L-氨基酸生产菌以及l-氨基酸的生产方法

专利名称：L-氨基酸生产菌以及l-氨基酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及L-半胱氨酸等L-氨基酸的生产方法，具体来说涉及适于生产L-氨基 酸的细菌，以及使用该细菌的L-氨基酸生产方法。L-氨基酸在调味品、食品添加剂、饲料添 加剂、化学产品、医药品等多种领域中被利用。
背景技术：
L-氨基酸是通过使用属于短杆菌属、棒状杆菌属、埃希氏菌属等的微生物的发酵 方法来进行工业生产的。在这些生产方法中，使用从自然界分离的菌株或者该菌株的人工 突变株，并且还使用通过重组DNA技术进行修饰从而增加了碱性L-氨基酸生物合成酶的活 性的微生物等(专利文献1 9)。此外，例如，L-半胱氨酸可以通过从毛发、角、羽毛等含有角蛋白质的物质中提取 而获得，或者以DL-2-氨噻唑啉-4-羧酸为前体通过细菌酶转化而获得。此外，还计划使用 新型酶通过固定化酶方法大量生产L-半胱氨酸。还尝试通过使用细菌的发酵方法来生产L-半胱氨酸。例如，本发明人公开的使用 下述埃希氏菌属细菌的L-半胱氨酸的生产方法，所述埃希氏菌属细菌的L-半胱氨酸分解 系统受到了抑制、且降低了 L-半胱氨酸的反馈抑制并且携带了丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase(EC 2.3. 1. 30)，下面也称为“SAT”)(专利文献11)。此外，作为通 过抑制L-半胱氨酸分解系统从而提高了 L-半胱氨酸生产能力的细菌，已知的有使胱硫 醚-β-裂解酶(专利文献11)、色氨酸酶(专利文献12)、0-乙酰丝氨酸巯基水解酶(专 利文献13)的活性降低或缺失的棒状杆菌型细菌或埃希氏属细菌。同样地，还已知使用下 述细菌的L-半胱氨酸制造方法，所述细菌中，利用编码降低了 L-半胱氨酸反馈抑制并具有 特定突变的SAT的DNA序列，使L-半胱氨酸物质代谢摆脱了调控(专利文献14)。还已知编码YdeD蛋白质的ydeD基因(非专利文献1)以及编码YfiK蛋白质的 yfiK基因(专利文献15)与L-半胱氨酸途径的代谢产物的分泌有关。此外，已知通过增 强作为编码适于排出针对细胞的有毒物质的蛋白质的基因的mar-基因座、acr-基因座、 cmr-基因座、mex-基因座、bmr-基因座、qacA-基因位点(专禾U文献16)、或emrAB、emrKY、 yojIH.acrEF.bcr或者cusA基因(专利文献17)的表达来提高L-半胱氨酸生产能力的技 术。另一方面，已经报道了使用过量表达了下述基因的细菌来生产L-半胱氨酸的方 法，所述基因为编码优选使抗生物质或对细菌有毒性的物质直接从细胞放出的蛋白质的基 因(专利文献18)。此外，不仅是L-半胱氨酸，还已知对于提高细菌的L-氨基酸的生产力而言，可以 通过提高L-氨基酸的分泌蛋白质的表达来实现。对于棒状杆菌型细菌，已有报道称，通过 增强命名为IysE的L-赖氨酸分泌载体的表达量，可以提高L-赖氨酸的生产(专利文献 19)。此外，对于埃希氏菌属细菌，已知几种预测为氨基酸分泌载体的膜蛋白质。例如，报 道了通过增加命名为rhtB的基因的拷贝数，可以提高对于高浓度L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸以及L-异亮氨酸的抗性，因此预测该基因产物为这些L-氨基酸的分 泌载体(专利文献19)。已经有报道称，yeaS基因被推测为属于上述rhtB基因家族的膜蛋白质，通过增强 该基因表达量，与对照株相比也可以提高对于高浓度的L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-赖氨酸、 L-谷氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、α-氨基丁酸的抗性，通过在L-氨基酸生产菌中增强该 基因的表达量，提高了 L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、以及L-组氨酸的生 产力(专利文献20)。如上所述，通过增强yeaS基因的表达量，可以研究其对各种氨基酸生产的效果 (非专利文献2)，但对于使L-氨基酸生产力提高的yeaS基因的突变尚属未知。现有技术文献专利文献专利文献1欧洲专利公开EP0643135B专利文献2欧洲专利公开EP0733712B专利文献3欧洲专利公开EP1477565A专利文献4欧洲专利公开EP0796912A专利文献5欧洲专利公开EP0837134A专利文献6国际公开W001/53459专利文献7欧洲专利公开EP1170376A专利文献8国际公开W02005/010175专利文献9国际公开W096/17930专利文献10国际公开W02006/013807专利文献11特开平11-155571号专利文献12 特开 2003-169668专利文献13 特开 2005-245311专利文献14 特表 2000-504926专利文献15特开2004-49237专利文献16美国专利第5972663号专利文献17 特开 2005-287333专利文献18特开平11-56381号专利文献19 特开 2000-189180专利文献20欧洲专利申请公开第1013765A1非专利文献非专利文献IDabler et al.，Mol. Microbiol. 36. 1101-1112 (2000)非专利文献2Kutukova et al.，FEBS Lett. 579. 4629-4634(2005)

发明内容
发明所要 解决的问题本发明的课题是开发使细菌L-氨基酸生产能力提高的新型技术，提供L-氨基酸 生产菌、以及使用该细菌的L-氨基酸的生产方法。
解决问题的方法本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过向yeaS基因导入 特定的突变，可以提高L-氨基酸的生产能力，从而完成了本发明。S卩，本发明如下所述。 (1). 一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，在培养基中培养具有L-氨基酸生产 能力、且经过了修饰从而携带具有选自下述(I) (III)中的突变的突变型yeas基因的属 于肠肝菌科的细菌，并从该培养基收集L-氨基酸(I)在yeaS基因编码的蛋白质中，第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所 取代的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中，第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突变，(III)在yeaS基因编码的蛋白质中，第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基 酸所取代的突变；其中，没有所述突变的yeaS基因编码下述(A)或(B)中的任一种蛋白质(A)具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10个 氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产能 力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质。(2).上述的方法，其中，没有所述突变的yeaS基因为下述(a)或(b)的DNA (a)具有SEQ ID NO 1中所示的碱基序列的基因，或，(b)与SEQ ID NO=I中所示的碱基序列的互补序列或能够由该互补序列制备的探 针在严格条件下杂交、并且编码具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产能 力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质的DNA。(3).上述的方法，其中所述(I) (III)的突变分别为下述(i) (iii)的突变(i)第28位的苏氨酸残基被天冬酰胺所取代的突变，(ii)第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸以 及甘氨酸中的任一种所取代的突变，(iii)第188位的亮氨酸残基被谷氨酰胺所取代的突变。(4).上述的方法，其中所述细菌携带具有所述(ii)的突变的突变型yeaS基因，且 在该基因编码的蛋白质中第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸或谷氨酰胺所取代。(5).上述的方法，其中，所述L-氨基酸选自L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、 L-丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-异亮氨酸、L-苯 丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸。(6).上述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-半胱氨酸。(7).上述的方法，其中，所述细菌经过修饰从而增强了 L-半胱氨酸生物合成系统 酶的活性。(8).上述的方法，其中，所述细菌经过修饰从而增强了丝氨酸乙酰转移酶活性。(9).上述的方法，其中，所述细菌携带降低了由L-半胱氨酸导致的反馈抑制的突 变型丝氨酸乙酰转移酶。
(10).上述的方法，其中，所述细菌为泛菌属细菌。(11).上述的方法，其中，所述细菌为Pantoea ananatis。(12).上述的方法，其中，所述细菌为大肠杆菌。 (13). 一种属于肠肝菌科的细菌，其具有L-氨基酸生产能力，并且经过了修饰从 而携带具有选自下述(I) (III)中的突变的突变型yeaS基因(I)在yeaS基因编码的蛋白质中第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所 取代的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突变，(III)在yeaS基因编码的蛋白质中第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基酸 所取代的突变；其中，没有所述突变的yeaS基因编码下述(A)或(B)中的任一种蛋白质(A)具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10个 氨基酸而得到的氨基酸序列、并且具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产 能力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质。(14).权利要求13的细菌，其中，所述L-氨基酸为L-半胱氨酸。(15). 一种DNA，其编码具有选自下述⑴ (III)的突变的下述(A)或⑶中的 任一种蛋白质(A)具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10个 氨基酸而得到的氨基酸序列、并且具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产 能力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质；(I)在yeaS基因编码的蛋白质中第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所 取代的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突变，(III)在yeaS基因编码的蛋白质中第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基酸 所取代的突变。发明效果通过本发明可以提高属于肠杆菌科的细菌的L-氨基酸生产力。此外，通过使用本 发明的细菌，可以更高效地发酵生产L-氨基酸。此外，通过本发明，可以提供编码具有使得宿主细胞的L-氨基酸生产力与非修饰 株相比提高的活性的蛋白质的新基因。


图1显示启动子Pnlp序列的图。图2显示E. coli MG1655的YeaSF137S强化株的半胱氨酸抗性(生长繁育曲线) 的图，〇表示野生型， 表示F137S突变。
图3显示P. ananatis的YeaSWT以及YeaSF137S强化株的培养液中氨基酸浓度的 图。图4显示E. coli的YeaSWT以及YeaSF137S强化株的培养液中氨基酸浓度的图。发明的
具体实施例方式<1>本发明的细菌本发明的细菌为具有L-氨基酸生产能力，并且经过修饰从而携带了具有特定突 变的突变型yeaS基因的细菌。对于L-氨基酸的种类没有特殊限制，可以列举出L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨 酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘 氨酸等脂肪族氨基酸，L"苏氨酸、L"丝氨酸等羟基单氨基羧酸形式的氨基酸，L"脯氨酸等 环式氨基酸，L"苯丙氨酸、L"酪氨酸、L"色氨酸等芳香族氨基酸，L"半胱氨酸、L"胱氨酸、 L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L"谷氨酸、L"天冬氨酸、L"谷氨酰胺、L"天冬酰胺等等酸性氨 基酸，优选L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-缬 氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸以及L-脯氨 酸，特别优选L-半胱氨酸。本发明的细菌可以具有2种以上氨基酸的生产能力。此外，本发明中的L-氨基酸是指游离体的L-氨基酸以及/或者其盐，例如包括硫 酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。L-氨基酸的生产能力是指，当在培养基中培养本发明的细菌时，在培养基中或者 菌体内生成L-氨基酸，并且积累达到可以从培养基中或者菌体中回收的水平的能力。此 外，具有L-氨基酸生产能力的细菌是指，与野生株或者亲本株相比可以生产更多L-氨基酸 并在培养基中积累的细菌，优选可以生产并在培养基中积累0. 2g/L以上，更优选为0. 3g/ L，特别优选为0. 4g/L以上的L-氨基酸的细菌。当L-氨基酸为L-半胱氨酸时，细菌生产的L-半胱氨酸在培养基中通过二硫键一 部分转化为L-胱氨酸。此外，如下述一样，有时L-半胱氨酸通过和培养基中含有的硫代 硫酸反应生成S-硫代半胱氨酸(Szcz印kowski T. ff.，Nature, vol. 182(1958))。进一步， 细菌的细胞内生成的L-半胱氨酸有时还和细胞中存在的酮或醛，例如与丙酮酸缩合，以硫 代半酮缩醇(、$手才》夕一>，hemithioketal)为中间体生成噻唑烷(千7、/ <J ” >， thiazolidine)衍生物(参考日本专利第2992010)。这些噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇 有时作为平衡混合物存在。因此，L-半胱氨酸生产能力，不仅限于在培养基中或者菌体内 积累L-半胱氨酸的能力，是指除L-半胱氨酸之外，还包括L-胱氨酸、或者它们的衍生物， 例如S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物、或者硫代半酮缩醇、或者它们的混合物在培养基中 的积累能力。此外，对于在本发明的方法中生产的“L-半胱氨酸”没有特殊限制，是指还原 性L-半胱氨酸、L-胱氨酸、或者上述的这些衍生物、或者它们的混合物。作为具有L氨基酸生产能力的细菌，可以为天然具有L-氨基酸生产能力的细菌， 但也可以是如下所述的细菌通过利用突变方法、重组DNA技术经过修饰而具有了 -L氨基 酸生产能力的细菌。作为在本发明中使用的细菌，只要是具有L-半胱氨酸生产能力的细菌即可，没有 特殊限制，可以是属于埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏 菌属、沙门氏菌属、摩根氏菌属等肠肝菌科的细菌。具体地说，可以使用按照NCBI(美国国
8家生物技术信息中心，National Center for Biotechnology Information)数据库中记载 的分类属于肠杆菌禾斗的细菌(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/Browser/wwwtax. cgiyyid = 91347)。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本株，其中优选使用埃希氏菌属细菌、肠 杆菌属细菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属、肠杆菌属、或克雷伯氏菌属。对于埃希氏菌属细菌的亲本株，没有特别限制，具体而言，可以使用Neidhardt等 白勺胃作(Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of somemutant derivatives of Escherichia coli K-12,p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt(ed.),Escherichia coli and Salmonella Cellular and MolecularBiology/Second Edition, American Society for Microbiology Press，Washington，D. C.)列出的细菌。在这些细菌中，例 如可列举大肠杆菌。作为大肠杆菌，具体地可列举源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌 W3110(ATCC 27325)和大肠杆菌 MG1655 (ATCC 47076)。这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive， Rockville, Maryland 20852 P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America)通过分售获得。即，对每种菌株都给予了登录号，可以使用这些号码通过分售获得 菌株(参考http://www.atcc. org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了每种菌株 的对应登录号。肠杆菌属细菌的实例可以列举出成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等、泛菌属细菌的实例可以列举出Pantoea ananatis。而且，近年来，成团肠杆菌根据其16S rRNA的碱基序列的解析，被重新分类为 f^M&M (Pantoea agglomerans) ^ Pantoea ananatis (Pantoea ananatis) ^ Jff K^S (Pantoea stewartii)。在本发明中，只要是被分类为肠杆菌科的细菌，无论是属于肠杆菌 属或者泛菌属中任一属的细菌均可。特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为变形细菌 (y -Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J GenAppl Microbiol 1997 Dec ;43 (6)355-361、International Journal of SystematicBacteriology, Oct. 1997，pl061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些 I^MSt^^^Jlif (Pantoeaagglomerans) ^ Pantoea dispersa ^ (International Journal of SystematicBacteriology, July 1989 ;39 (3) p. 337-345)。