专利名称：假交替单胞菌、所产的κ-卡拉胶水解酶及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种假交替单胞菌、所产的K -卡拉胶水解酶及其制备和应用，属于 微生物应用技术领域。
背景技术：
海藻寡糖硫酸酯具有抗病毒、抗发炎、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤等多种生物和生理 功能，其功能决定于结构特征，譬如糖单元结构、分子量、硫酸酯化程度和硫酸酯化位置等 (Liu J M, et al. Anticancer Res,2000，20 :3265_3271)。卡拉胶(又称角叉菜胶、鹿角菜胶)是许多海洋红藻细胞壁的主要组分，这类含有 硫酸酯基团的线性多糖由交叉连接的(1 — 3)-3-D-半乳吡喃糖与(1 —4)-a_D-半乳吡 喃糖(或3，6-脱水-a-D-半乳吡喃糖)构成其骨架结构。商业上应用广泛的主要是k-卡 拉胶、I-卡拉胶和卡拉胶，它们在每个二糖单元上分别有1、2和3个硫酸酯。因此， 卡拉胶的降解产物引起人们广泛的兴趣(MouH，et al. J Appl Phycol, 2003,15 =297-303) 0 现行的酸法水解条件过于强烈，往往造成卡拉胶易变但富有价值的骨架结构遭受破坏 (Barbeyron T, et al. Mol BiolEvol，1998，15 :528_537)。酶法水解很受期待(Knutsen S H, et al. Carbohydr Ploym，1992，19 :199-210)，并且已经从噬纤维菌(Cytophaga，Potin P, et al. Eur J Biochem，1991，201 :241_247)、假单胞菌(Pseudomonas, 0stgaard K, et al. Enzyme MicrobTechnol, 1993,15 :326_333)、弧菌(Vibrio, Araki T, et al. Fish Sci, 1999，65 :937-942)、交替单胞菌(Alteromonas，Michel G, et al. Acta Crystallogr D, 2000,56 766-768)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas，Michel G, et al. Structure, 2001,9:513-525)等海洋细菌中分离得到卡拉胶水解酶。但是，其应用因卡拉胶水解 酶生产率过低而受到很大的限制(Dyrset N, et al. Enzyme Microb Technol, 1997,20 418-423)。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种假交替单胞菌所产的K -卡拉胶水解酶 及其制备和应用。本发明提供的假交替单胞菌WZU4771菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0. 3407。上述的假交替单胞菌菌株用于发酵得到K -卡拉胶水解酶的方法，其特征在于， 包括如下步骤1)发酵将所述假交替单胞菌WZU4771接入含K -卡拉胶的培养基中，温度20 35°C，优选25°C，培养24 48h，离心，取上清液。2)分离0 4°C下，将步骤1)所述上清液经(NH4) 2S04盐析和DEAE-纤维素层析， 冷冻干燥后，得到所述的K-卡拉胶水解酶。具体步骤为(1)向所述上清液中加入固体 (NH4)2S04至56%的饱和度，搅拌，离心，得上清液II，向上清液II中加入固体(NH4)2S04至65%的饱和度，搅拌，离心，收集沉淀物；(2)将步骤1)所述沉淀物溶于浓度为0. 05mM、pH 7. 1的Tris-HCl缓冲溶液，所述缓冲溶液中还含有0. OlM的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶 液中透析后，装载到DEAE-纤维素DE52层析柱上，用浓度为0. IM的KCl溶液洗脱，收集具 有κ-卡拉胶水解酶活性的馏分；(3)向步骤⑵所述的馏分中加入固体(NH4)2SO4至65% 的饱和度，搅拌，离心，收集沉淀物，将沉淀物溶于浓度为0. 05mM、pH 7. 1的Tris-HCl缓冲 溶液，所述缓冲溶液中还含有0. OlM的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析，冷冻干燥， 得到κ -卡拉胶水解酶。作为优选，步骤1)将假交替单胞菌WZU4771以占含κ-卡拉胶的培养基体积 3% 10%的接种量接入含κ-卡拉胶的培养基中。
