通过SSP、PCR-RFLP、实时定量PCR、测序、HPLC或质谱基因型鉴定等方法来进行检测。
13.如权利要求5至12中任意一项所述的方法，其中所说的样品取自疑似患有或者易患癌症的患者。
14.一种使用能检测至少一种KRAS基因激活性突变、以及(可有可无地)EGFR或者 BRAF基因激活性突变的寡聚或多聚核苷酸用于对条目6到8中的定义的HSP90抑制剂敏感度进行诊断的用途。
15.应用权利要求14，其中所说的寡聚核苷酸长度大约为15至100个核苷酸。
16.一种监测针对患有上述疾病或者易患上述疾病的患者所进行的抗癌治疗的疗效的方法，此类癌症以在KRAS基因中、同时选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少具有一处激激活性突变为特征；该方法包括如下步骤a)在取自上述受治疗者/患者的细胞或者组织样品中，测定KRAS基因的表达或者活性，同时选择性地测定EGFR基因的活性或表达水平、以及/或者BRAF基因的说性或表达水平；b)将a)步骤中测得的至少一种上述标记基因的活性、与KRAS基因的参考或对照表达水平或者参考或对照活性进行比较，同时选择性地与EGFR基因的参考或对照表达水平以及/或者BRAF基因的参考或对照表达水平进行比较，在a)步骤中测得的活性或表达水平、与上述参考表达水平或参考活性之间的差异程度标志着针对上述癌症所进行的治疗的疗效。
17.一种预测针对患有上述疾病或者易患上述疾病的患者所进行的抗癌治疗的疗效的方法，此类癌症以在KRAS基因中、同时选择性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少具有一处激激活性突变为特征；该方法包括如下步骤a)在取自上述受治疗者/患者的细胞或者组织样品中，测定KRAS基因、EGFR基因以及 /或者BRAF基因中至少一种标记基因的活性或表达水平；b)将a)步骤中测得的至少一种上述标记基因的活性、与至少一种上述标记基因的参考活性或参考表达水平进行比较；该参考活性或参考表达水平是从取自某一对照受治疗者 /患者(响应者/非响应者)的细胞或者组织样品中选择性地测得，在a)步骤中测得的活性或表达水平、与上述参考或对照活性或者是参考或对照表达水平之间的差异程度，标志着针对癌症所进行的治疗的预期疗效。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中针对以在KRAS基因中、同时在EGFR基因和 /或者BRAF基因中至少有一处激激活性突变为特征的癌症所进行的治疗过程，包括施用权利要求6至8中任何一项所定义的某种HSP90抑制剂。
19.应用一种在KRAS基因中、同时在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一处激激活性突变的(转基因)细胞或者(转基因)非人类动物，来对用来治疗以在KRAS基因中至少有一处激激活性突变为特征的癌症的某种药物进行筛选和/或者验证。
20.如权利要求5至19中任意一项所述的方法，其中所说的癌症选自下列一组癌症 非小细胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃肠癌(包括胃癌和食道癌)、肾细胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、脑瘤、小儿肿瘤以及肉瘤。
21.—种可以用来实现权利要求1至12、16、17以及20当中任何一项所述方法的试剂盒，该试剂盒包括可用来测定KRAS基因中至少一处激活性突变的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸，也可以包括但不一定包括可用来测定EGFR基因和/或者BRAF基因中至少一处激活性突变的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸。
22.应用权利要求6至8中任何一项所定义的HSP90抑制剂来制备用来治疗、改善以及 /或者预防癌症的药物制剂；此类癌症以在KRAS基因中至少有一处激活性突变为特征。
23.应用权利要求6至8中任何一项所定义的某种HSP90抑制剂，来治疗、改善以及/ 或者预防以KRAS基因中至少有一处突变为特征的癌症。
24.一种选自以下各种细胞系的细胞系组合A427、A549, Calu-U Calu-3、Calu-6、 H1299、H1355、H1395、H1437、H1563、H1568、H1648、H1650、H1666、H1734、H1755、H1770、 H1781、H1792、H1819、H1838、H1915、H1944、H1975、H1993、H2009、H2030、H2052、H2087、 H2110、H2122、H2126、H2172、H2228、H23、H2347、H2444、H28、H358、H441、H460、H520、H522、 H596、H647、H661、H820、HCC2935、HCC4006、HCC827、SK-LU-I、EKVX,H322M、H0P-62、H0P-92、 Colo699、DV-90、HCC15、HCC366、HCC44、HCC78、LCLC103H、LCLC97TM1 以及 LouNH91。
25.应用权利要求M所定义的细胞系组合来预测对某种药物的易感性。
26.应用权利要求25，其中所说的药物是指某种HSP90抑制剂。
全文摘要
本项发明涉及一种挑选对HSP90抑制剂具有易感性的细胞、组织或者培养细胞的方法。另外还描述了一种测定哺乳动物的肿瘤细胞或者癌细胞对HSP90抑制剂治疗的反应情况的方法。尤其是，本项发明提供了一种体外诊断方法以筛选出那些对HSP90抑制剂具有易感性的患者，其中包括应用可以用于检测KRAS基因中激活性突变的寡核苷酸或者多聚核苷酸。本项发明还涉及对一种癌症的疗效进行检测评估或监测的方法，此类癌症以KRAS基因中至少出现一处激酶激活性突变为特征，也可能但非必须在EGFR和/或者BRAF基因中也至少出现一处激活性突变。此外，还介绍了一种对癌症尤其是具有上述基因突变特征的癌症的疗效进行预测的方法。最后，应用具有上述基因突变特征的(转基因)非人类动物模型或者(转基因)细胞模型对抗癌药物进行筛选和/或者验证，并提供了一套可以实现上述各种检测功能的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102216775SQ200980141367
公开日2011年10月12日 申请日期2009年8月17日 优先权日2008年8月18日
发明者K·王, K·马林, P·弗朗莫特, R·托马斯, T·赞德 申请人:科隆大学, 马克斯·普朗克科学促进协会