此外，属于欧文氏 菌属的细菌中，有些被重新分类为Pantoea ananas、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(参考 International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993 ;43 (1) p. 162—173)。肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆 菌(Enterobacter aerogenes)。具体地，可以使用欧州专利申请公开952221号说明书示例 的菌株。作为肠杆菌属的代表性菌株，可以列举出成团肠杆菌ATCC12287株。作为泛菌属细菌的代表性菌株，可以列举出Pantoea ananatis,斯氏泛菌 (Pantoea stewartii) >j^lljSlif^'lT'RSlif (Pantoea citrea)Pantoeaananatis [本 地可以列举出Pantoea ananatis AJ13355株、SC17株、以及SC17 (0)株。SC17株是以作为 低PH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从静R县磐田市的土壤中分离出 来的菌株AJ13355(FERMBP-6614)为起始，作为粘液质低生产突变菌株选择出来的菌株(美 国专利第6，596，517号)。SC17 (0)株是为了对Pantoea ananatis进行基因破坏，而构建的作为对λ Red基因产物具有抗性的菌株(W02008/075483)。SC17株已于平成21年2月4日 (2009年)保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码305-8566茨城 县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，并给予保藏号FERM ABP-11091。此外，SC17 (0)株已于 2005年9月21日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM), GNII Genetika)(地址Russia, 117545 Moscow, IDorozhny proezd. 1)，保藏号为 VKPM B-9246。Pantoea ananatis AJ13355株已于平成10年(1998年)2月19日保藏于通产省工 业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地 址邮政编码305-8566茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERM P-16644， 并于平成11年(1999年)1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在分离时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，并当 作成团肠杆菌AJ13355进行了保藏。但是，近年来，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，其被 MSt^^^J Pantoea ananatis 作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜 软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举出植生克雷伯氏 菌(Klebsiella planticola)0(L-氨基酸生产能力的赋予或增强) 为了给细菌赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属 细菌等氨基酸生产菌的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变体、类似物抗性菌株 或代谢调节突变菌株，创建L-氨基酸生物合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见《7 笑7酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这里， 在L-氨基酸生产菌的选育中，被赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可 以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-氨基酸生物合成系统 酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将营养缺陷突变、类似物抗性或 代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代 谢调节突变菌株可如下获得对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，即X-射线或UV 照射或用诱变剂例如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等处 理；其后，从所得的突变菌株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具 有L-氨基酸生产能力的菌株。此外，可以通过进行基因重组来增强酶活性从而赋予或增强L-氨基酸生产能力。 酶活性的增强，可以列举出例如通过修饰细菌从而增强编码与L-氨基酸的生物合成相关 的基因的表达的方法。作为增强基因的表达的方法，可以这样来实现导入扩增的质粒，所 述扩增的质粒是将包含这些基因的DNA片段导入适当的质粒，例如至少包含负责质粒在微 生物内的复制增殖功能的基因的质粒载体而形成的；或者，通过接合、基因转移等使这些 基因在染色体上多拷贝化；抑或在这些基因的启动子区域导入突变(参考国际公开小册子 W095/34672 号)。当向上述扩增质粒或者染色体上导入目的基因时，用于表达这些基因的启动子可 以是能够在属于肠杆菌科的细菌中发挥功能的任何启动子，可以是所使用的基因自身的启动子，也可以是经修饰的启动子。也可以通过适当地选择在属于肠杆菌科的细菌中强力发 挥功能的启动子，或者通过使启动子的-35、-10区域与共有序列接近，来进行基因表达量 的调节。如上所述的增强酶基因表达的方法，在W000/18935号小册子、欧洲专利申请公开 1010755号说明书等中有记载。下面，对于给细菌赋予L-氨基酸生产能力的具体方法、以及被赋予了 L-氨基酸生 产能力的细菌进行举例说明。L-半胱氨酸生产菌 L-半胱氨酸生产菌以及用于衍生L-半胱氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举 出、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶 (SAT)的多种(^吐等位基因转化的大肠杆菌譯15(美国专利第6，218，168号)，具有编码适 于向细胞分泌有毒物质的蛋白质的过表达基因的大肠杆菌W3110(美国专利第5，972，663 号)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(特开平 11-155571号公报)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大 肠杆菌W3110(W001/27307)等。本发明的细菌为经过修饰而携带了具有特定突变的yeaS 基因的细菌。如下所述，yeaS基因编码的蛋白质(下面，也称为“YeaS蛋白质”)被推测为 具有将L-半胱氨酸等L-氨基酸分泌到细胞外的活性。在大肠杆菌中，作为具有分泌L-半胱氨酸活性的公知的蛋白质，已知了如上所述 的由ydeD编码的蛋白质(特开2002-233384)、由yfiK编码的蛋白质(特开2004-49237)、 由 emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr、cusA 各基因编码的蛋白质(特开平 2005-287333)。除 了使细菌携带突变型yeaS基因之外，还可以增强它们的反馈抑制抗性的SAT的活性、L-半 胱氨酸分泌蛋白质的活性。下面，作为赋予L-半胱氨酸生产能力的方法，对增强L-半胱氨酸生物合成酶活性 的方法进行说明。作为L-半胱氨酸生物合成酶，可以列举出例如，丝氨酸乙酰转移酶(SAT)。在属 于肠杆菌科的细菌的细胞内增强SAT活性，可以通过增加编码SAT基因的拷贝数、或者通过 修饰编码SAT基因的启动子等表达调节序列来实现。例如，将编码SAT的基因片段，与在属 于肠杆菌科的细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体连接制作重组DNA，并将其转化导 入到属于肠杆菌科的宿主细菌中即可。更为具体地，可以适用与后述的yeaS基因同样的方 法。SAT基因可以任选埃希氏菌属细菌来源的基因以及其他生物来源的基因使用。作 为大肠杆菌的编码的SAT基因，从野生株以及L-半胱氨酸分泌突变株中克隆了 cysE，从而 得知其碱基序列(Denk, D. and Boeck, Α.，J. General Microbiol.，133，515-525 (1987))。 因此，使用基于该基因序列(SEQ IDNO 3)制成的引物，以埃希氏菌属细菌的染色体DNA为 模板进行PCR，可以获得SAT基因(参考特开平11-155571号)。其他生物的编码SAT的基 因也可以同样地获得。通过上述方法得到的SAT基因，也可以像上述那样进行表达增强。而且，当在SAT基因的表达中存在“L-半胱氨酸反馈抑制”等抑制机理时，通过修 饰表达调节序列或与抑制相关的基因从而使该抑制机制变为非敏感性的，也可以增强SAT 基因的表达。例如，通过在属于肠杆菌科的细菌中携带降低或解除了 L-半胱氨酸反馈抑制的SAT(下面，也称为“突变型SAT”)，可以使SAT活性升高。作为突变型SAT，可以列举出具有下述突变的SAT 用赖氨酸残基以及亮氨酸残基以外的氨基酸残基取代相当于野生型 SAT (SEQ ID NO 4)的第256位的甲硫氨酸残基的氨基酸残基的突变，或者从相当于第256 位的甲硫氨酸残基开始缺失C末端侧的区域的突变。作为所述赖氨酸残基以及亮氨酸残基 以外的氨基酸残基，可以列举出，在通常构成蛋白质的氨基酸中，除甲硫氨酸残基、赖氨酸 残基以及亮氨酸残基以外的17种氨基酸残基。可以列举出更优选为异亮氨酸残基或者谷 氨酸残基。作为向野生型SAT基因中导入所期望的突变的方法，可以列举出定点突变。作 为突变型SAT基因，已知编码大肠杆菌的突变型SAT的突变型cysE (参考WO 97/15673号 国际公开小册子、特开平11-155571号)。携带了含有编码由谷氨酸残基取代第256位的甲 硫氨酸残基的突变型SAT的突变型cysE的质粒pCEM256E的大肠杆菌JM39-8菌株(大肠 杆菌JM39-8(pCEM256E)、内部编号AJ13391)，已经于平成9年(1997年)11月20日保藏于 工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1 丁目1番地3 号)，保藏号为FERMP-16527，并于2002年7月8日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并 给予保藏号FERM BP-8112。在本发明中，“对L-半胱氨酸反馈抑制为非敏感性”既可以指如上所述的通过修 饰而使得对L-半胱氨酸的反馈抑制变为非敏感性，也可以指原本就不受反馈抑制。已知 拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAT为不受L-半胱氨酸反馈抑制，在本发明中优选使 用。作为含有拟南芥来源的SAT基因的质粒，已知的有pEAS-m(FEMS Microbiol. Lett.， 179(1999)453-459)。此外，通过增强编码硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统蛋白质群的cysPTWAM基因簇的 表达，也可以提高L-半胱氨酸的生产能力(特开2005-137369号公报、EP1528108号说明 书)。此外，硫化物通过分别由cysK以及cysM基因编码的0-乙酰丝氨酸(巯基)_裂 解酶-A或者B催化的反应而被导入0-乙酰基-L-丝氨酸，从而产生L-半胱氨酸。因此， 通过增强编码这些酶的基因的表达也可以提高L-半胱氨酸的生产能力。用于增强目的基因的表达的修饰，可以例如，利用基因重组技术，通过提高细胞内 的目的基因的拷贝数来进行。例如，将含有目的基因的DNA片段，与在宿主细菌内发挥功能 的载体、优选多拷贝型载体连接从而制成重组DNA，并将其导入细菌进行转化即可。另一方面，目的基因的拷贝数的提高，可以通过使目的基因在细菌的染色体DNA 上以多拷贝存在而实现。向细菌染色体DNA上导入目的基因可以利用后面针对突变型yeaS 基因描述的方法。另外，目的基因表达的增强，除了上述增大基因拷贝数之外，通过如在国际公开 00/18935号小册子中记载的方法也可以实现将染色体DNA上或者质粒上的yeaS基因的 启动子等表达调节序列替换成强力的；或扩增增强目的基因的表达的调节子；或者缺失或 弱化降低目的基因表达的调节子。作为使目的基因表达降低的调节子，已知的有Lrp蛋 白质等(Kutukova et al.，FEBS Lett. 579. 4629-4634(2005))。作为强启动子，已知的 有例如Iac启动子、trp启动子、trc启动子等。此外，通过向目的基因的启动子领域内导 入碱基取代等，还可以修饰得到更强的启动子。通过这些启动子取代或者修饰可以强化 目的基因的表达。启动子强度的评价方法和强启动子的例子记载于Goldstein和Doi的论文(Goldstein, Μ. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryoticpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。而且，对表达调节序列的修饰也可以与提高目的 基因拷贝数的方法进行聚合。此外为了提高目的基因产物的生成，也可以在目的基因的翻 译起始点附近导入突变从而提高翻译效率，也可以将其与增强目的基因的表达相组合。对于目的基因表达的提高而言，可以通过将由该基因转录的mRNA的量与野生株、或者非修饰株相比较来进行确认。作为评价mRNA的量的方法，可以列举出Northern杂 交、RT-PCR 等(Sambrook, J. , et al. , MolecularCloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor LaboratoryPress, Cold spring Harbor(USA),2001)。使用抗体的蛋白质印记(Western blot)可以对目的基因产物量的增加进行确认 (上述 Molecular Cloning)。此外，通过抑制L-半胱氨酸分解系统，可以提高L-半胱氨酸的生产能力。抑 制L-半胱氨酸分解系统是指，细胞内的L-半胱氨酸的分解活性与野生株或者亲本 株等非修饰株相比有降低。作为承担L-半胱氨酸分解系统的蛋白质，已知的有胱硫 醚- β -裂解酶(metC 产物、特开平 11-155571 号，Chandraet. al.，Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 产物、特开 2003-169668，(Austin Newton et. al.， J. Biol. Chem. 240 (1965) 1211-1218) )、O-乙酰丝氨酸巯基水解酶B (cysM基因产物、特开 2005-245311)、以及malY基因产物(特开2005-245311)。通过使这些蛋白质的活性降低， 从而提高L-半胱氨酸的生产能力。使蛋白质的活性降低的修饰，例如，可以通过降低编码该蛋白质的基因的表达来 实现。具体来说例如，通过使染色体上的基因的编码区域的一部分或者全部缺损，可以降 低所述蛋白质的细胞内的活性。此外，通过修饰基因的启动子或shine-dalgarno(SD)序 列等表达调节序列等，也可以降低基因的表达。此外，对表达调节序列以外的非翻译区的修 饰也可以降低基因的表达量。而且，还可以缺失包括染色体上的基因的前后序列的整个基 因。此外，所述修饰还可以这样完成通过向染色体上的目标基因的编码区域导入氨基酸 取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一 二个核苷 酸的移码突变(Journal of biological Chemistry272 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences,USA955511-5515(1998),Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839 (1991))。此外，只要是可以使目的蛋白质的活性降低的修饰即可，也可以是通过X射线或 紫外线照射、或者N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理引起的修 饰。就表达调节序列的修饰而言，优选为1个核苷酸以上，更优选为2个核苷酸以上， 特别优选为3个核苷酸以上。此外，在缺失编码区域时，只要目标蛋白质的功能降低或缺失 即可，缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是整个编 码区域。通常，缺失的区域较长能够切实地使基因失活。此外，优选的是缺失区域的上游或 下游的读码框不一致。在目标基因的编码区域中插入其他序列时，可以为基因的任何区域，但插入的序 列较长时能够切实地使基因失活。插入部位的前后序列优选读码框不一致。对于其他序列 没有特殊限制，只要是能够降低或缺损编码的目的蛋白质的功能即可，可以列举例如携带抗生素抗性基因或对L-半胱氨酸生产有用的基因的转座子等。L-苏氨酸生产菌 作为具有L-苏氨酸生产能力的微生物优选实例可以列举出增强了 L-苏氨酸生物 合成系统酶的1种或2种以上的活性的细菌。作为L-苏氨酸生物合成系统酶，可以列举出 天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、thr操纵子所编码的天冬氨酸 激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基转移酶 (天冬氨酸转氨酶)(aspC)。括号里为该基因的缩略符号(下文中也同样)。这些酶中特别 优选天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶基因以及 苏氨酸合酶。也可以将L-苏氨酸生物合成系统基因导入苏氨酸分解受到抑制的埃希氏属 细菌中。作为苏氨酸分解受到抑制的埃希氏菌属细菌，例如可以列举出苏氨酸脱氢酶活性 缺损的TDH-6菌株(特开2001-346578号)。L-苏氨酸生物合成系统酶的活性受最终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构 建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生产菌合成系统进行修饰以使所述酶不受L-苏氨 酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化 子(attenuator)结构，苏氨酸操纵子的表达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并 且表达受到弱化作用的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现弱化作用 的消除或降低(Lynn, S. P.