作为优选，步骤1)所述培养基为含质量浓度6% 10%碳源、0.3% 0.7%氮源、 0.3% κ-卡拉胶和1.5% NaCl的水溶液。所述碳源为葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖 或乳糖中的一种，优选葡萄糖。所述氮源为玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵、硝酸铵或 硝酸钠中的一种，优选玉米浆。上述方法制备的K “卡拉胶水解酶，分子量为45000，能够水解K “卡拉胶中的 β-α —3)-键，最终得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。本发明还提供一种上述κ-卡拉胶水解酶用于制备κ-新卡拉四糖硫酸酯的方 法，包括如下步骤1)向κ _卡拉胶水溶液中加入所述的κ _卡拉胶水解酶，混合液经搅拌，离心去除 不溶物，真空蒸发，冷冻干燥，得冻干粉；2)将步骤1)所述冻干粉溶解于乙醇水溶液中，离心去除不溶物，取上清液、蒸发 去除乙醇后，用蒸馏水稀释，然后装载到聚丙烯胺凝胶Bio-Gel P-6 DG层析柱上，以浓度为 0. IM的NaNO3水溶液洗脱，收集含κ -新卡拉四糖硫酸酯的馏分，在蒸馏水中透析，真空蒸 发，冷冻干燥，得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。本发明能够达到以下技术效果1、假交替单胞菌WZU4771在κ -卡拉胶的诱导下合成并向胞外分泌κ -卡拉胶水 解酶，葡萄糖和玉米浆分别是其最佳碳源和最佳氮源。采用间歇发酵，通过优化培养基和 培养条件，可以获得50U/mL所述的κ-卡拉胶水解酶。与迄今已见报道的、间歇发酵产生 33U/mL 的 κ -卡拉胶水解酶的假单胞菌 Pseudomonas carrageenovora NCIMB 302 (Dyrset N, et al. Enzyme MicrobTechnol, 1997, 20 418-423)比较，所述假交替单胞菌 WZU4771 的 κ -卡拉胶水解酶生产能力大为提高，极具开发前景。2、本发明提供的κ -卡拉胶水解酶的分子量为45000，不能水解t -卡拉胶、λ -卡 拉胶、琼脂、海藻酸、几丁质、淀粉和纤维素，能够水解κ-卡拉胶中的β-α —3)-键，最终 得到K -新卡拉四糖硫酸酯，具有很高的商业应用价值。。3、本发明提供的κ -卡拉胶水解酶，40°C热处理2hr能够保持90%的酶活性，而 70°C热处理7.5min则完全失活。与迄今已见报道、来源于噬纤维菌(Cytophaga)、40°C热 处理Ihr保持90%的酶活性的κ-卡拉胶水解酶(BarbeyronT，et al.Mol Biol Evo 1, 1998,15:528-537)比较，更具热稳定性。最适温度30°C，最适pH值7. 5。在所述的最适温 度和最适PH值下，酶促反应服从米氏方程，转换数为125s、米氏常数为0. 015mM(0. 56mg/ mL)。迄今已见报道的κ-卡拉胶水解酶的米氏常数为3. 3mg/mL(来源于弧菌Vibriosp. CA-1004, Araki Τ, etal. Fish Sci，1999，65 :937_942)和 6. 66mg/mL[来源于假单胞 菌 Pseudomonaselongta(MTCC 5261)syn. Microbulbifer elongates, Khambhaty Y, et al. BiotechnolBioprocess Eng，2007，12 :668_675]。米氏常数小，表明酶对底物的亲和力强。
图1是κ _新卡拉四糖硫酸酯的洗脱曲线；图2是假交替单胞菌WZU4771生物量和κ -卡拉胶水解酶活性的时间曲线；图3是κ _新卡拉四糖硫酸酯的核磁共振图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。( 一 )假交替单胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771 的筛选假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771从浙江省温州市瓯江口洞头海域收 集的红藻活体叶片上采用平板划线法分离得到，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC NO. 3407，保藏起始日期为2009年11 月5日。具体的筛选步骤如下1.初筛取从浙江省温州市瓯江口洞头海域收集的红藻活体叶片，用无菌海水洗 净，浸没在所述的初筛培养基中，摇床培养数日。