专利名称：Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法
技术领域：
本发明涉及口蹄 疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由 口蹄疫病毒 (Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的主要侵害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、 热性、高度接触性传染病。该病病原FMDV(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)共分为 7个血清型，分别为0，A，C，SAT 1,SAT 2，SAT 3和Asia 1型，感染一种血清型并不能产生 对另外一种血清型的免疫保护力。3A蛋白氨基酸的缺失多发生于0型FMDV，这种自然缺失 在Asia 1型FMDV至今尚未见报道。对于FMD的预防，在西方发达国家以检疫为主，一旦发病以封锁、隔离扑杀为主要 预防手段；而在发展中国家由于经济发展条件的限制，多采用疫苗接种结合封锁、隔离和扑 杀患病动物的预防措施。在我国对于该病的预防主要以强制免疫作为平时的主要预防措 施。由于鉴别口蹄疫自然感染和疫苗免疫动物(DIVA)是OIE判定一个国家有无口蹄疫的 依据，因此疫苗的设计和生产也要服务于这个原则，即可以与DIVA的诊断方法相辅相成。 动物感染FMDV后，通常既产生结构蛋白的抗体也能产生非结构蛋白的抗体。由于非结构蛋 白在口蹄疫病毒复制过程中产生，所以如果血清中存在非结构蛋白抗体则说明动物感染了 FMDV。而未感染的动物仅产生结构蛋白抗体，传统疫苗中保留了大部分的病毒免疫原蛋白。 基于此原理，一些依赖于检测非结构蛋白来鉴别FMD自然感染和疫苗免疫动物的ELISA方 法油然而生(De Diego et al. , 1997 ；Mackay et al. , 1998 ；Sorensen et al. , 1998 ；Moonen et al.，2004)。然而疫苗在制备过程中可能存在非结构蛋白残留，降低了 ELISA试验的特 异性。由于灭活疫苗纯化过程中很难监测，所以残留的非结构蛋白会干扰对自然感染动物 的诊断，诊断的准确性低。分子标记疫苗是在分子水平上，将具有选择性标记的基因克隆到病毒全长cDNA 中，经过检测，可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫，从而鉴别出感染畜群和免 疫畜群。分子标记疫苗的开发有可能成为疫苗发展的一个主要方向。在国外，分子标记疫 苗研究的比较多，例如，1997年Michael等(Michael et al，1997，Michael，1997)用反向遗 传技术在呼肠孤病毒基因组上插入了 CAT基因，并得到了 CAT活性极高的拯救病毒。Moser 等(1998)将CAT基因插入到CSFV Alfort/187株的全长cDNA克隆pA187_l上的Npro中， 并将体外转录本RNA转染入SK-6细胞，结果得到了重组病毒VA187-CAT，重组病毒与原病毒 VA187-1在培养特性上无差别，并可在细胞培养液中检测到融合蛋白CAT-Npro，此蛋白具 有CAT活性和Npro活性，CAT基因可稳定保留在重组病毒基因组中，经传代10次后仍具有 CAT活性。Shi等(2002)成功构建了西尼罗河病毒的全长感染性克并在cDNA上插入和缺 失了几个酶切位点作为遗传标记，试验证明该重组病毒与其父本病毒具有同样的致病性。 Yount等(2003)用反向遗传技术拯救出了带有突变标记的SARS病毒。Baric等(2005)构建出了带GFP标记的MHV (mouse hepatitis virus)和SARS-CoV感染性cDNA，试验证明，用此策略可在2个月内拯救出SARS病毒。国内，分子标记疫苗研究较少，如黄耀伟等(2003) 报道，通过定点突变在传染性法氏囊病毒B节段上引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记 并成功拯救出了传染性法氏囊病毒；另又据网上新闻报道，我国还成功研制出带分子标记 的高产重组禽流感疫苗株rH5N3、猪伪狂犬病毒闽A株SA215三基因缺失疫苗等一批产品。 然而FMD抗原表位分子缺失标记疫苗的研究在国内尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有灭活疫苗纯化过程中很难监测，所以残留的非结构 蛋白会干扰对自然感染动物的诊断，诊断的准确性低的问题，而提供Asia 1型口蹄疫病毒 3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法。Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列为SEQ ID NO 1。Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建方法按以 下步骤进行一、从pBSAs全长重组质粒中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L (左 臂)和3A14R (右臂)，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物，然后进行融合PCR并回收融 合产物；二、用EcoRT22I和Sma I分步双酶切pBSAs全长重组质粒和融合产物，回收所需目 的片段，连接并构建重组质粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗 原表位缺失感染性cDNA的构建。本发明具有双重特征，一是Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感 染性cDNA在缺失掉这14个氨基酸(NEYIDKANITTDDK)后病毒对某些细胞的感染能力下降， 甚至不感染；二是该区域是抗原表位区，缺失后即可作为一种标记与亲本病毒相鉴别；本 发明中缺失3A非结构蛋白的一部分，不会残留此部分的非结构蛋白，不会干扰对自然感染 动物的诊断，诊断的准确性高；传统疫苗的弊端是一旦灭活不彻底，残留的非结构蛋白会引 起机体产生针对非结构蛋白的抗体，而自然感染的动物体内由于也有非结构蛋白抗体，所 以给区分自然感染和疫苗免疫动物带来很大困难。
图1是具体实施方式
二中融合PCR凝胶电泳图，其中1泳道为2000pluSMarker， 2泳道为3A14L PCR产物，3泳道为3A14R PCR产物，4泳道为融合产物；图2是具体实 施方式二中重组质粒pBSAs-3A14D鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为15000DNA Marker, 2泳道为EcoR V酶切产物；图3是具体实施方式
二中缺失重组病毒的RT-PCR鉴定的 凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为rvAs-3A14D PCR产物，3泳道为 rvAs-3A14D PCR产物；图4是具体实施方式
二中重组病毒生长曲线，其中 为亲本病毒，· 为rvAs-3A14D ；图5是具体实施方式
二中3A14PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中1泳道为 2000plus Marker, 2泳道为3A14 PCR产物；图6是具体实施方式
二中pET_32a_3A14表达 载体鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000pluSMarker，2泳道为Xho I单酶切，3泳道为 Bgl II和Xho I双酶切，4泳道为EcoR I酶切，5泳道为质粒对照；图7是具体实施方式
二 中pET-32a-3A14-2表达载体鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为阴性结果，3泳道为3A14-2PCR产物；图8是具体实施方式
二中pET_32a-3A14-4表达载 体鉴定的凝胶电泳图，其中1泳道为2000plus Marker，2泳道为阴性结果，3泳道为阴性结 果，4泳道为Bgl II和Xho I双酶切；图9是具体实施方式
二中pET32a-3A14表达蛋白的 SDS-PAGE分析凝胶电泳图，其中1泳道为蛋白分子量标准，2泳道为pET_32a空载体诱导 后，3泳道为pET-32a-3A14诱导后，4泳道为pET-32a_3A14诱导前；图10是具体实施方式
二中pET32a-3A14-2和pET32a_3A14_4表达蛋白的SDS-PAGE分析凝胶电泳图，其中1泳道 为pET32a空载体诱导后，2泳道为pET32a_3A14_2诱导前，3泳道为pET32a_3A14_2诱导后， 4泳道为pET32a-3A14-2诱导后裂解后沉淀，5泳道为pET32a-3A14_2诱导后裂解后上清， 6泳道为蛋白分子量标准，7泳道为pET32a-3A14-4诱导前，8泳道为pET32a-3A14_4诱导 后，9泳道为pET32a-3A14-4诱导后裂解后沉淀，10泳道为pET32a-3A14_4诱导后裂解后上 清；图11是具体实施方式
二中3A14及其串联表达蛋白的Western blot鉴定凝胶电泳图， 其中1泳道为蛋白分子质量标准，2泳道为FMDV-VP2结构蛋白阳性对照，3泳道为pET_32a 空载体表达蛋白阴性对照，4泳道为3A14单独表达蛋白(印i3A14)的westernblot结果， 5 泳道为3A14-2表达蛋白的western blot结果，6泳道为3A14-4表达蛋白的western blot 结果。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失 感染性cDNA的基因序列为=SEQ ID NO 10本实施方式中缺失掉的是3A基因91 104位氨基酸，这14个氨基酸的序列为 NEYIDKANITTDDK。