，Burton, W. S.，Donohue，T. J. , Gould, R. Μ.，Gumport，R. I., andGardner, J. F. J. Mol. Biol. 194 :59_69(1987)；国际公开第 02/26993 号小册子；国际公 开第2005/049808号小册子)。苏氨酸操纵子的上游存在天然启动子，可用非天然启动子将其取代(参考 W098/04715号小册子)，也可以构建苏氨酸操纵子使得苏氨酸生物合成的相关的基因的表 达受到λ噬菌体的阻遏物Oppressor)和启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说 明书)。此外，为了对细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对α -氨 基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌株来获得。对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而言，优选的 是其在宿主内的拷贝数升高，或者是将其连接于强启动子而增加表达量。除了通过使用质 粒的扩增来增加拷贝数，还可以通过使用转座子、Mu噬菌体等向基因组上转入苏氨酸操纵 子来提高拷贝数。理想的是，除了 L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强糖酵解系统、TCA、以及和 呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、和糖摄取基因。这些在L-苏氨酸生产中 有效的基因的实例可以列举出，转氢酶基因(PntAB)(欧洲专利733712号说明)、磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶基因(PepC)(国际公开95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因 (pps)(欧洲专利877090号说明书)、棒状杆菌型细菌或者芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶 基因(国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。此外，强化赋予L-苏氨酸抗性的基因、赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达，或对 宿主赋予L-苏氨酸抗性、L-高丝氨酸抗性，也是合适的。作为赋予抗性的基因的实例，可 以列举出rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 (2003))、rhtB基因(欧洲专利申请公开 第0994190号说明书)、rhtC基因(欧洲专利申请公开第1013765号说明书)、yfiK、yeaS 基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)。此外关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可以参考欧洲专利申请公开第0994190号说明书、国际公开第90/04636号小册子中所 记载的方法。L-苏氨酸生产菌或用于衍生L-苏氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举出下述 属于埃希氏菌属的菌株，但并仅限于下述菌株大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美 国专利第5，175，107号、美国专利第5，705，371号)、大肠杆菌472T23/pYN7 (ATCC 98081) (美国专利第5，631，157号)、大肠杆菌NRRL-21593 (美国专利第5，939，307号)、大肠杆菌 FERMBP-3756 (美国专利第 5，474，918 号)、大肠杆菌 FERM BP-3519 以及 FERMBP-3520 (美 国专利第 5,376,538 号)、大肠杆菌 MG442 (Gusyatiner et al.，Genetika(俄语)，14， 947-956(1978))、大肠杆菌 VL643 以及 VL2055 (EPl 149911A)等。TDH-6菌株缺损thrC基因，是蔗糖同化型，此外其ilvA基因具有泄露(leaky)突 变。此外该菌株的rhU基因也有突变，该突变赋予了对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗 性。B-3996菌株携带PVIC40质粒，且该pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC 操纵子插入到由RSF1010获得的载体中而获得。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激 酶高丝氨酸脱氢酶I的苏氨酸反馈抑制基本上已被解除。B-3996菌株于1987年11月19 日被保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics (全联盟抗生素科学中心) (Nagatinskaya Street 3-A，117105 Moscow，Russia)，保藏号为 RIA 1867。此夕卜，该菌株于 1987年4月7日被保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (1 Dorozhny proezd.，1 Moscow 117545，Russia)，保藏号为 B-3996。
大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792B)也可以作为L-苏氨酸生产菌或者用于衍 生L-苏氨酸生产菌的亲本株使用。B-5318菌株是非异亮氨酸营养缺陷型的，并且其质 粒PVIC40中的苏氨酸操作子的调控区域被温度敏感的λ噬菌体阻遏物和ra启动子所取 代。VKPM B-5318在1990年5月3日国际保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM， IDorozhny proezd.，IMoscow 117545，Russia)，保藏号为 VKPM B-5318。编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经阐明(核苷酸编 号 337 2799，GenBank 登录号 NC_000913. 2，gi 49175990)。thrA 基因位于大肠杆菌 K-12 染色体上thrL基因和thrB基因之间。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明 (核苷酸编号 2801 3733，GenBank 登录号 NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB 基因位于 大肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。编码大肠杆菌苏氨酸合酶的thrC 基因已经阐明(核苷酸编号3734 5020，GenBank登录号NC_000913. 2，gi =49175990)。 thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。这3个基因均 作为单独的一个苏氨酸操纵子发挥功能。为增加苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子中将 影响转录的弱化子区域去除(W02005/049808，W02003/097839)。编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA 基因，以及thrB基因和thrC基因，可以作为一个操纵子从熟知的pVIC40质粒中获得， 该质粒存在与苏氨酸生产株大肠杆菌VKPM B-3996中。有关pVIC40质粒在美国专利第 5，705，371中有详细的记载。rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上的18分钟处，并靠近编码谷氨酰胺转运系统 的成分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ORFl (ybiF基因，核苷酸编号764 1651，GenBank 登录号AAA218541，gi =440181)相同，位于pexB与ompX基因之间。已将表达由ORFl编码的蛋白质的单位命名为rhtA基因(rht 对高丝氨酸和苏氨酸有抗性)。此外，已经 证明了 rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的_1位置上的G — A取代(ABSTRACTS of the 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology, San Francisco, California August 24-29,1997, abstract No. 457, EP1013765A)。大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511 3571408，GenBank登录号 NC_000913. 1，gi 16131307)，且可以利用根据该基因的碱基序列制备的引物通过PCR获得 (参考 White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185 (1989))。其他微生物的 asd 基因也可以 通过相同的方法获得。
此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸编号983742 984932，GenBank登 录号NC_000913. 1，gi 16128895)，且可以通过PCR获得。其他微生物的aspC基因也可以 通过相同的方法获得。L-赖氨酸生产菌属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例可以列举出对L-赖氨酸类似物具有 抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是这种抑制在当 L-赖氨酸共存于培养基中时会被全部或部分解除。L-赖氨酸类似物的实例可以列举出、但 不限于，氧代赖氨酸，赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate), S_(2_氨乙基)_L_半胱氨酸 (AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。将属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱 变处理可以得到对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株。可用于L-赖氨酸生产的菌株的 具体实例可以列举出大肠杆菌AJ11442(参考FERM BP-1543,NRRL B-12185 ；参见美国专利 第4，346，170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈 抑制已被解除。作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株，可以列举出 L-赖氨酸生物合成系统酶的1种或者2种以上的活性被增强的菌株。作为涉及的酶 可以列举出，但不限于二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶 二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国 专利第6，040，160号)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基转移酶(aspC)、 二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰 Sl (dapD) (tetrahydrodipicolinicacid succinylase)、砠 白酉先 二 M 基庚 二酸月兑酉先 Bl (dapE) (succinyl di amino pimelic acid deacylase)以及天冬氨酸酶基因(aspA) (EP1253195A)。在这些酶中，特别优选为二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、 二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向 异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、以及琥珀酰二氨基庚二酸脱酰 酶。此外，可以增加在亲本株中下述基因的表达水平与能量效率相关的基因(cyo) (EP 1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利第5，830，716号)、71^飞基 因(W02005/073390)、或它们的组合。作为用于衍生L-氨基酸生产菌的亲本株的例子，可以列举催化通过从L-氨基酸 生物合成途径分支而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性减少或者缺损的菌株。作为催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之外的化合物的反应的 酶的例子，可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第5，827，698号)、和苹果 酸酶(W02005/010175)。对于酶活性的降低而言，可以通过例如、使染色体上的目标酶基因的编码区域的 一部分或者全部缺损、以及向编码区域中插入其他序列来实现。这样的手段也称为基因破 坏。此外，通过修饰目标基因的启动子或Shine-Cklgarno(SD)序列等表达调节序列等来降 低目标基因的表达，也可以使该基因失活。表达的降低中包括转录的降低和翻译的降低。此 夕卜，对表达调节序列以外的非翻译区的修饰也可以降低基因表达量。而且，还可以缺失包括染色体上的目标基因的前后序列的整个目标基因。此外，所 述目标基因的失活还可以这样完成通过向染色体上的目标基因的编码区域导入氨基酸取 代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失一 二个核苷酸 的移码突变(Journal of biologic alChemistry 272:8611—8617(1997)，Proceedings of the National Academy ofSciences, USA 955511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 266，20833-20839 (1991))。可以举出大肠杆菌WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2作为优选的L-赖氨酸生产菌株 (W02006/078039)。该菌株为从WC196菌株出发，破坏其编码赖氨酸脱羧酶的cadA以及IdcC 基因，并向其导入含有赖氨酸生物合成系统基因的PCABD2质粒(美国专利第6，040, 160 号)而构建的菌株。WC196菌株为从来源于大肠杆菌K-12的W3110菌株获取的菌株，该菌 株为用突变型IysC基因取代W3110菌株的染色体上的野生型IysC基因后，并通过赋予以 AEC抗性而培育的菌株(美国专利5，827，698)，该突变型IysC基因为编码用异亮氨酸取代 了第352位的苏氨酸从而解除了 L-赖氨酸的反馈抑制的天冬氨酸激酶III的突变型IysC 基因(美国专利第5，661，012号)。WC196菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，并于1994年12 月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究 所专利微生物保藏中心，邮编305-8566，日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保 藏号为FERM P-14690。其后根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日转为国际保藏， 并赋予保藏号FERM BP-5252(美国专利第5,827,698号)。WC196 Δ cadA Δ IdcC本身也为 优选的L-赖氨酸生产菌株。WC196 Δ cadA Δ IdcC被命名为AJl 10692，于2008年10月7日 在独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心(邮编305-8566，日本茨城县筑 波市东1 丁目1番地1中央第6)进行国际保藏，并赋予保藏号!7ERM BP-11027。pCABD2为含有下述基因的质粒编码具有解除了 L-赖氨酸反馈抑制的突变的编 码大肠杆菌来源的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)的突变型dapA基因、编码具有解除了 L-赖氨酸反馈抑制的突变的来源于大肠杆菌的天冬氨酸激酶III的突变型IysC基因、编码 大肠杆菌来源的二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因、编码乳发酵短杆菌来源的二氨基庚 二酸脱氢酶的ddh基因(国际公开第W095/16042、W001/53459号小册子)。L-亮氨酸生产菌L-亮氨酸生产菌或者用于衍生L-亮氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出、 但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株 57 (VKPM B-7386，美国专利第6，124，121号))或对亮氨酸类似物(包括β _2_噻吩基丙氨 酸、3-羟基亮氨酸、4-偶氮亮氨酸、5，5，5_三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌株(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)、通过W096/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆 菌菌株；大肠杆菌H-9068 (特开平8-70879号)等。可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达来改进本发明中 使用的细菌。这些基因的实例可优选列举以编码解除了 L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果 酸合酶的突变IeuA基因(美国专利第6，403，342号)为代表的、IeuAB⑶操纵子中的基 因。此外，可以通过增加编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种以上的基因的表 达来改进本发明中使用的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因) (EP1239041A2)。