将培养液在含有所述的初筛培养基的琼脂 平板上平行划线，培养数日。将在琼脂平板上形成透明圈的菌落转接到新的琼脂平板上，培 养数日。重复以上步骤，直至得到纯培养物。初筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L) κ -卡拉胶2、NaCl 15，NaNO3 2、KH2PO4 1. 3、MgS04 · 7H20 0.5、CaCl2 (XliPFeCl3 0· 01，pH 值 7.5。2.复筛将纯培养物接种到所述的复筛培养基中，摇床培养。离心分离得到上清 液，测定上清液的κ-卡拉胶水解酶活性。复筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L) : κ-卡拉胶2、酵母膏1、NaCl 15、NaNO3 2、KH2PO4 1. 3、MgSO4 · 7H20 0.5、CaCl2 (XliPFeCl3 0. 01, pH {t 7. 503.酶活性测定方法取1. OmL上清液与2. OmL底物[以浓度为20mM的Tris-HCl 缓冲溶液(PH 7. 5)配制的、质量浓度为0. 25%的κ-卡拉胶水溶液]混合，置于(37 士 2)°C 保温2hr，然后将混合液置于沸水浴中热处理15min以终止酶反应。采用3，5-二硝基水杨 酸(DNS)比色法测定还原糖，定义每分钟从κ-卡拉胶中水解出Iymol还原糖所需要的酶 量为1个酶活性单位(U)。4.筛选指标以上清液的κ -卡拉胶水解酶活性浓度(U/mL)为指标，筛选得到 κ-卡拉胶水解酶生产率高的菌株。5.得到的假交替单胞菌WZU4771具有如下特征菌株的形态学特征为细胞分散，短杆状，长(1. O 2.5) μ m、宽(0. 5 0. 7) μ m， 革兰氏阴性，不形成孢子，端生鞭毛，能够运动。菌落呈叶状边缘的不规则圆形，直径 (3 7) mm，中间稍突起，粘性，不透明，黄色。
菌株的生理学特征为化能异养，专性好氧，触酶和氧化酶阳性。生长需要NaCl， 无NaCl时几乎不能生长，高浓度的NaCl抑制其生长，而浓度在(10 60) g/L时NaCl对生 长基本没有影响。最适生长温度为(23 27)°C。根据16S rRNA序列分析结果，结合其形态学和生理学特征，所述的菌株鉴定为假 交替单胞菌(Pseudoalteromonas)，命名为 WZU4771。所述的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771在k -卡拉胶的诱导下合成 并向胞外分泌K-卡拉胶水解酶，葡萄糖和玉米浆分别是其最佳碳源和最佳氮源。采用间 歇发酵，通过优化培养基和培养条件，可以获得50U/mL所述的k -卡拉胶水解酶。与迄今 已见报道的、间歇发酵产生33U/mL、流加发酵产生84U/mL的k -卡拉胶水解酶的假单胞菌 Pseudomonas carrageenovora NCIMB302(Dyrset N,et al. Enzyme Microb Technol, 1997, 20 418-423)比较，所述的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771极具开发前景。(二)K -卡拉胶水解酶的生产1.发酵所述的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771的优化培养基为含 有质量浓度6% 10%的碳源、0.3% 0.7%的氮源、0.3%的k-卡拉胶和1.5%的NaCl 的水溶液；优化培养条件是以占优化培养基体积3% 10%的接种量接入所述的优化培养 基，采用间歇发酵以(20 35)°C、(100 400)rpm培养(24 48)hr。发酵液以(8000 15000) g离心(20 40)min，得到上清液。上清液的k -卡拉胶水解酶活性浓度为(40 50)U/mL。2.分离所有步骤在(0 4) ！下操作。向上清液中加入固体(NH4)2S04至56% 的饱和度，搅拌6hr，以15000g离心分离20min。向上清液中加入固体(NH4)2S04至65%的 饱和度，搅拌6hr，以15000g离心分离20min，收集沉淀物。将沉淀物溶于浓度为0. 05mM的 Tris-HCl缓冲溶液(pH 7. 1)中，上述缓冲溶液中还含有浓度为0. 01M的2-巯基乙醇，在 相同的缓冲溶液中透析6hr，装载到DEAE-纤维素DE52层析柱上，用浓度为0. 1M的KC1溶 液以90mL/hr的速率洗脱。收集具有k -卡拉胶水解酶活性的馏分，加入固体^扎)#04至 65%的饱和度，搅拌6hr，以15000g离心分离20min，收集沉淀物。将沉淀物溶于以浓度为 0. 05mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7. 1)中，上述缓冲溶液中还含有浓度为0. 01M的2-巯基 乙醇，在相同的缓冲溶液中透析6hr，冷冻干燥，得到所述的k -卡拉胶水解酶。3. k-卡拉胶水解酶的特性所述的K -卡拉胶水解酶的分子量为45000，不能水解t _卡拉胶、\ _卡拉胶、 琼脂、海藻酸、几丁质、淀粉和纤维素，能够水解k-卡拉胶中的0-(1 — 3)-键，最终得到 k -新卡拉四糖硫酸酯。40°C热处理2hr能够保持90%的酶活性，而70°C热处理7. 5min则 完全失活。与迄今已见报道、来源于噬纤维菌(CytOphaga)、40°C热处理lhr保持90%的酶 活性的 k -卡拉胶水解酶(Barbeyron T，et al.MolBiol Evol，1998，15 :528_537)比较，更 具热稳定性。最适温度301，最适？11值7.5。在所述的最适温度和最适pH值下，酶促反应 服从米氏方程，转换数为125s—1，米氏常数为0. 015mM(0. 56mg/mL)。迄今已见报道的K -卡 拉胶水解酶的米氏常数为3. 3mg/mL (来源于弧菌Vibrio sp. CA_1004，Araki T，et al. Fish Sci, 1999,65 :937_942)和 6. 66mg/mL[来源于假单胞菌 Pseudomonas elongta(MTCC5261) syn. Microbulbifer elongates, Khambhaty Y,et al. Biotechnol Bioprocess Eng,2007, 12 668-675] 0米氏常数小，表明酶对底物的亲和力强。
(三)κ_新卡拉四糖硫酸酯的制备配制浓度为15g/L的κ -卡拉胶水溶液，加入200U/L所述的κ -卡拉胶水解酶。 混合液在所述的最适温度30°C和最适pH值7. 5下，以200rpm搅拌6hr。以15000g离心分 离20min，去除不溶物，真空蒸发，冷冻干燥。冻干粉溶解于体积比为5 1的乙醇水溶液 中，以15000g离心分离20min，去除不溶物。上清液真空蒸发去除乙醇后，用蒸馏水稀释，然 后装载到聚丙烯胺凝胶Bio-GelP-6DG层析柱上，用浓度为0. IM的NaNO3溶液以4mL/hr的 速率洗脱，洗脱曲线见图1。收集第67-77号馏分，在蒸馏水中透析6hr，真空蒸发，冷冻干
燥O冻干粉经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和核磁共振(图谱见附图3) 测定，其化学位移和不同Cl信号的强度与文献报道一致(Rochas C, et al. Int JBiol Macromol，1983，5 :111-115)，结构为κ-新卡拉四糖硫酸酯4_硫酸酯-β-D-半乳吡 喃糖-(1 — 4)-3，6-脱水1-0-半乳吡喃糖-(1 — 3)-4_硫酸酯-β-D-半乳吡喃 糖-(1 — 4) -3，6-脱水-α -D-半乳吡喃糖。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在m/z 850-910显示4个主要的峰，分别对 应于4种寡糖的钠和/或钾盐(表1)。表1基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
m/z_离子_
~ 855.5AnGal^+Galp4sNa+AnGalj! +Galp4sNa+Na873.4AnGal/7+Gal/74sNa+AnGalp+Galp4SNa+K
891.8AnGalp+Gal/ 4sNa+AnGal/7+Galp4sK+K
909.3AnGalp+Galp4SK+AnGal/ +Galp4sK+K注=AnGalp代表3，6_脱水-α -D-半乳吡喃糖；Galp4sK代表硫酸酯被钾离子取代的4_硫酸酯-β-D-半乳吡喃糖；Galp4sNa代表硫酸酯被钠离子取代的4_硫酸酯-β-D-半乳吡喃糖
