专利名称：一种受抗生素诱导的化学诱导性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的化学诱导性启动子，包括拟南芥启 动子序列的克隆、植物转基因载体的构建、该启动子在不同组织中的活性分析、该启动子对 抗生素丝裂霉素和博莱霉素诱导响应的时效性分析以及所用抗生素对植物的生长影响分 析。
背景技术：
启动子是指RNA聚合酶识别、结合并起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因 上游。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别是依赖于DNA的RNA聚合 酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。习惯上，将植物基因的 启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子(constitutive promoter)、诱导型启动子 (inducible promoter)和组织特异性启动子(tissue-specific promoter) 但在某些情 况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。组成型启动子是指启动子所驱动的基因在不同组织器官和发育阶段的基因表达 没有明显差异，在所有组织中都能够启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性。例 如花椰菜菜叶病毒CaMV35S启动子(Odell等，1985)。组织特异性启动子，是指启动子所驱动的基因只在某些特定的器官和组织中表 达，并往往表现发育调节的特性，例如花特异性启动子(Vantimen等，1988)、叶片特异性启 动子(Taylor等，2001)。对这些启动子的研究，不仅有助于阐明基因在植物形态、发育、代 谢途径等中的作用，而且可以借助这些启动子，驱动目的基因在特定的位点进行表达，从而 达到生产实践或科研上所设定的特定目的。诱导型启动子，是指在某些特定条件例如物理、化学、生物信号(统称为“诱导因 子”)存在时，启动子可以驱动下游的基因增强表达，转录水平大大提高。其特征为，没有诱 导因子存在时，该类型启动子控制的基因不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表 达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因表达量迅速大幅度增加。诱导型启动子在基础科研 和生产实践中均具有重要应用价值。它可以用于研究基因的定时定量表达对于植物表型的 影响，从而研究基因的体内功能；也可用于生产实践上，使某些外源的转基因在需要的时候 高表达，不需要时不表达或低表达，从而达到生产上的某种特定目的。目前，根据植物所感受到的信号刺激种类，诱导型启动子主要可划分为物理因素 (如温、光、旱等)、化学因素(离子、有机物、激素等)和生物因素(病菌、组织器官、发育阶 段等)诱导表达的启动子。该类启动子常以诱导信号命名，例如光诱导表达基因启动子、热 诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、激素诱导表达基因启动子、真菌诱导表达 基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等(吴雪峰等，2004)。化学诱导启动子，往往 由于诱导物是外源的，生物体内或环境中不存在诱导因素，相比较于生物因素或温度等环 境因素诱导的启动子，特异性更强，更易控制基因的开关，故而在生产或科研上应用更为广 泛。