L-组氨酸生产菌 L-组氨酸生产菌或者用于衍生L-组氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出，但 不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPMB-5945，RU2003677)；大肠 杆菌 80 菌株(VKPM B-7270, RU2119536)；大肠杆菌 NRRL B-12116-B12121 (美国专利第 4，388，405 号)；大肠杆菌 H-9342(FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美国专利第 6，344，347 号)；大肠杆菌 H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)；大肠杆菌 AI80/pFM201 (美 国专利第6，258，554号)等。L-组氨酸生产菌或者用于衍生L-组氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出， 编码L-组氨酸生物合成系统酶的一种以上的基因的表达增加的菌株。作为涉及的基因，可 以列举出，ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisl)、磷 酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷 酸异构酶基因(hisA)、酰胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨 醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸所抑制，因此还 可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中导入诱导对反馈抑制有抗性的突变来有 效地增加生产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。具有L-组氨酸生产能力的菌株具体实例可以列举出FERM-P 5038和5048，已经向 其中导入了携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(特开昭56-005099号)，导入了用 于氨基酸输送的基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙 氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利2119536)等。L-谷氨酸生产菌L-谷氨酸生产菌或者用于衍生L-谷氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举 出，但不限于大肠杆菌VL334thrC+(EP 1172433)等属于埃希氏菌属的菌株。大肠杆菌 VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株，并且在thrC和ilvA基 因有突变(美国专利4，278，765)。利用可在野生型大肠杆菌菌株K12 (VKPM B-7)细胞中增 殖的噬菌体Pl，通过常规转化方法来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了 L-异 亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL334thrC+(VKPM B-8961)。L-谷氨酸生产菌或者用于衍生L-谷氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举出，但 不限于下述菌株，所述菌株为L-谷氨酸生物合成系统酶的1种或者2种以上的活性被增 强的菌株。涉及的基因的实例可以列举出，谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合酶(glnA)、 谷氨酸合酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、甲基柠檬酸合酶(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF， lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油 变位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛_3_磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异 构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡糖磷酸异构酶(pgi) 等。这些酶中，优选谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基柠檬酸合 酶。经修饰而增加了柠檬酸合成酶(citrate synthetase)基因、磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的菌株的实例可以列举出在EP1078989A、 EP955368A和EP952221A中公开的那些菌株。L-谷氨酸生产菌或用于衍生L-谷氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出如 下菌株，该菌株为减少或缺损催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支并合成L-谷氨酸 以外的化合物的酶的活性的菌株。作为这样的酶的实例，可以列举出，异柠檬酸裂合酶 (aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟酸 合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvl)、甲酸乙酰 转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(Idh)、谷氨酸脱 羧酶(gadAB)等。α-酮戊二酸脱氢酶活性的缺损、以及α -酮戊二酸脱氢酶活性的降低 的属于埃希氏菌属的细菌、以及获得这些细菌的方法在美国专利第5，378，616号以及第 5，573，945号中有所记载。作为具体实例可以列举出下述细菌。大肠杆菌 W3IIOsucA Kmr大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)大肠杆菌W3110sucA: :Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的α -酮戊二酸脱氢酶基 因(下面，也称为“sucA基因”)而得到的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺损。L-谷氨酸生产菌的其他实例还可以列举出属于埃希氏菌属，并且具有对天冬氨 酸代谢拮抗物的抗性的细菌。这些菌株也可以是α-酮戊二酸脱氢酶缺损的菌株，可以列 举出，例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利第5，908，768号)、进一步降低了 L-谷氨酸分解能力的FERM卩-12379(美国专利第5，393，671号)；AJ13138 (FERM BP-5565) (美国专利第6，110，714号)等。作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌的实例，可以列举出Pantoeaananatis AJ13355株。该菌株是作为低pH下能够在含有L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从 静冈县磐田市的土壤中分离出来的菌株。Pantoeaananatis AJ13355株已于1998年2月19 日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码305-8566 日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERM P-16644，并于1999年1 月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERM BP-6614。而且，该菌株在 分离时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)，并当作成团肠杆菌AJ13355进 行了保藏。但是，近年来，基于16S rRNA核苷酸序列分析等，该细菌被重新分类为Pantoea ananatisο此外，作为Pmtoea mmatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举出α -酮戊二酸脱氢酶(aKGDH)活性缺损、或者α KGDH活性降低的属于泛菌属的细菌。作为这样的菌株有AJ13355和α KGDH-El亚基基因(sucA)缺损而得到的菌株AJ13356 (美国专利第6，331,419 号)，以及从AJ13355株中作为粘液质低生产突变菌株选择出来的SC17株来源的sucA基因 缺损株SC17sucA(美国专利第6，596，517号)。AJ13355株已于1998年2月19日保藏于工 业技术院生命工学工业技术研究所(现为产业技术综合研究所专利生物保藏中心，邮政编 码305-8566茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号为FERMP-16645，并于1999 年1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERM BP-6616。AJ13355以 及AJ13356在上述的保藏机构中是作为Enterobacter agglomerans保藏的，但在本说明书 中，记载为Pantoeaananatis。此外，SC17sucA株的内部编号为AJ417株，已于2004年2月 26日保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-08646。此外，作为Pantoea ananatis的L-谷氨酸生产菌，可以列举出SC17sucA/ RSFCPG+pSTVCB 菌株、AJ13601 菌株、NP106 菌株以及 NAl 菌株。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB 株是在SC17sucA株中导入了包含大肠杆菌来源的柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶基因(PPsA)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG，以及导入了包含乳发酵 短杆菌来源的柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB而得到的菌株。AJ13601菌株是从该 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株中作为低pH下显示出对高浓度L-谷氨酸的抗性的菌株而选择 出的菌株。此外，NP106株是如实施例所述那样，质粒RSFCPG+pSTVCB从AJ13601株脱落而 得到的菌株。AJ13601菌株已于1999年8月18日保藏于独立行政法人产业技术综合研究 所专利生物保藏中心(地址邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央 第6)，保藏号为FERM P-17516，并于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约的国际保藏， 并给予保藏号FERM BP-7207。L-苯丙氨酸生产菌L-苯丙氨酸生产菌或者用于衍生L-苯丙氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列 举出，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸 阻遏物缺损的 E. coli AJ12739(tyrA: :TnlO, tyrR) (VKPMB-8197) (W003/044191),携带 了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶_预苯酸脱氢酶的突变型pheA34基因的E. coli HW1089 (ATCC 55371)(美国专利第 5，354，672 号)，E. coli MWEC101-b (KR8903681)、Ε· coli NRRL B-1214U NRRL B-12145、NRRL B-12146 以及 NRRL B-12147 (美国专利第 4，407，952 号)等。此外，也可以使用携带了编码解除了反馈抑制的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶基 因的大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大肠杆菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)以及 AJ 12604 和命名为大肠杆菌 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB] (FERM BP-3579)作为 亲本株(EP 488424B1)。此外，此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活 性增加的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473A1以及 2003/0157667AUW003/044192)。L-色氨酸生产菌L-色氨酸生产菌和用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举出，但 不限于下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/ PMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺损，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利第5，756，345号)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码对丝氨酸反馈抑制有抗性的磷 酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码对色氨酸反馈抑制有抗性的邻氨基苯甲酸合酶 (anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利第6，180，373号)；色氨酸酶缺 陷的大肠杆菌 AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美 国专利第4，371，614号)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50， 口八0 41口8(109708333，美国专利第6，319，696号)等。还可以使用由yedA基因或yddG 基因编码的蛋白质活性增强的属于埃希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开 2003/0148473A1和 2003/0157667A1)。L-色氨酸生产菌和用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出下述 菌株，该菌株的从邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、3_脱氧_D_阿拉伯 庚酮醛酸-7-磷酸合酶(3- r才# * -D- 7，if 7 7 a >酸-7- ij >酸* >夕一七) (aroG)、3_脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5_烯醇丙酮 酷莽草酸 3-憐酸合醇(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase) (aroA)禾口分支 酸合酶(aroC)、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中选择1种或2种以 上的酶的活性被增强。预苯酸脱水酶以及分支酸变位酶作为2个功能酶(CM-PD)，由pheA 基因编码。在这些酶中，特别优选磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸 合酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶、 分支酸合酶、预苯酸脱水酶、分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油 酸脱氢酶两者均受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此也可以向这些酶中导入使反馈 抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大 肠杆菌SV164菌株和通过将质粒pGH5 (W0 94/08031)转入大肠杆菌SV164获得的菌株，所 述质粒PGH5包含突变的serA基因，该突变的serA基因编码反馈抑制被解除了的磷酸甘油 酸脱氢酶。L-色氨酸生产菌或者用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出， 导入了色氨酸操纵子的菌株，所述色氨酸操纵子包含编码抑制解除型邻氨基苯甲酸合酶的 基因(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利4，371，614)。此外，可以也通过 增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色 氨酸合酶由a和0亚基组成，这两种亚基分别由trpA和trpB编码。另外，还可以通过增强 异柠檬酸裂解酶_苹果酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(W02005/103275)。L-脯氨酸生产菌L-脯氨酸生产菌或者用于衍生L-脯氨酸生产菌的亲本株的实例，可以列举出， 但不限于下述埃希氏菌属的菌株，如ilvA基因缺陷并且能够产生L-脯氨酸的大肠杆菌 702ilvA(VKPM B-8012) (EP 1172433)等。可以通过增强涉及L-脯氨酸生物合成的1种以上的基因的表达来改进本发明中 使用的细菌。用于L-脯氨酸生产菌的优选基因的实例可以列举出，编码解除了 L-脯氨酸 反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利第3127361号)。此外，可以通过增加编码 从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的1种以上的基因的表达来改进本发明中使用的细菌。 这些基因包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的实例NRRLB-12403和NRRLB-12404(英国专利第2075056号)，VKPM B-8012 (俄罗斯专利申请2000124295)，德国专 利第 3127361 中描述的质粒突变体，Bloom F. R.等(The 15th Miami Winter Symposium, 1983，p.34，等)。