专利名称：三苯基甲烷类染料脱色酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发 明属于生物工程技术领域，具体涉及一种三苯基甲烷类染料脱色酶及其应用。
背景技术：
三苯基甲烷染料包括碱性、酸性、溶剂染料等，广泛应用于纺织印染、医药、生物染 色、造纸等领域。由于其生物毒性及致癌、致畸、致突变的三致性对人类健康构成威胁，引起 了广泛的关注。孔雀石绿是三苯基甲烷类染料中的一种代表，它是一种工业染料，又是一种 杀真菌剂，对鱼类水霉病、原虫病等的控制非常有效，因此，长期以来孔雀石绿在水产养殖 业中的使用极为普遍。生物方法是目前去除染料污染较为有效的方法，具有无毒、无残留、无二次污染的 优势。将固定化脱色酶应用于含染料废水的脱色及循环利用时，无需添加供菌体生长的底 物，因而具有美好的应用潜力。现在已有将固定化的偶氮还原酶应用于含偶氮染料的印染 废水处理的相关报道。目前，国内外研究者已发现多种可降解三苯基甲烷类染料的脱色酶 及并对相关基因进行了研究。真菌中的木质素酶系、真菌和分枝杆菌中的细胞色素P450 单加氧酶、柠檬酸杆菌中的三苯基甲烷类染料还原酶TMR、嗜水气单胞菌中的三苯基甲烷 类染料脱色酶TpmD等脱色酶及各种脱色基因已成为研究热点。真菌中的Phanerochaete chrysosporium能够利用其木质素过氧化物酶以逐步去甲基化的方式对三苯基甲烷染料结 晶紫进行脱色与降解；Curminghamella elegans通过细胞中某种未知酶的作用以去甲基化 的方式对孔雀石绿进行脱色与降解，且有P450系统的参与。而细菌中催化三苯基甲烷类染 料脱色的关键酶(或酶系)到目前为止仍不清楚。深入研究细菌中三苯基甲烷类染料脱色酶并探讨其脱色的酶学特性和机制，可以 利用基因工程技术将脱色酶转化或转移到特定的载体中，进行高效表达，从而为利用固定 化脱色酶处理工业废水的工艺设计提供科学参考，在该领域具有巨大的应用潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高活力的三苯基甲烷类染料脱色酶。本发明还要解决的技术问题是提供表达上述三苯基甲烷类染料脱色酶的基因。本发明还要解决的技术问题是提供上述三苯基甲烷类染料脱色酶的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种三苯基甲烷类染料脱色酶(即二氢嘧啶酶TDE)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，它包含了 479个氨基酸。表达上述三苯基甲烷类染料脱色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，它 包含了 1440bp的碱基。上述三苯基甲烷类染料脱色酶的纯化方法，其特征在于它包括如下步骤(1)硫酸铵沉淀
(la)将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440于LB培养基中培养，离心收集菌体，超声破碎后离心取上清液；(Ib)将步骤(Ia)得到的上清液进行硫酸铵沉淀，即在磁力搅拌器上不断搅拌条 件下，缓慢加入硫酸铵固体至一定饱和度，继续搅拌30min，离心收集在40 50%的硫酸铵 饱和浓度段得到的蛋白沉淀，将得到蛋白沉淀重溶于PH 8.0、20mM Tris-HCl中，再透析去 除蛋白溶液中的硫酸铵；(2)阴离子交换(2a)DEAE阴离子交换柱用pH 8. 0、20mM Tris-HCl平衡后，将步骤(Ib)透析后得 到的蛋白溶液过DEAE阴离子交换柱，用pH 8.0、20mM Tris-HCl冲洗直至蛋白检测器在A28tl 处为 0. 05，流速为 1. Oml · rnirT1 ；(2b)将DEAE阴离子交换柱用0 0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为 1.0ml · rnirT1，收集浓缩0.23 0.26M NaCl洗脱范围内得到的蛋白溶液，重溶于pH 8.0、 20mMTris-HCl中，再透析除去蛋白溶液中的NaCl ；(3)凝胶过滤层析(3a)凝胶过滤层析柱用pH 8. 0、20mM Tris-HCl平衡后，将步骤(2b)透析后得到 的蛋白溶液过凝胶过滤层析柱，流速为0. 5ml · mirT1，蛋白检测器在A28tl处有蛋白吸收峰的 位置，以2ml为单位收集蛋白溶液，以孔雀石绿为底物，测定所收集各蛋白溶液的酶活，根 据酶活强弱，收集得到具有脱色活性的过柱后蛋白溶液；(3b)将步骤(3a)中得到的具有脱色活性的蛋白溶液各取15 20 μ 1分别进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后，根据电泳谱带结果，选择电泳图谱简单(即电泳条带较 单一)对应的具有脱色活性的蛋白溶液，合并，超滤浓缩。 