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启动子的活性分析常用到⑶S(β -glucuronidase，编码β -葡萄糖醛酸糖苷酶) 作为报告基因，它可以作为外源基因插入到启动子的下游，根据组织化学染色分析就可以 直观地得到基因在植物的不同部位的表达时空信息。在本发明申请中，同样采用GUS基因 来报告启动子的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种受抗生素诱导的化学诱导性启动子，它同时也是一种组 织特异性启动子。本发明提供的启动子，是从拟南芥的PARPl基因的上游克隆到的一段顺序。其核 苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示，记为PARPl启动子。PARPl蛋白负责植物蛋白质的多聚ADP 核糖化修饰，在植物的DNA修复中起重要作用。PARPl基因本身可以受到丝裂霉素和博莱霉 素的强烈诱导。本发明提供的PARPl启动子是一种受丝裂霉素和博莱霉素高度诱导的化学诱导 性启动子，除了丝裂霉素和博莱霉素外，它几乎不受到其它内源或外源因素的诱导，故而诱 导特异性特别强。这种类型的诱导性启动子，对于构建植物转基因载体，用于科研或者生产 实践均具有重要意义。本发明提供的组织特异性启动子，在苗期基根、开花期植物早期花药以及花丝中 具有活性。将该启动子克隆于报告基因载体中，通过转基因技术发现它所驱动的GUS报告基 因仅在3-5天幼苗的基根部位短暂表达；而在成熟植物中，仅在第八期前的花药以及花丝 顶部靠近花药处有表达。因此，PARPl启动子可以驱动外源基因在这些组织中特异表达，从 而达到定向地转基因的目的。将外源基因在转基因植物中定位表达可以提高外源基因在特 定部位的表达水平，增加转基因的目的性。重要的，本发明提供的启动子是一种受抗生素丝裂霉素和博莱霉素诱导的化学诱 导性启动子。本发明提供的启动子特征是未诱导之前，基因表达量很低，当用22μ g/ml丝裂霉 素+1. 5 μ g/ml的博莱霉素诱导30h后，即可使其大量表达，在不同的组织中提高的倍数有 所不同，本实验用定量PCR手段检测了 GUS报告基因在花(诱导强度强)和莲座叶(诱导 强度弱)中诱导前后表达量变化，发现在花里诱导表达量高达32倍，而在莲座叶中提高了 7 倍。本实验还利用拟南芥的苗尝试了单独用丝裂霉素和博莱霉素处理的诱导效果，发现当 用1. 0 μ g/ml的博莱霉素诱导50h的效果与用22 μ g/ml丝裂霉素+1. 5 μ g/ml的博莱霉素 诱导30h的效果相当。与博莱霉素相比，丝裂霉素诱导效果较弱，故而单独用低浓度的博莱 霉素诱导50小时就可以使外源目的基因在苗中高强度表达。本发明还检测了 1. 0μ g/ml的博莱霉素对植物生长的影响，将拟南芥的苗生长在 含有1. 0 μ g/ml的博莱霉素的培养基上，结果发现这个浓度对植物苗的生长没有明显不利 影响。这些结果说明，该启动子可以成为一个安全、有效、使用方便的诱导型启动子，可以 用于转基因载体的构建从而实现对基因表达的人工调控，使目的基因定时、定量、定位地表 达。本发明还提供利用PARPl启动子构建植物转基因载体的方法。具体步骤如下
将拟南芥PARPl启动子通过酶切位点可以连接到任何转基因载体的外源基因起 始密码的上游，以驱动下游基因的表达。本申请以转基因载体PAKK687为例，将克隆到的 PARPl启动子通过EcoR I/Sma I双酶位点插入到pAKK687的载体⑶S报告基因的上游，构 成了以GUS为报告基因的植物转基因载体。通过花序浸泡法转化模式植物拟南芥，成功获 得转基因植株。通过GUS组织化学染色可以检测该启动子在不同组织以及外界因素刺激下 的活性。外源基因可以替代GUS报告基因插入在PARPl启动子的下游。本发明还提供抗生素诱导PARPl启动子的方法、抗生素施用浓度以及表达水平的 检测方法。具体方法在苗期或者开花期喷洒抗生素溶液直至滴流为止，可以用22μ g/ml丝 裂霉素+1. 5 μ g/ml的博莱霉素来诱导，时间为30小时，但此浓度可能对植物生长造成影 响。如果用低至1. O μ g/ml的博莱霉素来诱导，时间为50小时，也可以达到几乎同样的诱 导效果，而且在该浓度下，抗生素对植物生长没有不利影响(图7中植物在含1. 0 μ g/ml的 博莱霉素的培养基上生长一周，植物的生长未受到明显胁迫)。喷洒后可以根据插入的外源基因设计基因特异性引物，抽提总RNA，用定量PCR来 检测诱导前后基因的表达水平变化。