L-精氨酸生产菌L-精氨酸生产菌或用于衍生L-精氨酸生产菌的亲本株，可以列举出，但不限于 下述属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请公开 2002/058315A1)，及携带了突变的 N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase) 的衍生菌株(俄罗斯专利申请第2001112869号)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926) (EP1170358A1)，导入了编码 N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的 argA基因的精氨酸生产株(EP1170361A1)等。L-精氨酸生产菌或用于衍生L-精氨酸生产菌的亲本株，可以列举出，编码L-精 氨酸生物合成酶的1种以上基因的表达增加的菌株。涉及的基因的实例可以列举出N-乙 酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因 (argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸 合成酶基因(argG)、精氨琥珀酸裂合酶基因(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶基因(carAB)。L-缬氨酸生产菌 L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出，但不 限于经修饰而过量表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利第5，998，178号)。优选将衰减 所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此 夕卜，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。L-缬氨酸生产菌或用于衍生L-缬氨酸生产菌的亲本株的实例还可以列举出，具 有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利第5，658，766号)。例如，可以使用大肠杆菌 VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970 在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM) (IDorozhny Proezd.， IMoscowl 17545，Russia)，保藏号为 VKPM B-4411。此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变株和/或缺乏H+-ATP酶 的突变株(W096/06926)作为亲本株。L-异亮氨酸生产菌L-异亮氨酸生产菌或用于衍生L-异亮氨酸生产菌的亲本株的实例可以列举出、 但不限于对6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突变株(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物 如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变株，以及对DL-乙硫 氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变株(特开平5-130882号)。此 夕卜，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白质(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合 酶(acetohydroxate synthase)等)的基因转化的重组菌株(特开平2-458号，FR0356739， 和美国专利第5，998，178号)作为亲本株。L-酪氨酸生产菌作为酪氨酸生产菌的例子，可以列举出具有不受酪氨酸抑制的脱敏型预苯酸脱水 酶基因(tyrA)的埃希氏菌属细菌(欧洲专利申请公开1616940号公报)。为了提高本发明中使用的细菌的甘油同化型，可以弱化glpR基因的表达(EP1715056)，也可以强化 glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、 tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa 以及 talC 基因等甘油代谢基因(EP1715055A)的表达。(突变型yeaS基因)本发明的细菌可以通过修饰如上所述具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的 细菌，从而使其携带具有特定突变的突变型yeaS基因而获得。但是，也可以在对细菌进行 上述修饰后，赋予其L-氨基酸生产能力。对于“特定的突变”将在后面 进行描述。将不具 有所述特定突变的yeaS基因称为“野生型yeaS基因”。对于不具有所述特定突变的yeaS 基因，只要具有增强其在肠杆菌中的表达时、能够使L-半胱氨酸的生产能力与非修饰株相 比有所提高的活性即可，即使有其他的突变，也称为野生型yeaS基因。下面，针对于yeaS基因进行说明。作为本发明的yeaS基因，具体地可以列举出含有SEQ ID NO :1中所示的碱基序 列的基因。SEQ ID NO :1表示的是大肠杆菌的野生型yeaS基因的碱基序列。此外，SEQ ID NO 1表示了该基因编码的氨基酸序列。已知通过增强yeaS基因的表达，可以提高各种氨基酸的生产能力 (FEBSLett. 579. 4629-4634 (2005))，但是对于L-半胱氨酸和yeaS基因之间的关系尚属未 知。本发明人发现通过增强yeaS基因的表达，可以提高L-半胱氨酸的生产能力。yeaS基因，只要编码具有下述活性的蛋白质即可，所述活性是指当增强该蛋白 质在肠杆菌中的表达时，与非修饰株相比，能够使L-氨基酸生产能力提高。yeaS基因也可 以为编码具有在上述氨基酸序列中，在1个或数个位置上取代、缺失、插入或添加1个或者 数个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质的基因。在这种情况下，增强在肠杆菌中的表达 时与非修饰株相比使L-氨基酸生产能力提高的活性的含义是指，与取代、缺失、插入或添 加1个或数个氨基酸之前的蛋白质相比，保持了 70%以上的活性，优选保持了 80%以上，更 优选保持了 90%以上的活性。而且，上述“1个或数个”根据氨基酸残基在蛋白质的立体结 构中的位置或者氨基酸残基的种类有所不同，但具体来说优选为1 20个、更优选为1 10个，更为优选为1 5个。上述的1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或者添加为可以正常维持蛋白质的 功能的保守突变。保守突变的代表为保守取代。保守取代是指，当取代部位为芳香族氨基 酸时，在Phe、Trp、Tyr之间相互取代；当取代部位为疏水性氨基酸时，在Leu、lie、Val间 之间相互取代；当为极性氨基酸时，在Gin、Asn之间相互取代；当为碱性氨基酸时，在Lys、 Arg、His之间相互取代；当为酸性氨基酸时，在Asp、Glu之间相互取代；当为具有羟基的氨 基酸时，为在Ser、Thr之间相互取代的突变。可视为保守取代的取代具体的可以列举出， 用 Ser 或 Thr 取代 Ala、用 GlruHis 或 Lys 取代 Arg、用 Glu、Gln、Lys、His 或 Asp 取代 Asn、 用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp、用 Ser 或 Ala 取代 Cys、用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gin、用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu、用 Pro 取代 Gly、用 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr 取 代 His、用 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代 lie、用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu、用 Asn、Glu、 GlruHis 或 Arg 取代 Lys、用 Ile、Leu、Val 或 Phe 取代 Met、用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取 代Phe、用Thr或Ala取代Ser、用Ser或Ala的取代Thr、用Phe或Tyr的取代Trp、用His、 Phe或Trp取代Tyr、以及用Met、Ile或Leu的取代Val。此外，就上述这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或者倒位等而言，还包括因基因来源的细菌的个体差异、种间差异等情 况而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或者倒位。作为编码保持提高宿主细胞的L-氨基酸生产能力的活性、且具有取代、缺失、插 入或添加1个或者数个氨基酸而得到的氨基酸序列的YeaS蛋白质的基因，具体来说，可以 列举出，编码具有选自下述突变中的1种或2种以上突变的YeaS蛋白质等的基因，所述突 变是指在SEQ ID NO 2中，具第11位的色氨酸残基被甘氨酸取代的突变、第33位的赖氨 酸残基被精氨酸取代的突变、第52位的异亮氨酸残基被缬氨酸取代的突变、第59位的苯丙 氨酸残基被丝氨酸取代的突变、第60位的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代的突变、第65位的缬 氨酸残基被谷氨酸取代的突变、第72位苏氨酸残基被丙氨酸取代的突变、第77位天冬酰胺 残基被丝氨酸取代的突变、第85位苯丙氨酸残基被异亮氨酸取代的突变、第86位酪氨酸残 基被苯丙氨酸取代。这些突变，在下述的实施例2中被推定为没有使活性降低的沉默突变。 此外，保守突变并不仅限于上述突变，如实施例2所示的一样，从人为的向yeaS基因内导入 随机突变而得到的突变体中，也可以获得编码下述YeaS蛋白质的基因，该YeaS蛋白质维持 了增强在肠杆菌中的表达时使L-氨基酸生产能力提高的活性、且具有1个或数个氨基酸被 取代而得到的氨基酸序列。 此外，也可以为下述蛋白质，该蛋白质与具有上述这样的保守突变的基因编码的 氨基酸序列全体相比，具有80%以上的同源性，优选具有90%以上、更优选具有95%以上、 更为优选具有97%以上、特别优选具有99%以上的同源性，且增强其在肠杆菌中的表达时 与非修饰株相比具有使L-半胱氨酸生产能力提高的活性。编码上述这样的与yeaS具有同 源性的蛋白质的基因(yeaS同源物)的序列信息，可以以上述大肠杆菌菌株的野生型yeaS 基因作为提问序列，使用BLAST检索或FASTA检索，从公开的数据库中容易地获取，可以通 过使用基于该公知的基因序列作成的寡核苷酸作为引物获得yeaS同源物。而且，在本说明 书中，“同源性(homoloyg)”有些情况下是指“同一性(identity)”。此外，yeaS基因只要编码具有增强其在肠杆菌中的表达时与非修饰株相比具有使 L-氨基酸生产能力提高的活性的蛋白质即可，还可以为与上述碱基序列互补的序列、或者 能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交的基因。“严格条件”可以列举出下述条 件，例如在60°C，1 X SSC、0. 1 % SDS优选0. 1 X SSC、0. 1 % SDS相当的盐浓度下，洗涤1次优 选2 3次的条件。上述杂交用探针也可以为基因的互补序列的一部分。这样的探针，可以以基于公 知的基因序列制得的寡核苷酸为引物，以包含这样的碱基序列的DNA片段为模板，通过PCR 反应来制备。当作为探针使用300bp左右长度的DNA片段时，上述杂交的洗涤条件可以列 举出为 50°C、2XSSC、0. 1% SDS0就增加在肠杆菌中的表达时与非修饰株相比具有使L-氨基酸生产能力提高的活 性而言，是指赋予下述能力的活性，所述能力为增加了在肠杆菌中的表达时，与非修饰株， 例如与野生株或亲本株相比，可以生产更多数量的L-氨基酸，例如L-半胱氨酸，并在培养 基中积累的能力，优选赋予可以积累高达0. lg/L以上、更优选高达0. 2g/L以上、特别优选 高达0. 3g/L以上L-氨基酸的能力的活性。是否具有增加在肠杆菌中的表达时与非修饰株相比具有使L-氨基酸生产能力提 高的活性，可以通过下述方法确认，基于野生株或亲本株制作使编码该蛋白质的基因的表达增强的细菌，将其在培养基中培养，并定量培养基中积累的L-氨基酸的量。L-氨基酸为 L-半胱氨酸时，野生株或亲本株可以列举出在大肠杆菌MG1655菌株中使编码解除了反馈 抑制的突变型SAT基因增强了的菌株。 为了得知是否具有增加在肠杆菌中的表达时与非修饰株相比具有使L-氨基酸生 产能力提高的活性，也可以通过该基因的表达被增强了的细菌在含有比野生株或亲本株浓 度更高的L-氨基酸的培养基中的生长繁育比野生株或亲本株的生长繁育更为良好来确 认，即，通过调查L-氨基酸抗性来容易地得到确认。L-氨基酸为L-半胱氨酸时，具体来说， 可以在含有0. 1 IOmM左右的L-半胱氨酸的培养基中接种细菌，在10小时 120小时后 的适当时间测定菌落的直径，通过该数值大于野生株或亲本株进行确认。本发明人等发现 与非修饰株相比使宿主细胞的L-半胱氨酸生产能力提高的活性与L-半胱氨酸抗性之间具 有相当的相关关系。在所述突变型yeaS基因中的“特定突变”是指，具体来说从下述(I) (III)中 选择的突变。(I)在yeaS基因编码的蛋白质中，第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所 取代的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中，第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨 基酸所取代的突变，(III)在yeaS基因编码的蛋白质中，第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基 酸所取代的突变。所述(I) (III)的突变，具体来说，可以分别举出下述⑴ (iii)的突变。(i)第28位的苏氨酸残基被天冬酰酰胺所取代的突变，(ii)第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸以 及甘氨酸中任一个所取代的突变，(iii)第188位的亮氨酸残基被谷氨酰胺所取代的突变。突变可以为上述任1种突变，也可以为任意的2种、或3种突变的组合。特别优选的所述突变为，所述(ii)的突变中的第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸 或谷氨酰胺所取代的突变。所述(I) (III)的突变中的第28位、第137位或第188位是指，不一定总是表 示从yeaS基因编码的蛋白质(YeaSN)的N末端起算的绝对位置，有时还表示相对于SEQ ID NO :2中记载的氨基酸序列的相对位置。例如，在含有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的 YeaS蛋白质中，当第28位的N末端侧的位置发生一个氨基酸残基缺失时，所述第28位就变 成了 27位。在这样情况下，第27位的氨基酸残基在本发明中仍然是“第28位”的氨基酸 残基。氨基酸取代的绝对位置，可以通过将对象的YeaS蛋白质的氨基酸序列和SEQ ID NO 2的氨基酸序列进行比对来决定。向yeaS基因中导入(I) (III)的各种突变可以通过下述方法实现，例如，通过 定点突变法或重叠延伸法(overlap extension)等，向野生型YeaS基因的对应突变的密码 子导入指定突变来实现。突变后的密码子只要是编码指定的氨基酸的密码子即可，没有特 殊的限制，但优选使用在目的肠杆菌中使用频率较高的密码子。向细菌的染色体上的yeaS基因中导入选自所述(I) (III)中的突变，可以通过使含有突变点的突变型yeaS基因或其片段与染色体上的相当于yeaS基因的部分进行取代 来进行。此外，也可以将突变型yeaS基因或含有该基因的载体转化到细菌中。在这种情况 下，突变型yeaS基因可以携带在染色体上，也可以携带在质粒上。此外，染色体上的野生型 yeaS基因可以是保持不变的，也可以为缺损的。此外，细菌携带的突变型yeaS基因，可以为1个拷贝，也可以为2个拷贝或以上。 并且，用于使突变型yeaS基因表达的启动子可以为野生型yeaS基因的启动子，也可以为其 他启动子，例如Iac启动子、trp启动子、trc启动子等。作为用于转化的质粒，可以列举出能够在使用的微生物中自主复制的质粒。例如， 作为在属于肠杆菌科的微生物中可以自主复制的质粒，可以列举出PUC19、pUC18、pBR322、 RSFlO 10、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229 (pHSG、 pSTV、pTWV 可从 TAKARABio 公司获得)，pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW 可从 NIIPONGENE公司获得)等。此外，作为棒状杆菌型细菌用的质粒，可以列举出pAM330 (特开 昭 58-67699 号公报)、pHM1519 (特开昭 58-77895 号公报)、pSFK6 (参 考特开 2000-262288 号公报)、pVK7(美国专利申请公开说明书2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特 开昭58-192900号公报)、pCGl (特开昭57-134500号公报)、pCG2 (特开昭58-35197号公 报)、pCG4、pCGll (特开昭57-183799号公报)、pHK4 (特开平5-7491号公报)等。作为转化方法，可以举出例如基于大肠杆菌K-12而报道的，用氯化钙处理受 体菌细胞来增加DNA的透过性的方法(Mandel, M.和Higa, A.，J. Mol. Biol. 1970，53， 159-162)，或者基于枯草芽孢杆菌而报道的，由处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导 入 DNA 的方法(如 Duncan，C. H. ,Wilson,G. Α.和 Young，F.E·· , 1997. Gene 1 :153_167)。或 者，也可以利用基于枯草杆菌、放线菌类和酵母而已知的，将DNA受体菌的细胞制备成容易 导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重组DNA导入DNA受体菌的方法(Chang， S.和 Choen，S.N. , 1979. Mol. Gen. Genet. 168 111-115 ；Bibb,Μ. J. ,Ward, J. M.和 Hopwood， 0. A. 1978. Nature 274 :398_400 ；Hinnen, Α. ，Hicks, J. B.禾口 Fink，G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :1929-1933)。此外，采用电脉冲法(特开平2-207791号公报)也能够进 行微生物的转化。此外，向细菌中导入突变型yeaS基因，可以像下面就突变型yeaS基因所描述 的那样，通过向宿主微生物的染色体上导入而实现。为了向微生物的染色体上导入突 变型yeaS基因，可以通过使用转座子或Mini-Mu向染色体上随机导入的方法(特开平 2-109985号公报、US5, 882，888EP805867B1)，或者利用在染色体DNA上多拷贝存在的序列 作为靶标，通过同源重组来进行。作为在染色体DNA上多拷贝存在的序列，可以利用重复 DNA(repetitiveDNA)、存在于转座元件端部的反向重复序列。或者，可以通过采用Red驱动 整合法(W02005/010175)将目的基因导入到染色体上。此外，还可以使用Pl噬菌体等噬菌 体进行转导，或者利用接合转移载体将目的基因导入到染色体上。此外，如在W003/040373 中所记载的一样，还可以以生产目的物质时不必须的基因作为靶标导入突变型yeaS基因。 在这样的方法中可以向靶标序列上1个拷贝或多个拷贝地导入突变型yeaS基因。染色体上转移了目的基因的确认，可以通过使用具有与目的基因或其中的一部分 相互补的序列的探针进行Southern杂交，或使用基于目的基因的序列制备的引物通过PCR 等进行确认。