具体实施方式
二 本实施方式Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失 感染性cDNA的构建方法按以下步骤进行一、从pBSAs全长重组质粒中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L (左臂)和3A14R(右臂)，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物， 然后进行融合PCR并回收融合产物；二、用EcoRT22I和Sma I分步双酶切pBSAs全长重组 质粒和融合产物，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型 口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建。本实施方式步骤一中pBSAs全长重组质粒为含有As/CHA/05株FMDV全基因组全 长cDNA的pBluescriptSK质粒，包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的Poly(C) 和Poly(A)序列；在全长cDNA的5，末端上游具有T7 RNA聚合酶启动子，T7启动子上游和 3’末端具有EcoR V限制性内切酶位点以保正转录正确启始和终止。本实施方式步骤一中3A14L(1518bp)，3A14R(516bp)，融合产物(2038bp)，如图 1 所示。本实施方式步骤二中所得重组质粒pBSAs_3A14D，经鉴定为阳性的质粒送测序公 司进行测序，以确保缺失了 3A基因的42bp ；经基因组两端的EcoR V酶切位点切出8200bp 和3000bp条带，如图2所示，结果表明，成功构建了重组质粒pBSAs-3A14D。实验
(一 )、重组病毒rvAs_3A14D的拯救及鉴定a、缺失重组病毒的CPE 重组质粒pBSAS-3A14D线性化的体外转录本转染BHK-21细胞后42h，细胞出现细 胞病变(CPE)，表现为细胞圆缩、呈葡萄串状分布、细胞崩解成碎片直至脱落；将细胞培养 物连续传代，CPE出现的时间缩短，病变更加典型，传至第3代细胞可在接种病毒后8h出现 明显的CPE，培养Ilh可使80%细胞CPE，继续培养后最终单层脱落形成空斑，而对照细胞单 层完整，形态规则；拯救得到的FMDV病毒命名为rvAs-3A14D ；
b、缺失重组病毒的间接免疫荧光检测将拯救病毒rvAs_3A14D分别感染BHK-21细胞后用Asia 1型FMDV特异性单克 隆抗体进行间接免疫荧光试验检测，均可观察到特异性荧光，而正常BHK-21细胞无荧光产 生，这表明，拯救的缺失病毒为Asia 1 FMDV0C、缺失重组病毒的电镜观察纯化的缺失拯救病毒与FMDV特异性单克隆抗体作用后形成免疫复合物，经过负 染色，电子显微镜下观察，可见呈球形的病毒粒子，直径约为25nm ；d、缺失重组病毒的RT-PCR鉴定对拯救病毒rvAs_3A14D进行RT-PCR鉴定，扩增一段含有缺失位点的大小约为 650bp的基因片段，如图3所示，经测序表明，两株拯救的病毒分别缺失了目的区域的30bp 和 42bp。( 二 )、重组病毒的特性研究重组病毒的生长曲线为了比较重组病毒与亲本病毒之间的动态生长特性，制作 病毒生长曲线，结果见图4，重组病毒与亲本病毒具有相似的复制特点和增殖特性。a、病毒 TCID5tl 的测定用Reed-Muench法测定了亲本病毒和重组病毒rvAs_3A14D的在BHK-21细胞的 TCID50 ；算得的TCID5tl结果分别为，亲本病毒10_7_23，rvAs-3A14D 10_6 88 ；由此可见，病毒缺 失掉14aa抗原表位后对BHK-21细胞的感染性与亲本病毒差别不大；b、病毒乳鼠LD5tl的测定接种重组病毒和亲本病毒的乳鼠，分别在接种后28h 32h，高浓度接种乳鼠表 现典型的呼吸困难、后肢麻痹等症状；42h 48h后开始出现乳鼠死亡，对照鼠正常；最后 根据统计结果，计算出重组病毒和亲本病毒的LD5tl，分别为亲本病毒10_6 77 ；rvAs-3A14D 10_6 56 ；在致病力上不存在显著差异；C、重组病毒的细胞嗜性为了研究病毒缺失3A的部分基因后，在体外是否会改变对其宿主细胞的嗜性和 感染能力，选择了 BHK-21、PK15和犊牛肾细胞三种动物肾细胞进行感染试验；结果表明，病 毒缺失3A的91 104位氨基酸后，对犊牛肾细胞的感染能力明显降低，甚至不能在该细胞 中进行复制，而在仓鼠肾细胞和猪肾细胞中生长良好；这说明，完整的3A基因对本毒株As/ CHA/05能在犊牛肾细胞中正常复制是必需的。(三)、3A14短肽的原核表达及抗原性鉴定1材料与方法1. 1血清和抗体
