专利名称：假交替单胞菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)及其用途。
背景技术：
褐藻胶，又称褐藻酸多糖，是一种来源于褐藻细胞壁的水溶性酸性多糖，主要从海带、巨藻、马尾藻等褐藻中提取得到。我国人工养殖海带数量居世界第一位，占世界产量的95％。同时也是仅次于美国的褐藻胶生产大国，但是生产的多为低值的初级产品，产量的80％左右供出口，大约在7000至8000吨左右，其余的20％主要用作纺织工业原料。因此，如何以资源丰富的低值产品褐藻胶为原料，研究褐藻胶降解产物生物学价值及其分子作用机理，对于开发具有重要应用价值的褐藻胶相关系列产品具有及其重要的指导作用，必将对褐藻胶产业发展产生深远的影响。
高分子量的褐藻胶凝胶性强，不容易被吸收，在应用方面受到很大的限制。经不同程度降解的褐藻胶，水溶性好，有利于人体吸收。研究表明，不同分子量范围、不同组分(M/G比例)和不同衍生方法得到的褐藻胶降解物及其衍生物，表现出不同的生理活性，可被开发成多种医药材料和功能食品，如抗凝血、免疫促进效应、抗肿瘤活性以及防辐射作用；褐藻胶衍生物还具有比较好的抗爱滋病毒(HIV)活性[1，2，3]。进一步降解得到的褐藻胶低聚糖平均分子量在3KDa以下，还具有促进双歧杆菌生长、广谱杀菌活性、提高种子萌发、促进萌芽及根系生长、增强鱼肌原纤维蛋白质的持水性和耐热性等作用[4，5，6]。这些都显示了褐藻胶降解物作为生理性功能食品、药物、饲料添加剂、植物生长促进剂的应用前景。
但是，现阶段对于褐藻胶降解物的研究工作大部分还局限在实验室内，原因就在于褐藻胶不易自动降解，需要适当的条件和方法，才能将其降解为具有多种生理功能的低聚糖。目前，普遍采用稀酸水解法来获得褐藻胶降解物，这种方法的降解速度慢，产率低，质量难以控制，产物的生化特性不能很好的满足要求，且需高温、高压，操作较复杂，成本高，并对环境造成污染。与之相比，褐藻胶裂解酶对褐藻胶的降解反应具有条件温和、效率高、无污染、底物专一性明确、产物的生物学活性强等优点，因而酶法制备褐藻胶低聚糖的技术备受青睐，显示出其诱人的发展前景。
本发明采用的菌种为实验室自行筛选分离得到，经鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)，在英国国际微生物研究所保藏，保藏号为SD227。
参考文献1.Bland EJ，Keshavarz T，Bucke C.The influence of small oligosaccharides onthe immune system.Carbohydr Res.2004，339(10)1673-82.Iwamoto M，Kurachi M，Nakashima T，etc.Structure-activity relationship ofalginate oligosaccharides in the induction of cytokine production from RAW264.7cells.FEBS Lett.2005，579(20)4423-9.
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假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)在英国国际微生物研究所保藏，保藏号为SD 227，假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)为革兰氏阴性菌，短杆状1.0～2.4μm，兼性菌，通过单极鞭毛运动，无芽孢，耐盐。
假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)用于生产褐藻胶裂解酶。
用于生产褐藻胶裂解酶的方法包括如下步骤1)将假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)划线接种至含有0.3％～0.5％海藻酸钠的2216E海洋细菌固体培养基中，在25～28℃条件下，培养12～16小时，得到斜面菌种；
2)将上述斜面菌种转接至含有0.3％～0.5％海藻酸钠的2216E海洋细菌液体培养基中，25～28℃摇瓶培养12～16小时，得到液体菌种；3)将上述1％～3％液体菌种转接至30～50mL发酵培养基的三角瓶中，25～28℃摇瓶培养16～18小时，得到发酵液；4)将上述发酵液在4℃下、3000rpm离心10～15分钟去除菌体，浓缩至5～10倍，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。
所述的发酵培养基的组成以g/L为单位计磷酸氢二铵11.6、氯化钠32.9、硫酸亚铁0.08、硫酸镁0.3和磷酸氢二钾0.4，pH7.4～7.6。
所述的浓缩方法为中空纤维膜超滤方法。
本发明的优点是，菌种易培养、代时短，发酵液杂蛋白种类少、含量低，可直接用中空纤维膜超滤的方法浓缩脱盐，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。产品的活性高，稳定性好，成本低，能够实现工业化生产。
具体实施例方式
假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)为革兰氏阴性菌，短杆状1.0～2.4μm，兼性菌，通过单极鞭毛运动，无芽孢，耐盐。未有对人致病性报道。其培养方法已知，可用2216E海洋细菌培养基。最适生长温度为25～28℃。假交替单胞菌ZQ-4能分泌胞外褐藻胶裂解酶，该酶的工作温度范围为30～40℃，最适反应温度为40℃，反应pH6～8，最适pH7.6；酶活力在摇瓶条件下达到256.47U/mL。
实施例11)将假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)划线接种至含有0.3％海藻酸钠的2216E海洋细菌固体培养基中，在25℃条件下，培养12小时，得到斜面菌种，2216E海洋细菌固体培养基组成以g/L为单位计NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高铁0.01，琼脂20，pH7.4～7.6[7]；2)将上述斜面菌种转接至含有0.3％海藻酸钠的2216E海洋细菌液体培养基中，25℃摇瓶培养12小时，得到液体菌种，2216E海洋细菌液体培养基组成以g/L为单位计NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高铁0.01，pH7.4～7.6[7]；3)将上述1％液体菌种转接至30mL发酵培养基的三角瓶中，25℃摇瓶培养16小时，得到发酵液，发酵培养基的组成以g/L为单位计磷酸氢二铵11.6、氯化钠32.9、硫酸亚铁0.08、硫酸镁0.3和磷酸氢二钾0.4，pH7.4～7.6；4)将上述发酵液在4℃下、3000rpm离心15分钟去除菌体，中空纤维膜超虑浓缩至5倍，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。