<2>本发明的L-氨基酸的生产方法在培养基中培养通过上述方法得到的本发明的细菌，并通过从该培养基中采集 L-氨基酸，可以生产L-氨基酸。L-氨基酸也可以为L-氨基酸的衍生物。当L-氨基酸为 L-半胱氨酸时，作为L-半胱氨酸的衍生物，可以列举出上述的S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍 生物、相当于该噻唑烷衍生物的硫代半酮缩醇等。作为使用的培养基，可以列举出含有碳源、氮源、硫源、无机离子以及需要的其他 有机成分的通常的培养基。作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉水解物等糖类、富马酸、 柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮、氨 气、氨水等。作为硫源，可以列举出硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、连二亚硫酸盐、硫代硫酸盐等无 机硫化物。
作为有机微量营养源，优选适量含有维生素Bl等必需物质或者酵母提取物等。除 此之外，根据需要可以少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。培养在需氧的条件下进行30 90小时较好，培养温度为25V 37°C，且优选将 培养中的PH控制在5 8的范围内。此外，可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质， 以及氨气等来调节PH值。就培养结束后从培养基溶液中采集L-氨基酸而言，在本发明中不需要特别的方 法。本发明中采集出的L-氨基酸除了含有作为目标的L-氨基酸之外，还可以含有微生 物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物等。采集的L-氨基酸的纯度为50% 以上，优选为 85% 以上，特别优选为 95% 以上(US5，431，933，JP1214636B, US4，956，471， US4, 777，051，US4946654, US5, 840358，US6, 238，714，US2005/0025878)。可以通过组合已经公知的离子交换树脂法(Nagai，H. et al. =SeparationScience and Technology，39 (16) ,3691-3710)、膜分离法(特开平 9-164323 号、特开平 9-173792 号)、晶析法(W02008/078448、W02008/078646)、以及其他的方法采集L-氨基酸。通过上述方法得到的L-半胱氨酸，可以用来生产L-半胱氨酸的衍生物。作为L-半 胱氨酸的衍生物包含甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸(carbocysteindjt 代半胱氨酸、乙酰半胱氨酸等。此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中积累时，通过使噻唑烷衍生物和 L-半胱氨酸之间的反应平衡向L-半胱氨酸一侧移动，可以生产得到L-半胱氨酸。此外，当 S-硫代半胱氨酸在培养基中积累时，例如可以使用二硫苏糖醇等还原剂通过进行还原转化 得到L-半胱氨酸。
实施例以下，针对于本发明的实施例进行更具体的说明。(实施例1)通过强化野生型YeaS使得L-半胱氨酸生产增加的效果为了研究由于增强了在P. ananat i s中野生型yeaS基因的表达而对于L-半 胱氨酸生产产生的影响，构建了导入了编码突变型SAT的基因cysE5(美国专利申请第20050112731号)、且提高了 yeaS基因的拷贝数的菌株。
首先，构建了用于构建上述菌株的质粒。其方法如下所示。以大肠杆菌MG1655 (ATCC No. 47076)的染色体 DNA 为模板，使用 Pl (agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac :SEQ ID NO 20) I^l 及 P2 (agctgagcatgcttccaact gcgctaatga cgc =SEQ ID NO :21)作为引物，通过PCR获得了含有nlpD基因的启动子区域 (以下，将野生型nlpD基因启动子记为“PnlpO”)约300bp的DNA片段。在上述引物的5， 末端和3’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及PaeI的位点。PCR循环如下所述95°C 3 分钟后，95 °C 60 秒、50 "C 30 秒、72 °C 40 秒循环 2 次，94 V 20 秒、55 °C 20 秒、72 °C 15 秒循环 25 次，最后在72°C下5分钟。用SalI以及PaeI处理得到的片段，并将其插入到pMIV_5JS (特 开2008-99668)的SalI-PaeI位点中，得到pMIV-PnlpO质粒。在该质粒pMIV-PnlpO中插 入的PnlpO启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO 5所示。随后，以MG1655的染色体DNA为模板，使用P3 (agctgatcta gaaaacagaatttgcctggc ggc :SEQ ID NO 22)禾口 P4 (agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc =SEQ ID NO :23)作为引物，通过PCR获得了含有rrnB基因的终止子区域约300bp的DNA 片段。在上述引物的5’末端分别设计了限制性内切酶XbaI以及BamHI的位点。PCR循环 如下所述95°C 3分钟后，95°C 60秒、50°C 30秒、72°C 40秒循环2次，94°C 20秒、59°C 20 秒、72°C 15秒循环25次，最后在72°C下5分钟。用XbaI以及BamHI处理得到的片段，并将 其插入到pMIV-PnlpO的XbaI-BamHI位点处从而得到pMIV-PnlpO_ter质粒。接下来，以MG1655的染色体DNA为模板，使用P5 (agctgagtcg acgtgttcgctgaatacggg gt :SEQ ID NO 24) IMM P6 (agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc =SEQ ID NO :25)作为引物，通过PCR获得了含有yeaS基因的约700bp的DNA片段。在 上述引物的5’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及XbaI的位点。PCR循环如下所述 950C 3 分钟后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、55°C 20 秒、72°C 15 秒循环25次，最后在72°C下5分钟。用SalI以及XbaI处理得到的片段，并将其插入到 pMIV-PnlpO-ter 的 SalI-XbaI 位点处从而得到 pMIV-PnlpO_YeaS3 质粒。由此，在 pMIV_5JS 载体上，构建了按照nlpD启动子、yeaS基因以及rrnB终止子的顺序连接的yeaS的表达单兀。为了通过修饰nlpD启动子的-10区域来得到更强的启动子，采用下述方法进行 了 -10区域的随机化。在nlpD启动子区域(图1)中存在两个推测为起启动子功能的区域， 在图中分别由pnlpl和pnlp2表示。以质粒pMIV-PnlpO为模板，使用Pl以及P7 (atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatnangtcactgg( "n_，，表不可以为 a, t, g, c 中的任意一种)，SEQ ID NO 26)作为引物，通过PCR获得了将包含于nlpD启动子的3’末 端侧的-10区域(记为-IO(Pnlpl))随机化而得的DNA片段(图1)。PCR循环如下所述 950C 3 分钟后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 15 秒循环25次，最后在72°C下5分钟。另一方面，同样地以质粒pMIV-PnlpO为模板，使用P2以及 P8 (tggaaaagatcttcannnnn cgctgacctg cg(a, t, g, c Φ ^Ι Μ一ft ) SEQ IDNO 27)作为引物，通过PCR获得了将包含于nlpD启动子的5，末端侧的-10区域 (记为-10(Pnlp2))随机化而得的DNA片段(图1)。PCR循环如下所述95°C 3分钟后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 15 秒循环 25 次，
最后在72 °C下5分钟。可以通过在引物P7和P8上设计的BglII位点将得到的3’末端侧和5’末端侧的片段连接，并可以构建2个-10领域被随机化的完整nlpD启动子。以该片段为模板，使用 Pl以及P2作为引物，通过PCR获得了修饰型完整nlpD启动子的DNA片段。PCR循环如下 所述95°C 3 分钟后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、 720C 15秒循环12次，最后在72°C下5分钟。用在引物的5’末端上设计的限制性内切酶SalI以及PaeI处理扩增的片段，并通 过将其插入到同样地用SalI以及PaeI处理的质粒pMIV-PnlpO-YeaS3中，将质粒上的野生 型nlpD启动子部位(PnlpO)替换成突变型Pnlp。从其中选择了具有如图1所示的启动子 序列(Pnlp8)的质粒，并将其命名为pMIV-Pnlp8-YeaS7。插入在该质粒中的Pnlp8启动子 的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID N0:6所示。同样地，将含有突变的nlpD启动子 区域的DNA片段插入到用SalI以及PaeI处理了的质粒pMIV-PnlpO-ter上，从而将该质 粒上的nlpD启动子部位(PnlpO的部分)替换为突变型Pnlp。将其中的一个质粒命名为 pMIV-Pnlp23-ter。该质粒中插入的Pnlp23启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO :7所示。随后，从 pMW-Pomp-cysE5(W02005007841)中，用 Pael、SacI 将 Pomp_cysE5 盒 (cassette)的部分切出，插入到pMIV_5JS的相同位点处，从而构建了 pMIV-Pomp-CysE5。 pMW-Pomp-cysE5为将编码连接于ompC基因启动子的突变型SAT的基因cysE5插入到 PMW118中而得到的质粒。从pACYC184 (GenBank/EMBL登录号X06403、可从NIIP0NGENE公司 获得)上，用XbaI、Eco88I将四环素抗性基因切出，将该基因片段通过克列诺片段(Klenow fragment)处理后,插入至Ij pMIV-Pomp-CysE5 的 PvuI 位点处,从而构建了 pMT_Pomp-CysE5。 接下来，用HindIII酶切pMIV-Pnlp8-YeaS7，并通过克列诺片段进行平滑末端化后，用NcoI 进行酶切，将含有PnlpS-YeaS-rrnB终止子的盒和氯霉素抗性标记的片段切出。将该片 段和，同样以PMIV-5JS为骨架(backbone)的pMT_Pomp-CysE5的Smal、NcoI酶切片段相 连接，从而构建了 pMT-EY2。pMT-EY2为在一个质粒上具有Pnlp8-YeaS_rrnB终止子盒和 Pomp-CysE5盒的质粒。为了研究增强野生型yeaS基因的表达对L-半胱氨酸生产所产生的效果，将按 照上述方法构建的pMT-Pomp-CysE5和pMT_EY2导入P. ananatisSC17菌株(美国专利 6596517)，并对得到的转化菌株的L-半胱氨酸生产能力进行了评价。在培养中使用了 L-半胱氨酸生产培养基(组成15g/L硫酸铵，1.5g/L磷酸二氢 钾，lg/L硫酸镁七水合物，0. lg/L胰蛋白质胨，0. 05g/L酵母提取物，0. lg/L氯化钠，20g/L 碳酸钙，40g/L葡萄糖，20mg/L四环素)。L-半胱氨酸生产培养按照下述规程进行。将SC17/pMT-PompCySE5菌株和SC17/ PMT-EY2菌株在LB琼脂培养基上涂开，在34°C下进行过夜预培养，之后用接种环挑取平板 的八分之一的菌体，并接种到已经放入大试管(内径23mm、长度20cm)的2mL的L-半胱氨 酸培养基中，在220-230rpm下在32°C下进行振动培养，2天后结束培养。对培养基中产生 的 L-半胱氨酸的定量，通过 Gaitonde，Μ. K. (Biochem J. 1967Aug ； 104 (2) :627_33·)记载 的方法进行。如表1所示，可以得知增强yeaS基因的表达，具有使L-半胱氨酸的生产量增加的效果。此外，在此定量的L-半胱氨酸除了 L-半胱氨酸之外，还包括L-胱氨酸或它们 的衍生物，例如S-硫代半胱氨酸、噻唑烷衍生物或者硫代半酮缩醇、或者它们的混合物，以 下如果没有特别的记载，则通过本方法定量的L-半胱氨酸均具有相同含义。[表 1]表1在SC17菌株中强化yeaS的效果 (实施例2)获得突变型yeaS基因和L-半胱氨酸生产增加效果下面，为了获得与野生型YeaS相比使宿主细胞的L-半胱氨酸生产能力提高的活 性较高的突变体，通过易错(error-prone)PCR人为地向yeaS基因内导入随机突变。(DyeaS的易错PCR和突变导入文库的制作首先，对于向yeaS基因中导入1 3个突变的易错PCR的条件，在现有知识(Evert Bokma et al. ， (2006)FEBS Letters 580 :5339_5343、Zao et al. ， (1998)Nat Biotechnol Mar ； 16 (3) :258_61)的基础上进行研究。DNA聚合酶使用taqpolymerase (QIAGEN公司 制造)，反应液组成为 IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 3)、50mMKCl、7mM MgCl2、0. 2mM dGTP，dATP、 ImM dCTP，dTTP以及12. 5μΜ MnCl20引物使用了分别添加了 NcoI位点和PstI位点的 Ρ9 (catgccatgg tcgctgaatacggggttctg, SEQ ID NO 禾口 PlO (aactgcagtc aggattgcag cgtcgcc, SEQ ID NO :29)，通过 94°C 5 分钟后，94°C 30 秒、50°C 45 秒、72°C 45 秒循环 50 次， 最后在72°C下7分钟的PCR循环进行扩增。将反应液分装于16个独立的PCR管中进行反 应，从而使得突变没有偏向。用NcoI和PstI酶切扩增得到的片段，将其与通过同样的酶处理的pTrC99_Kmr相 连接，并转化到大肠杆菌JM109菌株中。此外，pTrC99-Kmr为按照下述方法制备的质粒，该 质粒为用DraI限制性内切酶处理pTrc99A (GenBank/EMBL登录号M22744，可以从Amershanm Bioscience公司获得)，将氨苄青霉素抗性基因除去，并在该位置上插入卡那霉素抗性基 因的质粒。以pACYC177 ((GenBank/EMBL登录号X06402、可从NIIP0NGENE公司获得))为模 板，使用 Pll (aaagccacgt tgtgtctcaa aatc, SEQ IDNO :30)禾口P12 (ggtgttgctg actcatacca ggc，SEQ ID NO 31)作为引物，通过94°C 1分钟后，94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 75秒循环 30次、最后在72°C下5分钟的PCR程序进行扩增从而获得卡那霉素抗性基因。将上述转化体在含有25mg/L的卡那霉素的LB琼脂培养基上筛选，以从得到的 菌落中随机挑选的菌株为模板，使用P13(gacaattaat catccggctc g，SEQ ID NO 32)禾口 P14(tttatcagac cgcttctgcg, SEQ ID NO :33)作为引物，进行 94°C 5 分钟后，98°C 5 秒、 60°C 10秒、72°C 45秒循环30次，最后在72°C下2分钟的PCR程序，对转化菌株中携带导入 突变的yeaS进行了确认。将平板上的全部菌落取下来，通过WizardR Plus MidiprepsDNA ^itM^ (WizardR Plus Midipreps DNA purification System) (Promega ^w] ) [ηΙ^Μ 粒，得到文库。(2)以L-半胱氨酸抗性为指标筛选突变型yeaS
利用电穿孔法将得到的文库导入MG1655中，并涂布在分别含有3mM、6mM的L-半 胱氨酸的M9选择平板(12. 8g/L磷酸氢二钠七水合物、3. Og/L磷酸二氢钾、0. 5g/L氯化钠、 1. Og/L氯化铵、2mM硫酸镁、0. 4%葡萄糖、0. ImM氯化钾、25mg/L卡那霉素、1. 5%琼脂糖) 上。将该选择平板放置在37°C下经过2晚培养后，在含有6mM的L-半胱氨酸的M9选择平 板上得到不足100个抗性菌株，在含有3mM的L-半胱氨酸的M9选择平板上得到200 300 个抗性菌株。从含有6mM的L-半胱氨酸的平板上获得的菌落中分离出单菌落80株、以及 从含有3mL的L-半胱氨酸的平板上得到的菌落中分离出12株单菌落，并将这些菌落作为 模板，使用P13和P14作为引物，通过94°C 5分钟后，98°C 5秒、60°C 10秒、72°C 45秒循环 30次，最后在72°C下2分钟的PCR程序对质粒上的含有yeaS基因区域的DNA片段进行扩 增。用作为测序引物的P13对这些片段的碱基序列进行测序，确认yeaS基因内的突变导入 部位。将碱基序列可读的克隆中重复的克隆分组之后，从有代表性的克隆中提取出质粒，并 将其导入到下述L-半胱氨酸生产菌中，进行培养评价。得到的克隆中，有相当一部分包含 了 T28N突变，获得了许多如表2所示那样的导入了 T28N的同时还导入了其他突变的2重、 3重突变菌株。此外，也获得了多株包含F137S突变的克隆。另外也获得了单独具有L188Q 突变的克隆。(3)为了确认突变型yeaS的效果而构建L-半胱氨酸生产 菌_1 (向P. ananatis SC17菌株中导入了 cysE5、突变型yeaS)上述的pMT-EY2具备来源于pMIV_5JS (特开2008-99668)的Mu噬菌体附着位 点(attachment site)。由于该质粒和具有Mu转座酶(Mu transposase)的辅助质粒 pMHIO (Zimenkov D. et al.，Biotechnologiya(俄语)，6，1-22 (2004))可以在同一细胞内 共存，因此可以将该质粒PMT-EY2上以被Mu噬菌体的附着位点夹持的形式存在的含有氯霉 素抗性标记的PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB终止子盒，插入到P. ananatis SC17 (美国专 利6596517)菌株的染色体上。而且，由于在质粒PMT-EY2上存在的氯霉素抗性标记具有夹 在2个λ噬菌体的辅助位点(XattR和XattL)之间的结构，因此通过后述的方法可以将 氯霉素抗性标记除去。首先，将通过电穿孔向SC17菌株中导入了 pMHIO而得到的菌株，在含有20mg/L卡 那霉素的LB琼脂培养基上，在30°C下过夜培养来进行了选择。将得到的转化菌株在30°C下 培养，并进一步通过电穿孔向该菌株中导入PMT-E2。将用pMHIO和pMT_EY2这两者转化的 菌株，在42°C，20分钟的条件下进行热击，之后在含有20mg/L氯霉素的LB琼脂培养基上筛 选氯霉素抗性菌株的菌落。此时培养温度为39°C。通过上述方法，获得约50个克隆，通过 分别在LB琼脂培养基上在39°C下培养48小时，进行pMHIO以及pMT_EY2的消除(curing)。 通过在染色体上插入了盒来显示出氯霉素抗性，且消除了两个质粒后的结果获得了对卡那 霉素以及氨苄青霉素显示敏感性的菌株。随后，以该菌株的染色体DNA为模板，使用Pl和 P6作为引物通过PCR，确认了得到的菌株的染色体上目的盒的插入。得到的全部克隆分别 命名为EYOl EY50，并进行EYOl EY50的L-半胱氨酸生产培养。培养使用上述实施例 1所示的方法。结果，筛选出L-半胱氨酸生产量最多的克隆EY19菌株。通过来源于λ噬菌体的切出系统除去ΕΥ19菌株中导入的氯霉素抗性标记。具体 来说，将携带了 λ噬菌体的Int-Xis基因的pMT-Int-Xis2(W02005/010175)转化到EY19 菌株中，从得到的转化菌株中获得了显示氯霉素敏感性的EY19(s)菌株。