血清为牛Asia 1型FMDV感染血清；兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标二抗购自Sigma 公司。1. 2质粒与菌株表达载体pET_32a、大肠杆菌感受态细胞Rosetta (DE3) pLysS本实验室保存。1.3主要试剂Ni2+-NTA离子柱亲和层析纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司；EasySeeWestern blot Kit购自全式金公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；IPTG购自宝生物工程 (大连)有限公司；氨苄青霉素(Amp)、十二烷基磺酸钠(SDS)为Sigma公司进口分装；低 熔点琼脂糖、考马斯亮蓝R250和考马斯亮蓝R250购自哈尔滨万太生物科技公司；丙烯酰 胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸氨、甘氨酸、 Tris-Cl、Tris-base、购自哈尔滨宝泰克生物科技公司。1.4 14aa短肽相应基因的PCR扩增该14aa短肽位于3A的91 104位氨基酸(基因片段命名为3A14，蛋白命名为 epi3A14)；为了进行表位串联表达，故在短肽的下游引入了连接肽(Gly4Ser)3，需要扩增 的整个序列结构为BglII-NEnDKANITTDDK-(Gly4Ser)3-BamH I-Xho I。利用融合 PCR 的 方法扩增这段基因，4条引物如下所示，其中3A14E1和3A14E2为内引物，3A14E3和3A14E4 为外引物；
~ PCR融合分两步进行，第一步内引物退火延伸，低复性温度下进行10个循环；第二 步加入3A14E3和3A14E4 (外引物)，以第一步反应产物为模板在高复性温度下进行25个循 环扩增融合片段。1. 5重组表达载体的构建a、3A14基因与表达载体pET_32a的连接反应上述纯化后的PCR产物和载体 pET-32a分别用Bgl II和Xho I进行双酶切，将3A14片段定向克隆至pET_32a中，连接产 物命名为 pET-32a-3A14 ；b、表位串联重组表达载体pET-32a-3A14_2和pET_32a-3A14_4的构建将 pET-32a-3A14重组载体用BamH I和Xho I酶切，回收载体片段。由于BamH I与Bgl II是同尾酶，所以具有Bgl II和Xho I粘性末端的3A14酶切产物能够插入上述载体中，构建成 含有2个3A14E片段的重组载体pET-32a-3A14-2 ；同理，构建了含有4个3A14E片段的重 组载体 pET-32a-3A14-4。1. 6 3A14及其串联蛋白的诱导表达及纯化 a、在大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达将提取的阳性质粒转化表达宿主菌 E. coli RoSetta(DE3)，之后接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养到菌液的 OD600nm约为0. 4 0. 6时；加入终浓度为1. Ommol/L的IPTG进行诱导表达，测定诱导4h后 的阳性菌和阴性菌的0D_值，准备通过12%分离胶进行SDS-PAGE电泳分析3A14及其串联 产物在Rosetta宿主菌中的表达情况；b、诱导菌的SDS-PAGE分析收集诱导4h后的ImL样品12000r/min离心lmin，弃 上清，菌体沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.4)重悬，重悬用PBS ( μ L)=菌液OD6c 值X 50，加入 等体积的2 X SDS上样缓冲液，沸水中裂解5min，12000r/min，离心30s后备用，参照分子克 隆指南第三版中SDS-PAGE制胶方法，采取5%积层胶、12%分离胶进行SDS-PAGE分析。C、表达蛋白的纯化表达的蛋白以可溶形式表达，在天然条件下对蛋白进行纯化， 并参照Ni2+-NTA离子柱亲和层析纯化试剂盒QIAGEN蛋白纯化手册进行操作。1. 7ffestern blot 检测以重组3A14及其串联蛋白为被检抗原，原核表达的口蹄疫病毒VP2蛋白做为阳性 参照蛋白，TrxA蛋白作为阴性对照(TrxA为pET_32a的一个大的融合标签蛋白，有109aa)； 以牛Asia 1型口蹄疫病毒感染血清为一抗；兔抗牛IgG-HRP为二抗，进行Western blot操 作，具体操作如下(1)将纯化得到的蛋白经SDS-PAGE后转印至PVDF膜；(2)封闭以5%的脱脂乳4°C封闭过夜；(3) 一抗作用弃去封闭液，用PBST洗涤PVDF膜3次，每次lOmin，然后将其放入 用PBST稀释好的一抗中(1 1000)，于平缓摇动的37°C摇床上，50r/min，温育2h ；(4) 二抗作用弃去一抗，用PBST洗涤PVDF膜3次，每次lOmin。