图IPARPl启动子片段的扩增。箭头所示为克隆到的启动子片断。图2重组质粒示意图，将PARPl启动子通过酶切位点插入至⑶S报告基因的上游。图3PARP1启动子的组织特异性活性分析。PARPl启动子所驱动的GUS报告基因仅在3_5天幼苗的基根部位短暂表达；而在 成熟植物中，仅在第八期前的花药以及花丝靠近花药处有表达。A 生长3-5天幼苗；B 开 花植物的莲座叶；C 茎生叶；D 花穗；E 早期(第八期前)的花；F 开放的花；G 茎；H 幼 嫩果荚(胚胎子叶期前)；I 成熟果荚(子叶期后)。图4PARP1启动子在不同组织中博莱霉素诱导前后表达变化。0h/30h表示用 22 μ g/ml丝裂霉素+1. 5 μ g/ml的博莱霉素诱导0h/30h，图示花穗、苗和发育中的果荚诱导 前后⑶S报告基因的水平变化。诱导前⑶S在这些组织中表达水平很低或者没有表达，诱 导后在整个花穗中，苗期的整个植物以及整个果荚中均有强烈表达，显示强烈的蓝色信号。图5生长一周的幼苗用1. 0 μ g/ml的博莱霉素诱导。A.对照；B. 0. 5 μ g/ml博莱 霉素诱导5小时；C. 0. 5 μ g/ml博莱霉素诱导50小时；D. 1. 0 μ g/ml博莱霉素诱导5小时； Ε.Ι.Ομ g/ml博莱霉素诱导50小时；F. 35S启动子在苗期的活性。图6利用定量PCR分析诱导前后PARPl启动子的活性变化。在花里诱导表达量高 达32倍(较强)，而在莲座叶中表达量约为7倍(较弱)。图7在含有1. 0 μ g/ml博莱霉素的V2MS培养基生长一周的幼苗。1. 0 μ g/ml博 莱霉素未对植物造成明显伤害，在该浓度的培养基上生长一周的苗除了根稍许弯曲，子叶 大小及根长与对照接近。图8PARP1启动子受其它外界环境因素影响的情况。从图中可以看出在苗中除了 丝裂霉素和博莱霉素，PARPl几乎不受其它外界环境因素的诱导。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列是实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等分子克隆实验手册中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条 件。实施例IPARPl基因启动子片段的克隆1.DNA的提取取拟南芥生态型Col-O植株的叶片，液氮研磨，加0.4ml 2% CTAB (2% CTAB, IOOmM Tris-Cl pH8. 0,20mM EDTApH8. 0,1. 4M NaCl，临用前加巯基乙醇至 0. 2% )，混勻；65°C水浴30min ；加入0. 4ml氯仿，混勻；4000rpm，离心lOmin，转移上清到新 的离心管；加入400 μ 1异丙醇，混勻，室温静置IOmin ； 12000rpm，离心IOmin ；弃上清，70% 乙醇洗涤；37°C烘箱干燥，加20 μ 1水溶解。用0. 8%琼脂糖凝胶检测DNA的质量。2. PARPl基因启动子片段的扩增根据PARPl基因5’上游序列设计两对引物， 一对不含酶切位点的引物，上游引物5’-ATT TTG AGG CGG TGG AGT TTC-3’ ；下游引物 5，-CGT CGA CTT TGA GCT TGT TCG-3，。一对含有酶切位点，上游引物5，_GAA TTC TTTTGA GGC GGT GGA GTT TC-3，；下游引物5，_CCC GGG TTT CGT CTT CTT CTT CAGGAG MT AG-3，。 见SEQ ID NO. 2。首先用不含酶切位点的一对引物进行扩增，利用LATaq酶，按以下条件 940C 2min ；94°C 30s, 53°C /51°C /49°C /47°C /45°C 30s, 72°C 2min30s 共 32 个循环。回收 大于2kb的条带，作为模板。