实施例实施例1取从浙江省温州市瓯江口洞头海域收集的红藻海头红(Plocamium telfairiae) 活体叶片，剪成直径约为1. 5cm的小圆片，用无菌海水清洗3次，浸没在装有50mL初筛培 养基的500mL三角瓶中，在200rpm的摇床上于25°C培养72hr。将5mL培养液转接到装有 50mL新鲜的初筛培养基的500mL三角瓶中，在相同的条件下培养。重复以上步骤，直至培养 液明显浑浊。将浑浊培养液用无菌海水稀释10倍，在含有初筛培养基的琼脂平板上平行划 线，置于25°C培养48hr。将在琼脂平板上形成透明圈的菌落转接到新鲜的含有初筛培养基 的琼脂平板上，置于25°C培养48hr。重复以上步骤，直至得到纯培养物。将纯培养物接种到装有50mL复筛培养基的500mL三角瓶中，在200rpm的摇床上 于25°C培养24hr。将5mL培养液转接到装有50mL新鲜的复筛培养基的500mL三角瓶中， 在相同的条件下培养48hr。培养液以15000g离心分离20min，按所述的酶活性测定方法测定上清液的K-卡拉胶水解酶活性。以上清液的K -卡拉胶水解酶活性浓度(U/L)为指标，筛选得到K -卡拉胶水解 酶生产率高的菌株。根据所述的菌株的16S rRNA序列分析结果，结合其形态学和生理学特征，鉴定为 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)，命名为 WZU4771。上述初筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L) 卡拉胶2、NaCl 15， NaN03 2、KH2P04 1. 3、MgS04 7H20 0.5、CaCl2 0. 1 禾口 FeCl3 0. 01, pH {t 7. 50上述复筛培养基为含有以下浓度成分的水溶液(g/L) 卡拉胶2、酵母膏1、 NaCl 15、NaN03 2、KH2P04 1. 3、MgS04 7H20 0.5、CaCl2 0. 1 禾口 FeCl3 0. 01, pH {t 7. 50酶活性测定方法取l.OmL所述的上清液与2.0mL底物[以浓度为20mM的 Tris-HCl缓冲溶液(pH 7. 5)配制、浓度为0. 25%的k _卡拉胶溶液]混合，置于(37士2) V 保温2hr，然后将所述的混合液置于沸水浴中热处理15min以终止酶反应。采用3，5- 二硝 基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖含量，定义每分钟从k -卡拉胶水解出1 P mol还原糖所 需要的酶量为1个酶活性单位(U)。实施例2分别选取几种不同的碳源，浓度均为1%，以0. 的酵母膏为氮源，另加0.2% 的k-卡拉胶和1.5%的NaCl，配制培养基，接种量为10%，培养温度为25°C，摇床转速为 200rpm，进行假交替单胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771的k-卡拉胶水解酶发酵。培养 48hr，结果如表1所示，葡萄糖为最佳碳源。表1碳源对K -卡拉胶水解酶发酵的影响 实施例3分别选取几种不同的氮源，有机氮源浓度均为0. 1%，无机氮源浓度折合相当于 0. 5g/L的(NH4)2S04的氮含量，以的葡萄糖为碳源，另加0. 2%的k -卡拉胶和1. 5%的 NaCl，配制培养基，接种量为10%，培养温度为25°C，摇床转速为200rpm，进行假交替单胞 菌(Pseudoalteromonas) WZU4771的k -卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表2所示， 玉米浆为最佳氮源。表2氮源对K -卡拉胶水解酶发酵的影响
8 实施例4培养基含有的葡萄糖、0. 的玉米浆和1. 5%的NaCl，另外分别添加0. 2%的 K -卡拉胶、半乳糖和乳糖，接种量为10%，培养温度为25°C，摇床转速为200rpm，进行假交 替单胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771的κ -卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表 3所示，κ -卡拉胶诱导假交替单胞菌(Pseudoalteromonas) WZU4771合成κ -卡拉胶水解 酶，而半乳糖和乳糖不能诱导假交替单胞菌(Pseud0alter0m0nas)WZU4771合成κ-卡拉胶 水解酶。表3诱导物对κ -卡拉胶水解酶发酵的影响 实施例5培养基含有的葡萄糖、0. 的玉米浆和1.5%的NaCl，另加0.2%的κ-卡 拉胶，接种量为10%，摇床转速为200rpm，在不同的培养温度下，进行假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas) WZU4771的κ -卡拉胶水解酶发酵。培养48hr，结果如表4所示，最 佳温度为(25-30) V。表4温度对κ -卡拉胶水解酶发酵的影响
实施例6培养基含有8%的葡萄糖、0.5%的玉米浆和1.5%的NaCl,另加0. 3 %的 K-卡拉胶，接种量为10%，培养温度为25 °C，摇床转速为200rpm，进行假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas) WZU4771的κ -卡拉胶水解酶发酵。其生物量和κ -卡拉胶水解酶活 性的时间曲线如图2所示，发酵液的酶活性在对数生长期快速增加，并在稳定期达到50U/ 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