上述三苯基甲烷类染料脱色酶在去除三苯甲烷染料中的应用。有益效果本发明的三苯基甲烷类染料脱色酶对三苯基甲烷类染料具有高效的脱 色活性，具有巨大的应用前景。三苯基甲烷类染料作为一种广泛使用的染料，具有“三致” 效应，对人们的日常生活构成较大负面影响。尽管现在对染料废水脱色有各种物理、化学方 法，但由于其存在的种种潜在危害，人们对采用生物方法处理染料废水越来越关注。近年 来，已发现多种白腐真菌、霉菌、酵母菌等具有三苯基甲烷类染料脱色活性，国内外对三苯 基甲烷类染料脱色酶研究集中于真菌的木质素酶系、细胞色素Ρ450单加氧酶等。自上世纪 80年代,Glenn等发现白腐真菌黄孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium对一些聚合 染料具有脱色降解作用以来，白腐真菌对染料的脱色降解已逐渐成为研究热点。但是国内 外对细菌染料脱色酶的研究还很少，因此，我们所发现的三苯基甲烷类染料脱色酶将为染 料脱色提供一种新的途径。Pseudomonas putida KT2440所产生的二氢嘧啶酶，对三苯基甲 烷类染料_孔雀石绿具有很强的脱色活性，为今后大量生产该脱色酶提供了有利条件。通 过选择合适的载体质粒，可以使该基因在某些环境保护用菌种中表达，为构建多功能降解 菌提供理想的材料，改善脱色菌株的性能和脱色能力，降低生产和使用成本。
图1为通过DEAE阴离子交换柱分离，在0. 23 0. 26M NaCl洗脱范围内得到具有 脱色活性的洗脱峰。
图2为通过凝胶过滤层析柱分离，蛋白检测器实时检测过柱后溶液在A28tl处的蛋 白吸收峰。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例中，蛋 白脱色活性的检测方法如下酶活测定在45°C条件下进行，在20mM Tris-HCl (pH 8. 0)缓冲液中建立酶活常数 测定体系800 μ 1，体系中含适量分离纯化得到的TDE酶、20 μ M底物、0. ImM NADH0加入适 量酶后，立即在分光光度计上检测底物在初始Imin内，相应最大吸收波长处OD值的下降。 以不含脱色酶的反应混合液为对照。以每分钟催化1. 0 μ mol底物染料所需要的酶量为1个酶活单位⑶。实施例1:蛋白的纯化。1、硫酸铵沉淀(la) 30°C条件下，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440于LB培养基中培 养36小时，15000\8离心5!1^11收集菌体，菌体用201111 Tris-HCl(pH 8.0)洗涤一次后再 离心，然后将菌体重悬于20mM Tris-HCKpH 8. 0)，冰上超声破碎后，20000 X g高速离心 30min，取上清液。(Ib)将步骤(Ia)得到的上清液在磁力搅拌器上温和搅拌，同时加入固体硫酸铵 至不同饱和浓度段沉淀蛋白质(该过程控制在5 IOmin内完成)，加至各相应浓度后搅拌 30min，20000Xg高速离心30min，将离心后所得的蛋白沉淀重溶于适量20mMTris_HCl (pH 8. 0)中，同时测定不同硫酸铵浓度段相应沉淀蛋白的脱色活性，取具有较高脱色活性的硫 酸铵浓度段(40 50%饱和硫酸铵浓度段)的蛋白质，将该浓度段离心后得到的蛋白质沉 淀重溶于适量20mM Tris-HCKpH 8.0)中，再透析除去蛋白溶液中高浓度的硫酸铵。2、阴离子交换(2a) DEAE阴离子交换柱(DEAE Sefinose FF，上海生工生物工程技术服务有限公 司销售公司，2. 5cmX20cm)用20mM Tris-HCl (pH 8.0)平衡后，将步骤(Ib)透析后得到的 蛋白溶液过DEAE阴离子交换柱，根据不同蛋白质电荷性质不同初步分离蛋白质，蛋白质溶 液进柱后，用20mM Tris-HCKpH 8.0)冲洗直至蛋白检测仪(HD-4电脑核酸蛋白检测仪，上 海沪西分析仪器厂)在A28tl处为0. 05，，控制流速为1.0ml 'HiirT1t5(2b)将DEAE阴离子交换柱用0 0. 5M NaCl溶液进行梯度洗脱，控制流速为 1. Oml · mirT1，实时测定蛋白检测仪280nm处各洗脱峰相应的酶活，在0. 23 0. 26M NaCl 洗脱范围内得到具有脱色活性的洗脱峰(图1)，收集浓缩该洗脱峰内的蛋白样品，重溶于 适量20mM Tris-HCKpH 8.0)中，再透析除去蛋白溶液中高浓度NaCl。3、凝胶过滤层析(3a)凝胶过滤层析柱(S印hacryl S-200HR，GE Healthcare，1. 5cmX 100cm)用 20mM Tris-HCKpH 8.0)平衡后，将步骤(2b)透析后得到的蛋白溶液过凝胶过滤层析柱， 根据蛋白质分子量大小进一步分离纯化蛋白质，控制流速为0. 5ml mirT1，用蛋白检测器实 时检测过柱后溶液在A28tl处的吸收情况，在显示有蛋白吸收峰的位置(图2)，以2ml为单位收集蛋白溶液，分别测定所收集的各蛋白溶液的酶活，得到具有脱色活性的过柱后蛋白溶 液。