(4)为了确认突变型yeaS的效果而构建L-半胱氨酸生产菌_2(由EY19(s)菌株制作cysPTWA基因表达强化菌株)接下来，为了强化cysPTWA基因的表达，将染色体上的在cysPTWA基因簇上游存在 的启动子，替换为上述的强启动子Pnlp8。首先以pMIV-Pnlp8-YeaS7为模板，使用Pl以及 P2通过PCR获得含有nlp8启动子的约300bp的DNA片段。PCR循环如下所述95°C 3分钟 后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、59°C 20 秒、72°C 15 秒循环 20 次，最后在72°C下5分钟。将扩增得到的含有nlp8启动子的DNA片段利用克列诺片段处理后插入到用XbaI 酶切后通过克列诺片段处理的质粒pMW118-U att L-KmR-λ attR) (W02006/093322A2) 上，从而得到了质粒pMW-Km-Pnlp8。将pMW-Km-Pnlp8作为模板使用，并使用引物 P15(tccgctcacg atttttttca tcgctggtaaggtcatttat cccccaggaa aaattggtta, SEQ ID NO 34)以 及 P16 (tttcacaccg ctcaaccgcagggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg，SEQ ID NO 35)进行 PCR，扩增得到含有 Km_Pnlp8 盒的约 1. 6kb 的 DNA 片 段。此时的PCR循环如下所述95°C 3分钟后，95°C 60秒、50°C 30秒、72°C 40秒循环2次， 940C 20秒、54°C 20秒、72°C 90秒循环30次，最后在72°C下5分钟。在两个引物上设计有 为 了通过 λ 依赖整合(被称为“Red-driven integration”的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97，No. 12，p6640_6645))而插入目的片段的染色体上的靶标的序列(这种 情况下为cysPTWA启动子附近的序列)。因此，在将得到的DNA片段通过该λ依赖整合插 入到目的菌株中时，在染色体上的cysPTWA基因的邻近前方插入了 Km-PnlpS，从而形成了 在nlp8启动子上连接了 cysPTWA基因的结构。在SEQ ID NO 12中显示了 cysPTWA基因簇 的碱基序列，在SEQ ID NO 13 15中显示了 cysP、cysT、cysW各基因编码的氨基酸序列。 SEQ ID N0:16、17分别显示了 cysA基因的碱基序列，以及该基因编码的氨基酸序列。P. ananatis SC17 (0)/RSF-Red-TER菌株是用于使λ依赖整合效果更好地进行 的宿主菌株，该菌株中导入了在对λ Red基因产物具有抗性的P. ananatis菌株SC17 (0) 菌株中表达λ的gam、bet以及exo各基因(以下称为“ λ Red基因”)的辅助质粒 RSF-Red-TER(W02008/075483)。SC17(0)株于2005年9月21保藏于俄罗斯国立工业微生
(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms (VKPM) ,GNII Genetika)(地址Russia，1175451 Moscow, IDorozhny proezd. 1)，保藏号 VKPM B-9246。 此外，该质粒RSF-Red-TER的构建方法在W02008/075483中有详细地记载。在添加用于诱导λ Red基因的表达的IPTG的条件下培养上述SC17 (0) / RSF-Red-TER菌株，制备了电穿孔用的细胞。通过电穿孔向这些细胞中导入了上述的目 的DNA片段，以卡那霉素抗性为指标，通过λ依赖整合，获得了在cysPTWA基因上游插入 了 nlp8启动子的重组菌株。以获得的菌株的染色体DNA为模板，使用P17 (ctttgtccct ttagtgaagg, SEQ ID NO 36)禾口 P18 (agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac,SEQ ID NO 37)作为引物，通过PCR反应，确认形成了目标的Km-Pnlp8-cysPTWA结构， 并将该菌株命名为SC17(0)-Pnlp8-PTWA菌株。接下来，纯化SC17 (0) -Pnlp8-PTWA菌株的染色体DNA，将10 μ g该染色体DNA通过 电穿孔法导入到EY19(s)菌株中，获得卡那霉素抗性菌株。以得到的菌株的染色体DNA为 模板，使用P17、P18作为引物利用PCR进行扩增，从而确认了在EY19(s)菌株的染色体上导入了 Km-Pnlp8-CySPTWA结构。将通过上述方法获得的菌株命名为EYP197菌株。进一步， 使用上述的PMT-Int-Xis2，将卡那霉素抗性标记从染色体上除去，将变为卡那霉素敏感性 的菌株命名为EYP197(s)菌株。(5)为了确认突变型yeaS的效果而构建L-半胱氨酸生产菌_3(由EYP197(s)菌 株制作携带了突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglyceratedehydrogenase) (serA348) 基因的菌株)作为向L-半胱氨酸生产菌导入的3-磷酸甘油酸脱氢酶，通过下述的方法构建了 serA348基因，该基因是编码来源于Pantoea ananatis的3_磷酸甘油酸脱氢酶的基因，其 编码用丙氨酸取代了第348位的天冬酰胺残基的突变型酶(N348A) (J. Biol. Chem. 1996 ； 271(38) 23235-8)。Pantoea ananatis来源的野生型serA基因的序列如SEQ ID NO :10所示。为 了得到导入了上述突变的serA基因的3’侧的DNA片段，进行下述操作，以SC17菌株染 DNA ^jHIS., jiffi P19 (agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactggaa, SEQ ID NO :38)禾口 P20 (gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc, SEQ IDNO 39)作为弓丨物进行 PCR(95°C 3 分钟后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 60 秒循环 25次，最后在72°C下5分钟)。接下来，为了同样地获得导入了突变的5’侧的DNA片段， 以 SC17 菌株染色体 DNA 为模板，使用 P21(agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg，SEQID NO 40)和 P22 (aaaaccgccc gggcgttctc ac, SEQ ID NO 41)作为引物进行 PCR(95°C 3 分 钟后，95°C 60 秒、50°C 30 秒、72°C 40 秒循环 2 次，94°C 20 秒、60°C 20 秒、72°C 20 秒循环 20 次，最后在72°C下5分钟)。通过限制性内切酶SmaI处理得到的两个PCR片段之后，通过 DNA连接酶进行连接，得到含有目的突变(N348A)的突变型serA基因全长的DNA片段。以 该DNA片段为模板，使用P19和P21作为引物，进行PCR扩增((95°C 3分钟后，95°C 60秒、 50 "C 30秒、72 °C 40秒循环2次，94"C 20秒、60 "C 20秒、72 °C 75秒循环15次，最后在72 °C下 5分钟)。利用Sall.Xbal处理在P19和P21引物上设计的Sal I ,XbaI限制性内切酶位点 之后，将其插入到同样用SalI、XbaI处理的pMIV-Pnlp8_ter中，制得pMIV-Pnlp8_serA348。构建的pMIV-Pnlp8-serA348 上携带了来源于 pMIV_5JS (特开 2008-99668)的 Mu 附着位点。如果使用该质粒，则如上所述，通过使用具有Mu转座酶的辅助质粒pMHIO，可以 将含有氯霉素抗性标记的Pnlp8-serA348-rrnB终止子盒插入到P. ananatis SC17菌株的 染色体上。在SC17(0)菌株中导入了质粒pMIV-Pnlp8-serA348以及pMHIO，获得了在染色 体上插入了 Pnlp8-serA348-rrnB终止子盒的菌株。使用引物PI、P21通过PCR反应，确认 了目的盒存在于细胞中。针对得到的50个克隆，测定细胞提取液中的3-磷酸甘油酸脱氢 酶的活性，筛选活性最高的菌株，将其命名为SC17int-serA348菌株。接下来，将10 μ g的 SC17int-serA348染色体DNA通过电穿孔导入到EYP197 (s)菌株中，获得了氯霉素抗性菌 株，使用引物P1、P21通过PCR反应，确认了在EYP197(s)菌株的染色体上与氯霉素抗性标 记一起导入了 Pnlp8-serA348的结构。将这样得到的菌株命名为EYPS1976菌株。通过上述的使用pMT-Int-Xis2的标记除去方法，将氯霉素抗性标记除去，并将变 为氯霉素敏感性的菌株命名为EYPS1976(s)菌株。(6)为了确认突变型yeaS的效果而构建L-半胱氨酸生产菌_4(由EYPS1976(s) 菌株制作携带了 0-乙酰-L-丝氨酸-巯基水解酶-B(cysM)基因的菌株)
首先，为了在适当强度的启动子上克隆cysM基因，制作了新启动子。首先，以 P. ananatis SC17菌株的基因组为模板，获得了含有nlpD基因的启动子区域约180bp的DNA 片段 ° 使用弓 I物 P23 (agctgaaagc ttgcatgcacgcgtggcgat ctggcctgac tgc, SEQ ID NO: 42)禾口 P24 (￡igctg￡igtcg accccgtggtggcaaccttt aaaaaactg, SEQ ID NO :43)，弓 L 的5’末端分别设计了限制性内切酶SalI以及PaeI位点。PCR循环如下所述95°C 5分钟 后，94°C 20秒、59°C 20秒、72°C 20秒循环27次，最后在72°C下5分钟。
在SEQ ID NO 14中显示了大肠杆菌cysM基因的碱基序列，在SEQ IDNO 15中显 示了该基因编码的氨基酸序列。使用SalI以及PaeI处理得到的DNA片段，并将其插入到同样用SalI以及PaeI 处理的 pMIV-PnlpO-ter 中，获得了 pMIV-Pnlp4_ter。在该质粒 pMIV-Pnlp4_ter 中插入 的启动子Pnlp4的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ IDNO 8中所示。同样地，以质粒 pMIV-Pnlp4-ter 为模板，使用弓丨物 P23 以及 P25 (agctgagtcg acnnngtggt ggcaaccttt aaaaaactg ( “η-” 表示可以为 a, t, g, c 中的任意一种)，SEQ ID NO :44)，通过 PCR(95°C 5 分钟后，94°C 20秒、59°C 20秒、72°C 20秒循环27次，最后在72°C下5分钟)，制得了在 nlpD启动子5’末端侧含有的_7 -9区域被随机化的DNA片段，用SalI以及PaeI处理， 并将其插入到用同样的酶处理后的pMIV-PnlpO-ter中，从而得到pMIV-Pnlpl-ter。在该 pMIV-Pnlpl质粒中插入的Pnlpl启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO 9所 示。-7 -9区域表示从nlpD启动子的转录起始位点起5’侧的第7个碱基到第9个碱基 的位置。在上述的载体中整合了由大肠杆菌MG1655菌株克隆的cysM基因。具体来说，以 大肠杆菌MG1655菌株的基因组为模板，使用引物P26(agctgagtcgacgtgagtac attagaacaa acaat, SEQ ID NO 45)禾口 P27 (agctgatcta gaagtctccgatgctattaa tcc, SEQ ID NO 46) 通过PCR(95°C 5分钟后，98°C 5秒、50°C 10秒、72°C 60秒循环30次，最后在72°C下2分 钟)进行扩增。利用Sail、XbaI限制性内切酶处理这样得到的DNA片段，并将其插入到用 相同的酶处理的pMIV-Pnlp4-ter以及pMIV-Pnlpl-ter中，从而制得pMIV-Pnlp4_CysM禾口 pMIV-PnlpI-CysM0使用上述构建的pMIV-Pnlp4_CysM和pMIV-Pnlpl-CysM，通过使用上述的pMHIO 的方法，分别获得了在SC17菌株的染色体上插入了含有cysM基因的盒的菌株。将通过上 述方法制得的菌株命名为SC17int-4M和SC17int-lM，并从各菌株中提取染色体DNA。将 10μg该染色体DNA通过电穿孔导入到EYP1976(S)菌株中，获得了氯霉素抗性株。将上述 制得的菌株分别命名为EYPSint-4M、EYPSint-lM，通过上述的使用pMT-Int_Xis2的标记除 去方法，进行氯霉素抗性标记的去除，将变为氯霉素敏感性的菌株命名为EYPSint-4M(s)、 EYPSint-IM(s)菌株。(7)突变型yeaS对L-半胱氨酸生产带来的影响向如上所述制得的L-半胱氨酸生产菌EYPSintlM(s)中，从上述实施例2、(2)中 得到的突变型yeaS基因中选择几种，导入到到此为止构建的L-半胱氨酸生产菌中，进行 L-半胱氨酸生产培养。将评价对象菌株在LB琼脂培养基上涂开，在34°C下进行过夜预培 养，用IOyL大小的接种环(NUNC公司制造)从平板上挑取约7平方厘米范围的菌体，并按 照培养开始时刻的菌体量基本相同的方式接种到已经放入大试管(内径23mm、长度20cm)的2mL的L-半胱氨酸培养基(组成15g/L硫酸铵，1. 5g/L磷酸二氢钾，lg/L硫酸镁七水 合物，0. lmg/L硫胺盐酸盐，1. 7mg/L硫酸亚铁七水合物，0. 15mg/L钼酸钠二水合物，0. 7mg/ L氯化钴六水合物，1. 6mg/L氯化锰四水合物，0. 3mg/L硫酸锌七水合物，0. 25mg/L硫酸铜水 合物，0. 6g/L胰蛋白胨，0. 3g/L酵母提取物，0. 6g/L氯化钠，20g/L碳酸钙，135mg/L L-组 氨酸盐酸盐一水合物，4g/L硫代硫酸钠，2mg/L吡哆醇盐酸盐，20g/L葡萄糖，20mg/L卡那霉 素，ImM IPTG)中。在32°C下进行振动培养，葡萄糖消耗用尽的时刻终止培养(约15 19小时)，定 量在培养基中生产的L-半胱氨酸。表2中的测试No. 1、2为进行了 3 5次的平行实验， 测试No. 3为单一实验，并分别独立的进行了 2回。结果得到的L-半胱氨酸生产量的平均 值和标准偏差如表2所示。上述通过筛选系统得到的突变体，在L-半胱氨酸的生产培养中 也是有效的。从结果可知，至少第28位、第188位上的突变可以单独地具有效果。此外，在 L-半胱氨酸生产能力提高的多个菌株中发现了含有第137位突变(F137S)的3重突变。由 此，可以认为F137S可以单 独地与提高L-半胱氨酸的生产能力相关。此外，从各种解析可 知，可以认为在第11位、33位、52位、59位、60位、65位、72位、77位、85位以及86位上的 突变为不会使YeaS蛋白质的活性降低的沉默突变。[表 2]表2筛选得到的菌株的培养评价 (8)在yeaS基因中导入代表突变，以及对突变导入菌株在液体培养基中的L-半胱 氨酸抗性评价将第137位的苯丙氨酸被丝氨酸所取代的F137S突变单独地导入yeaS基因，通过 将突变型基因加载于PSTV29 (TAKARABio公司)，对该突变单独的效果进行研究。
通过重叠(Overlap)PCR,制作组合了目的突变和yeaS自身的启动子、终止子的载 体。首先，设计含有突变的弓丨物 P28(cgataaactg tacgaaagacgacacataga ac, SEQ ID NO: 47)，同时使用 P29(cgcggatcca gtggtcattt agtgc，SEQ ID NO 48)作为引物，以大肠杆菌 MG1655的基因组为模板，通过PCR扩增得到DNA ‘片段1，。此外PCR程序为94°C 5分钟 后，98°C 5秒、55°C 10秒、72°C 45秒循环30次、，最后在72°C下2分钟。随后，使用P9和 P30 (cgcggatcc t gtgggatttg aagcatcc，SEQ ID NO 49)，进行程序为 94°C 5 分钟后，98 °C 5 秒、55°C 10秒、72°C 60秒循环30次，最后在72°C下2分钟的PCR反应，扩增得到DNA ‘片 段2’。对于得到的各片段，在琼脂糖凝胶电泳后将条带切出，进行纯化。将DNA ‘片段1’ 和DNA ‘片段2，混合并稀释10倍后作为模板，使用引物P29和P30，进行94°C5分钟后， 980C 5秒、55°C 10秒、72°C 1分钟10秒循环30次，最后在72°C下2分钟的PCR反应，与上 述相同，在琼脂糖凝胶电泳后纯化扩增的DNA片段。使用BamHI酶切纯化产物和载体pSTV29之后，对载体使用CIAP(TAKARABio公 司)进行末端去磷酸化处理后，将它们连接，并将得到的质粒转化到JM109中。从转化子 中提取质粒，得到了携带了突变型yeaS基因的pSTV-YeaSF137S，其中该突变型yeaS基因 编码第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸所取代的YeaS。此外，作为对照，构建了结构与该 pSTV-YeaSF137S相同的携带了野生型yeaS基因的pSTV-YeaSWT。但是，由于不需要导入突 变，因此省略了制作‘片段1’和‘片段2’的步骤，以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以 P29和P30为引物通过PCR方法获得了含有yeaS基因的片段。接下来，确认了突变型yeaS基因导入菌株在液体培养基中的L-半胱氨酸抗性。 向大肠杆菌 MG1655 中转化 pSTV-YeaSWT 和 pSTV_YeaSF137S，制得了 MG1655/pSTV_YeaSWT 和MG1655/pSTV-YeaSF137S。将各菌株接种于含有25mg/L氯霉素和0. 4%葡萄糖的M9 培养基(Sambrook et al. , Molecularcloning, 3rd edition, 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press)中，在37°C下培养24小时获得种子培养液。将该种子培养液按1/50 的接种量接种于新准备的M9培养基中。在37°C下培养14小时后，测定这些菌的在660nm 处的吸光度(0D660)。