将PVDF膜移至 用PBST稀释好的二抗中(1 10000)，于平缓摇动的37°C摇床上，50r/min，温育Ih ；(5)显色弃去二抗溶液，用PBST洗涤NC膜3次，每次lOmin，ECL显色试剂盒进 行显色，胶片曝光。2 结果2. 1 3A14短肽及其串联片段原核表达载体的构建a、3A14的PCR扩增产物经融合PCR，获得了含有3A14和连接肽的115bp的PCR产物，如图5所示。b、pET-32a-3A14表达载体的鉴定用Xho I单酶切，切出6015bp目的条带(5900bp+115bp)，用目的片段两端的Bgl II和Xho I双酶切切出5900bp载体带和115bp条带，而连入目的片段后，载体原有的EcoR I酶切位点消失，故用EcoR I应切不开质粒，如图6所示。c、pET-32a-3A14-2 表达载体的鉴定用引物3A14E3和3A14E4 PCR鉴定重组质粒，目的条带大小为200bp，如图7所示。d、pET-32a-3A14-4 表达载体的鉴定
用Bgl II和Xho I双酶切，切出5900bp载体带和388bp的条带，如图8所示。2. 2 3A14短肽及其串联片段在大肠杆菌中的诱导表达经终浓度为lmmol/L IPTG，37°C诱导4h后，SDS-PAGE分析诱导后的与诱导前的菌 相比，在约20kDa的位置出现了预期相符的蛋白条带，结果表明Asial 口蹄疫病毒3A14的 融合蛋白在Rosetta菌中获得了表达(约20kDa)，如图9所示；3A14的2个串联和4个串 联片段诱导后也得到了表达，而且是可溶性表达，约为27kDa和34kDa，如图10所示。2.3 3A14短肽及其串联片段表达蛋白的Western blot鉴定纯化后的蛋白经Western blot鉴定，表达的融合蛋白印i3A14_2和印i3A14_4均与牛Asial型口蹄疫感染血清产生特异性反应，具有良好的抗原性，但印i3A14却无可见条
市ο结论a、利用融合PCR技术构建了 Asia 1型FMDV 3A基因91 104位氨基酸缺失的感 染性重组质粒pBSAs-3A14D。b、利用反向遗传操作系统构建了一株缺失掉Asia 1型FMDV 3A基因91 104位 氨基酸的重组病毒(rvAs-3A14D)，该缺失位点模拟了其他血清型FMDV的自然缺失，为研究 Asia 1型FMDV的宿主嗜性提供及其有利的资料。C、本实施方式构建的重组病毒rvAs_3A14D缺失的14aa为3A非结构蛋白中的抗 原表位区，缺失后可作为标记与亲本病毒相鉴别，为进一步研究口蹄疫分子标记疫苗奠定 ■石出。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤一中克隆3A基因 的91 104位氨基酸的左臂(3A14L)，所用的反应体系成分用量以pBSAs全长重组质粒的500倍稀释为模板3 μ L20 μ M 弓I物 Ll 5' -TCATCAAACTCCTGAGCCGC-3‘1 μ L20 μ M 弓 I 物 L2 5 ‘ - TTCCGCCTCGTCA AGAGT CACCGCATCATTCACCATCT—3 ‘ 1 μ L5XPrimeSTAR Buffer10 μ L2. 5mM dNTP4 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0· 5 μ L用dH20 补至50 μ L注单下划线部分与3A104L的3'端匹配；双下划线部分与3A14R的5'端匹配；条件94°C预变性 3min，94°C 20s，57°C 30s，72°C lmin，共 25 个循环，72 °C 延伸 7min。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤一中克隆3A基因 的91 104位氨基酸的右臂(3A14R)，所用的反应体系成分用量以pBSAs全长重组质粒的500倍稀释为模板3 μ L20 μ M 弓 I 物 Rl 5' -GATGGTGAATGATGCGGTG ACTCTTGACGAGGCGGAAAA ‘ 1 μ L0094]20iiM 引物 R2 5' -TGACGAGGCACGAGGTAGGC-3
0095]5XPrimeSTAR Buffer
0096]2. 5mM dNTP
0097]PrimeSTAR HS DNA 聚合酶
0098]用dH20补至
1 u L 10 u L 4u L 0. 5u L 50 u L注单下划线部分与3A104L的3'端匹配；双下划线部分与3A14R的5'端匹配；条件94°C预变性 3min，94°C 20s，57°C 30s，72°C lmin，共 25 个循环，72 °C 延伸 7min。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤一中融合PCR分为 两步进行，第一步融合PCR不加引物，反应体系由下列成分组成成分用量5XPrimeSTAR Buffer10 u L2. 5mM dNTP4 u L3A14L PCR 产物5 ii L3A14R PCR 产物5 ii LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 ii L条件94°0预变性31^11，94115s，50°C 30s，72°C 1. 5min，共 10 个循环。其它步骤 及参数与具体实施方式