(3b)将步骤(3a)中得到的具有较高酶活的蛋白样品各取15 20 yl分别经 SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色及相应脱色处理后，根据电泳条带结果，选择蛋白溶液较 纯(即电泳谱带单一)的具有脱色活性的蛋白溶液合并，超滤浓缩，-20°C冻存。实施例2 氨基酸序列测定。将实施例1最终制备得到的单一蛋白条带经Edman化学降解法进行N末端测序， 得到该脱色酶的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2所示。实施例3 酶活常数测定。孔雀绿、灿烂绿、结晶紫及碱性品红的最大吸收波长分别为617nm、630nm、590nm 和 545nm。为测定该脱色酶的动力学常数，各底物染料的终浓度(S)设为5.0 20 yM，通过 计算各底物终浓度条件下酶活反应的初速度(V)，由最常用的Lineweaver-Burk双倒数作
图法求得TDE酶活常数(如表1所示)。表 1 从所得到的该三苯基甲烷类染料脱色酶对以上四种染料(孔雀石绿、灿烂绿、结 晶紫、碱性品红)的Km数值，可以推断出，该脱色酶对这四种三苯基甲烷类染料均有脱色活 性，其中对孔雀石绿的脱色活性最强，其后依次为灿烂绿、碱性品红、结晶紫。
权利要求
一种三苯基甲烷类染料脱色酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.表达权利要求1所述的三苯基甲烷类染料脱色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。
3.权利要求1所述的三苯基甲烷类染料脱色酶的纯化方法，其特征在于它包括如下步骤(1)硫酸铵沉淀(Ia)将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440于LB培养基中培养，离心收集菌 体，超声破碎后离心取上清液；(Ib)向步骤(Ia)得到的上清液中加入硫酸铵固体，同时在磁力搅拌器上不断搅拌，然 后离心，收集40 50%饱和硫酸铵浓度段的蛋白沉淀，将得到的蛋白沉淀重溶于pH 8. O、 20mM Tris-HCl中，再透析去除蛋白溶液中的硫酸铵；(2)阴离子交换(2a)DEAE阴离子交换柱用pH 8. 0、20mM Tris-HCl平衡后，将步骤(Ib)透析后得到的 蛋白溶液过DEAE阴离子交换柱，用pH 8.0、20mM Tris-HCl冲洗直至蛋白检测仪在A28tl处 为 0. 05，流速为 1. Oml · mirT1 ；(2b)将DEAE阴离子交换柱用O 0. 5M NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1. Oml -min"1, 收集浓缩在0. 23 0. 26M NaCl洗脱范围内得到的蛋白溶液，重溶于pH 8. 0、20mM Tris-HCl中，再透析除去蛋白溶液中的NaCl ；(3)凝胶过滤层析(3a)凝胶过滤层析柱用pH 8.0、20mM Tris-HCl平衡后，将步骤(2b)透析后得到的蛋 白溶液过凝胶过滤层析柱，流速为0. 5ml ^irT1,蛋白检测仪在A28tl处有蛋白吸收峰的位置， 以2mL为单位收集蛋白溶液，以孔雀石绿为底物，分别测定所收集各蛋白溶液的酶活，得到 具有脱色活性的过柱后蛋白溶液；(3b)将步骤(3a)中得到的具有脱色活性的蛋白溶液各取15 20 μ 1分别进行电泳， 根据电泳谱带结果，选择电泳谱带单一的相对应的具有脱色活性的蛋白溶液，合并，超滤浓 缩。
4.权利要求1所述的三苯基甲烷类染料脱色酶在去除三苯甲烷染料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种三苯基甲烷类染料脱色酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了表达上述三苯基甲烷类染料脱色酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，该基因来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)的三苯基甲烷染料脱色酶基因。本发明还公开了上述三苯基甲烷类染料脱色酶的纯化方法，以及上述三苯基甲烷类染料脱色酶在去除三苯基甲烷类染料中的应用。本发明的三苯基甲烷类染料脱色酶对三苯基甲烷类染料具有高效的脱色活性，具有巨大的应用前景。
文档编号C12N9/78GK101870968SQ201010175228
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者张琼, 李丽观, 杜宏伟, 杨柳燕, 武俊, 王晓琳, 肖 琳, 胥苏海, 蒋丽娟 申请人:南京大学