调整所有试验菌株的菌浓度，使得与其中0D660最小的试验菌株的 0D660相匹配，之后接种于已经装入含有200 μ M的L-半胱氨酸的Μ9培养基的L字型试管 中，接种量为1/100。将该L-字型试管设置在自动OD测定培养装置(BI0-PH0T0REC0RDER TN-1506(ADVANTEC公司))中，每10分钟测定0D660并由此观察生长繁育情况。从而，通 过判断在上述培养基中开始生长繁育的早晚，评价各试验菌株的L-半胱氨酸抗性的不同。 在该培养中，L-半胱氨酸的抗性越高，0D660越早开始上升，抗性越低则0D660越晚开始上 升，即表观上无法确认生长繁育的时间(lag)将变长。该生长繁育曲线如图2所示。如图 2所示的一样，具有F137S突变的YeaS(YeaSF137S)与野生型YeaS (YeaSWT)相比，0D660值 较早开始上升，说明其被赋予了 L-半胱氨酸抗性。(9)YeaSF137S对L-半胱氨酸生产的影响在含有L-半胱氨酸的M9培养基中，为了确认YeaSF137S强化菌株的L-半胱氨酸 生产能力，该YeaSF137S强化菌株比YeaSWT强化菌株显示了更高的L-半胱氨酸抗性，构建 了连接有更强的PnlpS启动子支配下的编码YeaSF137S的基因的质粒。将该质粒导入到 L-半胱氨酸生产菌EYPSint-4M中，确认L-半胱氨酸生产的效果。首先，以pSTV-YeaSWT、 pSTV_YeaSF137S 为模板，使用 P31(aagtcgacgt gttcgctgaa tacggggttc tg, SEQ ID NO:50)、P32(aatctagatc aggattgcag cgtcgcc, SEQ ID NO 51)作为引物，进行程序为 94°C 5 分钟后，98°C 5秒、60°C 10秒、72°C 60秒循环30次，最后在72°C下2分钟的PCR反应，扩 增了在5，端和3，端上分别添加了 SalI和XbaI的yeaSWT基因片段以及yeaSF137S基因 片段。并与上述的pMIV-Pnlp8 —起，进行SalI和XbaI酶切，并连接，将连接反应物转化到 JM109中。从各转化子中提取各质粒，并导入L-半胱氨酸生产菌株EYPSint-4M(s)中，分别 得到了 EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSWT、EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSF137S。此外，作为 对照也制作了仅导入载体的EYPSint-4M/pMIV-5JS，按照上述(3)中所述的方法进行试管 培养评价。但是，将葡萄糖浓度变更为40g/L，并且变更为不添加IPTG。结果如表3所示。可知使用YeaSWT强化仅使L-半胱氨酸些许增加，而通过 YeaSF137S强化却大幅提高了 L-半胱氨酸的生产。也就是说，可以认为YeaSF137S与以往 的YeaSWT相比，大幅地提高了与非修饰株相比使宿主细胞的L-半胱氨酸生产能力提高的 活性。[表 3] 表3在半胱氨酸生产菌株中强化YeaSWT以及YeaSF137S的效果 (10)YeaSF137S对大肠杆菌L-半胱氨酸生产的影响对在大肠杆菌(E. coli)中yeaS基因表达增强的效果进行了研究。首先，构建携带了突变型cysE基因的质粒。具体来说，如特开2005-137369中记 载的pACYC-DES构建方法，其中省略了携带编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢 酶脱氢酶的突变型serA5基因(美国专利第6，180，373号中所述)的步骤，构建了质粒 pACYC-DEl.该pACYC-DES为携带了上述突变型serA5、编码反馈抑制被解除了的突变型SAT 基因的cysEX基因，以及编码L-半胱氨酸、乙酰丝氨酸分泌因子的ydeD基因(US5972663A) 的质粒，与此相对在本次构建的pACYC-DEl中，不含有serA5，而携带了 cysEX以及ydeD。各 基因的表达均使用ompA启动子。如下述所示，预计YeaS与L-半胱氨酸的分泌相关，但在对YeaSF137S的效果进 行评价时，考虑到L-半胱氨酸的分泌因子ydeD产物可能会提高背景值。因此，为了确认 YeaSF137S的实际效果，使pACYC-DEl中的ydeD基因缺损。用MnuI处理pACYC-DEl，并通过 自连接，构建了使ydeD基因ORF内侧约330bp缺损的质粒。由此，使作为L-半胱氨酸分泌因 子发挥功能的YdeD不表达，该仅搭载了 CysEX的质粒命名为pACYC_El。将该质粒pACYC_El 转化到大肠杆菌MG1655中，制得了 MG1655/pACYC-El菌株。将该MG1655/pACYC_El菌株作 为宿主，将搭载了野生型yeaS基因的质粒pMIV-PnlpS-yeaSWT、搭载了突变型yeaS基因的 质粒pMIV-Pnlp8-yeaS137、以及作为对照的pMIV_5JS，分别通过电穿孔导法导入到该宿主 中。按照与实施例1所示的方法相同的条件，通过试管培养对得到的菌株的L-半胱氨酸生 产进行研究(表4)。此外，在试管培养中，对各菌株分别进行了 4组平行实验，表中显示的是其平均值。可以得知由于yeaS基因以及突变型yeaS基因的表达量的增强，提高了在具 有L-半胱氨酸生产能力的大肠杆菌中的L-半胱氨酸的生产量。即，确认了 yeaS基因产物 即使对于具有L-半胱氨酸生产能力的大肠杆菌，也可以显示出与非修饰株相比使宿主细 胞的L-半胱氨酸生产能力提高的活性。[表 4]表4在大肠杆菌半胱氨酸生产菌株中强化YeaSWT以及YeaSF137S的效果 (ll)YeaSF137S 的特性解析从到此为止的结果可以明确YeaSF137S对于L-半胱氨酸的生产是有用的。作为理 由，可以考虑是由于提高了 L-半胱氨酸的分泌能力，但为了研究对其他氨基酸分泌能力的 影响，用 0. IN 盐酸稀释将上述的 EYPSint-4M/pMIV-5JS、EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSWT、 EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSF137S共计3株菌株的试管培养后的培养基各3个样品稀释 20倍，并利用氨基酸分析器(L-8500(日立制作所制造))对各种L-氨基酸进行定量。结果 如图3所示。与YeaSWT相比，YeaSF137S分泌了各种L-氨基酸，特别是分泌的L-亮氨酸 从21mg/L增加到656mg/L。从上述内容可知，通过用丝氨酸取代YeaS的第137位的苯丙氨 酸残基，不仅可以促进L-半胱氨酸在培养基中的积累，还可以促进L-亮氨酸、L-苏氨酸、 L-丝氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸等等其他氨基 酸的积累。因此，可以推测YeaSF137S也可以促进上述这些氨基酸的分泌。因此，YeaSF137S 对于这些氨基酸的发酵生产是有利的。此外，对于大肠杆菌MG1655，同样地制作了导入了 pMIV-5JS、pMIV-Pnlp8_YeaSWT、 pMIV-Pnlp8-YeaSF137S的菌株，并在与EYPSint-4M(s)的培养相同的条件下，进行试管 培养，并对该培养基进行了与上述相同的氨基酸分析。结果如图4所示。对于大肠杆菌， YeaSF137S也可以促进甘氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、 L-缬氨酸、以及L-谷氨酸的积累，从而对于这些氨基酸的发酵生产是有利的。(12)对于YeaS的第137位被其他氨基酸残基所取代的效果的研究当YeaS的第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸以外的其他氨基酸所取代时，研 究了其对L-半胱氨酸生产产生的影响。首先，以pMIV-PnlpS-YeaS为模板，使用引物 P33(aaacgtgagg aaatacctgg,SEQ ID NO 禾口P34(cgBtaaactg tacgaannnc gacacataga ac( “η-”表示可以为a，t，g，c中的任意一种)，SEQ ID NO 53)，通过PCR扩增了 DNA ‘片 段1，。此外，PCR程序为94°C 5分后，98°C 5秒、60°C 10秒、72°C 1分钟循环30次，最后在 72°C下1分钟。此外，同样地使用P31和P32在该循环下扩增了 DNA‘片段2，。将‘片段1， 和‘片段2’混合并稀释10倍后作为模板，使用P32和P33作为引物通过上述程序进行重叠 PCR，将得到的DNA片段纯化后，用SalI和XbaI处理，并将其导入到用同样的酶处理后的上 述pMIV-Pnlp23载体中，制得了 pMIV-Pnlp23-YeaSF137*。通过测序确认，将搭载了突变型yeaS基因的质粒通过电穿孔法导入到大肠杆菌MG1655菌株中，其中该突变型yeaS基因为 导入了第137位的苯丙氨酸被丝氨酸以外的其他氨基酸所取代的突变的突变型yeaS基因， 并将上述菌株平铺在按照与上述同样的方法制作的含有ImM的L-半胱氨酸的M9选择平板 上，并在37 °C下培养，研究L-半胱氨酸抗性。结果，以苯丙氨酸(WT)为基准对L-半胱氨酸抗性进行评价，发现除丝氨酸(S)以 外的谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、组氨酸(H)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)的取代体也可以提高 对L-半胱氨酸的抗性水平。特别是谷氨酰胺取代体(F137Q)的L-半胱氨酸抗性非常强。在此，用SalI和XbaI处理pMIV-Pnlp23_YeaSF137Q，并将其插入到由 同样的酶处理的pMIV-Pnlp8中，制作了连接有在pnlp8支配下的yeaSF137Q的 pMIV-Pnlp8-YeaSF137Q。对其进行P. ananatis的L-半胱氨酸生产培养。作为对象，使用 导入了 pMIV-Pnlp8-YeaSWT、或 pMIV-Pnlp8-YeaSF137S 的 EYPSint-lM( s)。该结果如表 5 所示。对于第137位的苯丙氨酸被谷氨酰胺所取代的突变型YeaS(YeaSF137Q)而言，可以 知道其与非修饰株相比使宿主细胞的L-半胱氨酸生产能力提高的活性，比野生型YeaS有 所提高。[表 5]表5在半胱氨酸生产菌株中强化YeaSWT、YeaSF137S以及YeaSF137Q的效果 如上所示，可以得知增加突变型yeaS的表达量引起的L-半胱氨酸抗性的获得与 L-半胱氨酸生产量的增加之间的关联性。这一点可以认为是由于L-半胱氨酸的抗性提高 促进了 L-半胱氨酸向细胞外的分泌。由此，可以认为在含有L-半胱氨酸的M9选择平板上 具有了 L-半胱氨酸抗性提高的效果的、第137位的苯丙氨酸被丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸、 或者甘氨酸所取代的各突变型yeaS也同样具有使L-半胱氨酸生产提高的效果。为了验证 上述结论，可以通过下述方法进行确认按照与构建上述pMIV-Pnlp8-YeaSF137Q的相同的 方法，制作 pMIV-Pnlp8-YeaSF137A、pMIV-Pnlp8_YeaSF137H、pMIV-Pnlp8_YeaSF137C、以及 pMIV-Pnlp8-YeaSF137G,并将它们导入到EYPSint-lM(s)中并进行L-半胱氨酸生产培养。(序列表说明)SEQ ID NO 1 野生型yeaS基因的碱基序列SEQ ID NO 2 野生型YeaS的氨基酸序列SEQ ID NO 3 野生型cysE基因的碱基序列SEQ ID NO 4 野生型cysE编码的丝氨酸乙酰转移酶的氨基酸序列SEQ ID NO 5 =PnlpO 的碱基序列SEQ ID NO 6 :Pnlp8 的碱基序列SEQ ID NO 7 :Pnlp23 的碱基序列SEQ ID NO 8 :Pnlp4 的碱基序列
SEQ ID NO 9 =Pnlpl 的碱基序列SEQ ID NO 10 =Pantoea ananatis 野生型 serA 基因的碱基序列SEQ ID NO 11 =Pantoea ananatis野生型serA基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 12 :cysPTWA基因簇的碱基序列 SEQ ID NO 13 :cysP基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 14 :cysT基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 15 :cysW基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO :16 :cysA基因的碱基序列SEQ ID NO 17 :cysA基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO :18 :cysM基因的碱基序列SEQ ID NO 19 :cysM基因编码的氨基酸序列SEQ ID NO 20 53 引物 Pl P3权利要求
一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力、且经过了修饰从而携带具有选自下述(I)～(III)中的突变的突变型yeaS基因的属于肠肝菌科的细菌，并从该培养基收集L-氨基酸(I)在yeaS基因编码的蛋白质中，第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所取代的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中，第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨基酸所取代的突变，(1II)在yeaS基因编码的蛋白质中，第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基酸所取代的突变；其中，没有所述突变的yeaS基因编码下述(A)或(B)中的任一种蛋白质(A)具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有在SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产能力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，没有所述突变的yeaS基因为下述(a)或(b)的DNA (a)具有SEQID N0:1中所示的碱基序列的基因，或，(b)与SEQID NO :1中所示的碱基序列的互补序列或能够由该互补序列制备的探针在 严格条件下杂交、并且编码具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产能力与 非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质的DNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述(I) (III)的突变分别为下述(i) (iii)的突变(i)第28位的苏氨酸残基被天冬酰胺所取代的突变，(ii)第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸以及甘 氨酸中的任一种所取代的突变，(iii)第188位的亮氨酸残基被谷氨酰胺所取代的突变。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细菌携带具有所述(ii)的突变的突变型 yeaS基因，且在该基因编码的蛋白质中第137位的苯丙氨酸残基被丝氨酸或谷氨酰胺所取 代。
5.根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸选自L-半胱氨酸、 L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨 酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-半胱氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述细菌经过修饰从而增强了L-半胱氨酸生物 合成系统酶的活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细菌经过修饰从而增强了丝氨酸乙酰转移 酶活性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述细菌携带降低了由L-半胱氨酸导致的 反馈抑制的突变型丝氨酸乙酰转移酶。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，所述细菌为泛菌属细菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细菌为Pantoeaananatis。
12.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，所述细菌为大肠杆菌。
13.一种属于肠肝菌科的细菌，其具有L-氨基酸生产能力，并且经过了修饰从而携带 具有选自下述(I) (III)中的突变的突变型yeaS基因(I)在yeaS基因编码的蛋白质中第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所取代 的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨基酸 所取代的突变，(III)在yeaS基因编码的蛋白质中第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基酸所取 代的突变；其中，没有所述突变的yeaS基因编码下述(A)或⑶中的任一种蛋白质(A)具有SEQID NO :2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有在SEQID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10个氨 基酸而得到的氨基酸序列、并且具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产能 力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质。
14.根据权利要求13所述的细菌，其中，所述L-氨基酸为L-半胱氨酸。
15.一种DNA，其编码具有选自下述(I) (III)的突变的下述(A)或(B)中的任一种 蛋白质(A)具有SEQID NO 2中所示的氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有在SEQID NO 2中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加1 10个氨 基酸而得到的氨基酸序列、并且具有当在肠杆菌中的表达增强时使得L-半胱氨酸生产能 力与非修饰株相比有所提高的活性的蛋白质；(I)在yeaS基因编码的蛋白质中第28位的苏氨酸残基被苏氨酸以外的氨基酸所取代 的突变，(II)在yeaS基因编码的蛋白质中第137位的苯丙氨酸残基被苯丙氨酸以外的氨基酸 所取代的突变，(III)在yeaS基因编码的蛋白质中第188位的亮氨酸残基被亮氨酸以外的氨基酸所取 代的突变。 全文摘要
在培养基中培养具有L-半胱氨酸等氨基酸生产能力、且经过修饰从而携带了具有特定突变的yeaS基因的属于肠杆菌科的细菌，使L-氨基酸在培养基中生成积累，并从该培养基收集L-氨基酸，从而生产L-氨基酸。
文档编号C12P13/10GK101864465SQ201010114678
公开日2010年10月20日 申请日期2010年2月20日 优先权日2009年2月16日
发明者宅见和浩, 野中源 申请人:味之素株式会社