二相同。第二步融合PCR中加入L1和R2引物(外引物)，反应体系由下列成分组成成分用量lOXExTaqBuffer5 u L2. 5mM dNTP4 u L20iiM 弓丨物 LI1 u L20iiM 引物 R21 u L融合PCR第一步中PCR产物3iiLExTaqDNA 聚合酶0. 5 ii L用dH20 补至50iiL条件94°C预变性 3min，94°C 15s，60°C 30s，72°C 2min，共 25 个循环，72 °C 延伸 7min，4°C保存。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中酶切的体系如 下成分用量pBSAs全长重组质粒 30. 0 ii LEcoRT22I2. 5 u L10 XH Buffer5 u L无菌水12. 5iiL。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中酶切的体系如 下
成分用量pBSAs全长重组质粒EcoRT22I酶切后回收产物30. 0 ii LSma I2. 5 u L 10XT Buffer5 u LBSA5u L无菌水7. 5iiL。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中酶切的体系如 下成分用量融合产物30. Oil LEcoRT22I2. 5 u L10 XH Buffer5 u L无菌水12. 5uL。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中酶切的体系如 下成分用量融合产物EcoRT22I酶切后回收产物30. 0 ii LSma I2. 5 u L10XT Buffer5 u LBSA5u L无菌水7. 5iiL。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中连接体系如 下成分用量10XT4DNA 连接酶缓冲液l.OiiL双酶切后的融合产物6. 0 ii L双酶切后的pBSAs全长重组质粒2. 0 ii LT4DNA 连接酶l.OiiL。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
权利要求
Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA，其特征在于Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的基因序列为SEQ ID NO1。
2.Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建方法，其特 征在于Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA的构建方法按以 下步骤进行一、从pBSAs全长重组质粒中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L和 3A14R，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物，然后进行融合PCR并回收融合产物；二、用 EcoRT22I和Sma I分步双酶切pBSAs全长重组质粒和融合产物，回收所需目的片段，连接并 构建重组质粒pBSAs-3A14D，即完成Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染 性cDNA的构建。
3.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤一中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14L，所用的 反应体系成分用量以pBSAs全长重组质粒的500倍稀释为模板3 μ L20 μ M 引物 Ll 5' -TCATCAAACTCCTGAGCCGC-3‘ 1 μ L20 μ M 弓I 物 L2 5 ‘ - TTCCGCCTCGTCAAGAGT CACCGCATCATTCACCATCT-3 ‘1 μ L5XPrimeSTAR Buffer10 μ L2. 5mM dNTP4 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 μ L用dH20补至50 μ L条件94°C预变性 3min，94°C 20s, 57°C 30s, 72°C lmin，共 25 个循环，72°C延伸 7min。