实施例21)将假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)划线接种至含有0.5％海藻酸钠的2216E海洋细菌固体培养基中，在28℃条件下，培养16小时，得到斜面菌种，2216E海洋细菌固体培养基组成以g/L为单位计NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高铁0.01，琼脂20，pH7.4～7.6；2)将上述斜面菌种转接至含有0.5％海藻酸钠的2216E海洋细菌液体培养基中，28℃摇瓶培养16小时，得到液体菌种，2216E海洋细菌液体培养基组成以g/L为单位计NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高铁0.01，pH7.4～7.6；3)将上述3％液体菌种转接至50mL发酵培养基的三角瓶中，28℃摇瓶培养18小时，得到发酵液，发酵培养基的组成以g/L为单位计磷酸氢二铵11.6、氯化钠32.9、硫酸亚铁0.08、硫酸镁0.3和磷酸氢二钾0.4，pH7.4～7.6；4)将上述发酵液在4℃下、3000rpm离心15分钟去除菌体，中空纤维膜超虑浓缩至10倍，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。
实施例31)将假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)划线接种至含有0.4％海藻酸钠的2216E海洋细菌固体培养基中，在27℃条件下，培养14小时，得到斜面菌种，2216E海洋细菌固体培养基组成以g/L为单位计NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高铁0.01，琼脂20，pH7.4～7.6；2)将上述斜面菌种转接至含有0.4％海藻酸钠的2216E海洋细菌液体培养基中，27℃摇瓶培养14小时，得到液体菌种，2216E海洋细菌液体培养基组成以g/L为单位计NaCl 30，蛋白胨5，酵母浸膏1，磷酸高铁0.01，pH7.4～7.6；3)将上述2％液体菌种转接至40mL发酵培养基的三角瓶中，27℃摇瓶培养17小时，得到发酵液，发酵培养基的组成以g/L为单位计磷酸氢二铵11.6、氯化钠32.9、硫酸亚铁0.08、硫酸镁0.3和磷酸氢二钾0.4，pH7.4～7.6；4)将上述发酵液在4℃下、3000rpm离心15分钟去除菌体，中空纤维膜超虑浓缩至8倍，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。
权利要求
1.一种假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)，其特征在于，在英国国际微生物研究所保藏，保藏号为SD 227，假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)为革兰氏阴性菌，短杆状1.0～2.4μm，兼性菌，通过单极鞭毛运动，无芽孢，耐盐。
2.一种如权利要求1所述假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)的用途，其特征在于它用于生产褐藻胶裂解酶。
3.根据权利要求2所述的一种假交替单胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)的用途，其特征在于所述的用于生产褐藻胶裂解酶的方法，包括如下步骤1)将假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)划线接种至含有0.3％～0.5％海藻酸钠的2216E海洋细菌固体培养基中，在25～28℃条件下，培养12～16小时，得到斜面菌种；2)将上述斜面菌种转接至含有0.3％～0.5％海藻酸钠的2216E海洋细菌液体培养基中，25～28℃摇瓶培养12～16小时，得到液体菌种；3)将上述1％～3％液体菌种转接至30～50mL发酵培养基的三角瓶中，25～28℃摇瓶培养16～18小时，得到发酵液；4)将上述发酵液在4℃下、3000rpm离心10～15分钟去除菌体，浓缩至5～10倍，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。
4.根据权利要求3所述的一种假交替单胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)的用途，其特征在于所述的发酵培养基的组成以g/L为单位计磷酸氢二铵11.6、氯化钠32.9、硫酸亚铁0.08、硫酸镁0.3和磷酸氢二钾0.4，pH7.4～7.6。
5.根据权利要求3所述的一种假交替单胞菌(Pseudoalteromonastetraodonis)的用途，其特征在于所述的浓缩方法为中空纤维膜方法。
全文摘要
本发明公开了一种假交替单胞菌及其用途。假交替单胞菌，在英国国际微生物研究所保藏，保藏号为SD 227。假交替单胞菌用于生产褐藻胶裂解酶。方法包括如下步骤1)将假交替单胞菌划线接种至含有海藻酸钠的2216E海洋细菌固体培养基中，培养得到斜面菌种；2)将上述斜面菌种转接至含有海藻酸钠的2216E海洋细菌液体培养基中，摇瓶培养，得到液体菌种；3)将液体菌种转接至发酵培养基的三角瓶中，摇瓶培养，得到发酵液；4)将发酵液离心去除菌体，浓缩，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。本发明的菌种易培养、代时短，发酵液杂蛋白种类少、含量低，用中空纤维膜超滤的方法浓缩脱盐，得到褐藻胶裂解酶浓缩液制剂。产品的活性高，稳定性好，成本低，能够实现工业化生产。
文档编号C12N9/24GK101037661SQ20071006731
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月12日 优先权日2007年2月12日
发明者郑晓冬, 汤海青, 王一非, 张嘉, 邹慧熙 申请人:浙江大学