权利要求
一株假交替单胞菌，其特征在于，所述菌株为假交替单胞菌WZU4771，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.3407。
2.权利要求1所述的假交替单胞菌得到K-卡拉胶水解酶的方法，其特征在于，包括如 下步骤1)发酵将所述假交替单胞菌WZU4771接入含K-卡拉胶的培养基中，温度20 35°C 下，培养24 48h，离心，取上清液；2)分离0 4°C下，将步骤1)所述上清液经(NH4)2S04盐析和DEAE-纤维素层析，冷冻 干燥，得到所述的k-卡拉胶水解酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)将假交替单胞菌WZU4771以占所 述含k -卡拉胶的培养基体积3% 10%的接种量接入所述培养基中。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述培养基为含质量浓度6% 10%碳源、0. 3% 0. 7%氮源、0. 3% k-卡拉胶和1. 5% NaCl的水溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽 糖、蔗糖或乳糖中的一种，所述氮源为玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵、硝酸铵或硝酸 钠中的一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为玉米浆。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述温度为25°C。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述上清液经(NH4)2S04盐析和 DEAE-纤维素层析的具体步骤为(1)向所述上清液中加入固体(冊4)讽4至56%的饱和度，搅拌，离心，得上清液II，向 上清液II中加入固体(冊4)#04至65%的饱和度，搅拌，离心，收集沉淀物；(2)将步骤(1)所述沉淀物溶于浓度为0.05mM、pH 7. 1的Tris_HCl缓冲溶液，所述缓 冲溶液中还含有0. 01M的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析后，装载到DEAE-纤维素 DE52层析柱上，用浓度为0. 1M的KC1溶液洗脱，收集具有k -卡拉胶水解酶活性的馏分；(3)向步骤⑵所述的馏分中加入固体(NH4)2S04至65%的饱和度，搅拌，离心，收集沉 淀物，将沉淀物溶于浓度为0. 05mM、pH 7. 1的Tris_HCl缓冲溶液，所述缓冲溶液中还含有 0. 01M的2-巯基乙醇，在相同的缓冲溶液中透析，冷冻干燥，得到k -卡拉胶水解酶。
9.根据权利要求2 8中任一项所述方法得到的k-卡拉胶水解酶，其特征在于，所 述k-卡拉胶水解酶的分子量为45000，能够水解卡拉胶中的(1 — 3)-键，最终得 到k-新卡拉四糖硫酸酯。
10.权利要求9所述的K-卡拉胶水解酶用于制备K-新卡拉四糖硫酸酯的方法，其特 征在于，包括如下步骤1)向K-卡拉胶水溶液中加入所述的K-卡拉胶水解酶，混合液经搅拌，离心去除不溶 物，真空蒸发，冷冻干燥，得冻干粉；2)将步骤1)所述冻干粉溶解于乙醇水溶液中，离心去除不溶物，取上清液，蒸发去除 乙醇后，用蒸馏水稀释，然后装载到聚丙烯胺凝胶Bio-Gel P-6DG层析柱上，以浓度为0. 1M 的NaN03水溶液洗脱，收集含k-新卡拉四糖硫酸酯的馏分，在蒸馏水中透析，真空蒸发，冷 冻干燥，得到k-新卡拉四糖硫酸酯。
全文摘要
本发明公开了一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)WZU4771，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.3407。上述的假交替单胞菌WZU4771所产的κ-卡拉胶水解酶，能够水解κ-卡拉胶，最终得到κ-新卡拉四糖硫酸酯。
文档编号C12R1/01GK101864388SQ20101017543
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者赵肖为 申请人:温州大学