4.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤一中克隆3A基因的91 104位氨基酸的3A14R，所用的 反应体系成分用量以pBSAs全长重组质粒的500倍稀释为模板3 μ L20 μ M 弓 I 物 Rl 5 ‘ -GATGGTGAATGATGCGGTG ACTCTTGACGAGGCGGAAAA ‘1 μ L20 μ M 引物 R2 5' -TGACGAGGCACGAGGTAGGC-3‘ 1 μ L 5XPrimeSTAR Buffer10 μ L2. 5mM dNTP4 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 μ L用dH20补至50 μ L条件94°C预变性 3min，94°C 20s, 57°C 30s, 72°C lmin，共 25 个循环，72°C延伸 7min。
5.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤一中融合PCR分为两步进行，第一步融合PCR，反应体系 由下列成分组成成分用量5XPrimeSTAR Buffer10 μ L。2. 5mM dNTP4 μ L3A14L PCR 产物5 μ L3A14R PCR 产物5 μ LPrimeSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 μ L条件94°C预变性 3min，94°C 15s，50°C 30s, 72°C 1. 5min，共 10 个循环；第二步融合PCR，反应体系由下列成分组成成分用量IOXExTaqBuffer5μ L。2. 5mM dNTP4 μ L。20 μ M 引物 Ll1 μ L。20 μ M 引物 R21 μ L融合PCR第一步中PCR产物3yLExTaqDNA 聚合酶0. 5 μ L用dH20补至50 μ L条件:94°C预变性 3min，94°C 15s, 60°C 30s, 72°C 2min，共 25 个循环，72°C 延伸 7min， 4°C保存。
6.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤二中酶切的体系如下成分用量pBSAs全长重组质粒30. 0 μ LEcoRT22I2. 5μ LIOXH Buffer5μ L无菌水12. 5 μ L0
7.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤二中酶切的体系如下成分用量pBSAs全长重组质粒EcoRT22I酶切后回收产物30. 0 μ LSma I2. 5 μ LIOXT Buffer5μ LBSA5 μ L无菌水7.5 μ L。
8.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤二中酶切的体系如下成分用量融合产物30. 0 μ LEcoRT22I2. 5μ LIOXH Buffer5μ L无菌水12.5yL。
9.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤二中酶切的体系如下成分用量融合产物EcoRT22I酶切后回收产物30. 0 ii LSma I2. 5u L10XT Buffer5 u LBSA5u L无菌水7.5uL。
10.根据权利要求2所述的Asia1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性 cDNA的构建方法，其特征在于步骤二中连接体系如下成分用量10 X T4 DNA连接酶缓冲液1. 0 u L双酶切后的融合产物6.oyL双酶切后的pBSAs全长重组质粒2. 0 u LT4 DNA 连接酶l.OuL。
全文摘要
Asia 1型口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法，它涉及口蹄疫病毒3A非结构蛋白抗原表位缺失感染性cDNA及其构建方法。它解决了现有灭活疫苗纯化过程中很难监测，所以残留的非结构蛋白会干扰对自然感染动物的诊断，诊断的准确性低的问题。序列见SEQ ID NO1。方法1.从pBSAs全长重组质粒中克隆3A14L和3A14R，得到3A14L PCR产物和3A14R PCR产物，然后融合PCR回收融合产物；2.双酶切pBSAs全长重组质粒和融合产物，再连接并构建重组质粒pBSAs-3A14D即完成。本发明中缺失3A非结构蛋白的一部分，不会残留此部分的非结构蛋白，诊断的准确性高。
文档编号C12N15/66GK101870980SQ20101017529
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者李爽, 王君伟, 马波, 高明春 申请人:东北农业大学