再用带有酶切位点的一对引物进行二次PCR，利用高保真pfu 酶，按以下条件94°C 2min ；94°C 30s, 50°C /49°C /48°C 30s, 72°C 2min30s 共 32 个循环，扩 增出一条单一的2179bp的片段(见图1)。实施例2PARP1启动子驱动的转基因载体的构建将PCR产物电泳回收后，用T4 DNA连接酶连接至中间载体PCR Blunt中，转化大 肠杆菌DH5 α，挑选克隆，摇菌并抽提质粒。电泳鉴定后选取有插入的克隆进行酶切鉴定，然 后测序，测序正确的克隆可以利用限制性内切酶切下目的片段，插入到最终转基因载体中 (本发明申请中为ΡΑΚΚ687)(见图2)，转化大肠杆菌。得到的克隆经酶切鉴定正确后进行 质粒扩增，以备转化农杆菌。实施例3PARP1启动子在不同组织中的活性分析按常规转化方法将上述表达载体转入农杆菌GV3101，抗性筛选后进行PCR鉴定。 鉴定为阳性的转化子通过花序浸泡法转化拟南芥，收取Ttl代种子进行Basta抗性筛选。取 T1代种子分离比为3 1的小苗进行GUS组织化学染色，观察GUS基因在转基因拟南芥各 个植物器官的表达情况，拍照。GUS染色发现，启动子在3-5天苗期基根处以及早期花药中 (第八期前)具有短暂活性，但在雄蕊花丝顶部中一直表现出活性(见图3)，在其它组织中 未观察到明显活性。实施例4PARP1启动子在不同抗生素浓度诱导下的活性分析取转基因阳性植株的不同组织，置于含22μ g/ml丝裂霉素+1. 5μ g/ml博莱霉素 的离心管中分别处理5h、30h。⑶S染色分析发现抗生素强烈诱导了⑶S报告基因的表达。 在花穗中，诱导前除了花丝顶部，整个花穗中GUS表达水平都很低，诱导后在花柄、整个花 丝、茎及雌蕊中GUS都被强烈诱导，但在花药中诱导程度相对较弱；在培养基上生长了 7天 的幼苗，在抗生素诱导之前未检测到GUS信号，诱导5h后信号开始出现，诱导30h之后，整个根、叶脉、茎尖等位置均有蓝色出现，信号强烈(图4仅显示30h的情况)，诱导所达到的 强度可与目前广泛使用的高表达启动子花椰菜病毒35S启动子几乎接近(图6)。未诱导之 前在幼嫩果荚中未检测到GUS信号，诱导5h后首先在果荚两端出现蓝色信号，诱导了 30h 后，蓝色信号遍布整个果荚(图4)。其它组织如茎、茎生叶、莲座叶在诱导了 30h之后，在茎 的切口处、莲座叶、茎生叶的叶脉都能检测到蓝色信号，但信号不如苗中强(未显示)，所以 本启动子更适合于在苗期的整个植物中或者开花植物的花中诱导外源基因产物的高表达。实施例5PARP1启动子在抗生素诱导下的活性定量分析本实验用定量PCR手段检测了用22μ g/ml丝裂霉素+1. 5μ g/ml的博莱霉素诱 导30h前后花和莲座叶中⑶S的表达量变化，引物序列如下F-primer :5’ -AGT GGC AGT GAAGGG CGA ACA GT-3’ ；R-primer 5' -TCA GCG TAA GGG TAA TGC GAG GT-3，。见 SEQ IDN0. 3。950C 3min ；95°C 5s, 60°C 30s，40个循环。结果发现在诱导强度较高的花中诱导提 高了 32倍，在诱导较弱的莲座叶中诱导提高了 7倍(见图5)。实施例6抗生素浓度对植物生长的影响分析试验更低的抗生素浓度，以及利用博莱霉素和丝裂霉素分别进行诱导，结果发现 相对于博莱霉素来说，丝裂霉素的诱导效果较弱，当用1. O μ g/ml的博莱霉素诱导50h的效 果与用22 μ g/ml丝裂霉素+1. 5 μ g/ml的博莱霉素诱导30h的效果相当(图6)，故而实际 应用时可以采用1. 0 μ g/ml的博莱霉素来进行诱导。将拟南芥种子消毒后均勻撒种至含有1. 0 μ g/ml的博莱霉素的1/2MS培养基上， 置4°C春化两天后移至光照培养箱，一周后发现拟南芥的生长未受到明显的影响(见图7)， 说明该诱导浓度对最为敏感的苗期植物生长没有明显不利影响，可用于启动子的诱导。实施例7PARP1基因对其它外界环境条件以及内源生物因素的响应情况分析拟南芥信息网站(www.arabidopsis.org)目前几乎综合了所有关于拟南芥基因 组水平的一些信息，它利用来自不同实验室的基因芯片结果，提供了拟南芥转录组在不同 外界因素影响下的变化情况。根据该网站提供的信息我们可以查询某一基因在不同环境因 素影响下的变化情况。我们发现在拟南芥苗中(气生部分以及根)PARPl基因的表达(图 8)几乎不受其它常见的外界胁迫因素如冷、热、干旱、盐、氧化、伤害等的影响，仅仅在用 Genotoxin(丝裂霉素+博莱霉素)处理时诱导大幅度提高。这从另一方面说明PARPl启动 子受诱导的特异性非常强，应用时不易受其它因素的干扰。序列表
1. SEQ ID NO. 1 的信息
(i)序列特征长2179bp，线性核苷_I
( )分子类型核酸
(iii)序列及序列标记红色(5’ -UTR)；蓝色ATG(PARP1基因起始密码子)
1-50TTTTGAGGCGGTGGAGTTTCTATTGATTGGTTATCGATGACCACTTGCAT
F-primer
51-100CGTCAAATGGTTCTTTGATTCGTGGTTTCGGCCCCAGCTTCATACTATCA
101-150CGAGACTCGACCATCTTGTTTTTTTCTTCTTCTTCTTGGTAAATGGTTTC
151-200ACAACTTGGTTCCTCTTTCTTTCATTTTATTTTATATACTATCATAGCAT
2151-2200 GAACTATTCTCCTGAAGAAGAAGACGAAAA TG0098]0099]R-primer0100]2. SEQ ID NO. 20101]用于扩增PARPl启动子的引物0102]不含有酶切位点0103]上游引物5’ -ATTTTGAGGCGGTGGAGTTTC-3，0104]下游引物5，-CGTCGACTTTGAGCTTGTTCG-3'0105]含有酶切位点0106]上游引物5，-GAATTCTTTTGAGGCGGTGGA GTT TC-3'0107]下游引物5，-CCCGGGTTTCGTCTTCTTCTT CAG GAG AAT0108]3. SEQ ID NO. 30109]用于定量PCR的引物0110]上游引物:5，-AGTGGCAGTGAAGGGCGAACA GT-3'0111]下游引物5，-TCAGCGTAAGGGTAATGCGAG GT-3，。
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权利要求
一个化学诱导启动子，其特征在于该启动子为一段从拟南芥中克隆到的DNA序列，具有SEQ ID No.1所述的核苷酸顺序。
2.如权利要求1所述化学诱导启动子在组织特异性表达中的应用，其特征在于用于将 外源基因在转基因植物中定位表达，以提高外源基因在特定部位的表达水平，增加转基因 的目的。
3.如权利要求1所述化学诱导启动子在构建转基因载体中的应用，其特征在于用于转 基因载体的构建，实现对基因表达的人工调控，使目的基因定时、定量、定位地表达。
4.一种对权利要求1所述化学启动子进行化学诱导的方法，其特征在于受到低浓度丝 裂霉素和博莱霉素诱导时，该启动子驱动下游基因强烈表达。
5.一种包含权利要求1所述化学启动子的重组载体。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化学诱导启动子。包括受丝裂霉素和博莱霉素诱导的化学诱导启动子的克隆方法、利用该启动子的植物转基因载体的构建方法、启动子驱动的报告基因表达模式分析以及使用和诱导该启动子的方法。该启动子驱动的GUS报告基因在植物中的绝大部分组织中没有表达或低水平表达；经抗生素处理后该启动子可以驱动报告基因在整个苗期以及花穗中强烈表达。除了抗生素外，该启动子几乎不受其它因素的诱导，特异性强，故该启动子可被用于构建抗生素诱导的植物转基因表达载体，在科研和农业生产上均具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/113GK101921764SQ20101017558
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者刘伟伟, 张海磊, 葛晓春 申请人:复旦大学