专利名称：一种利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法
技术领域：
本发明属于工业微生物发酵工程技术领域，具体地说涉及一种利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法。
背景技术：
我国是水产养殖大国，水产品产量居世界首位，水产品在我国进出口贸易中占有重要地位。近年来水产养殖业发展非常迅猛，集约化养殖规模不断扩大，而高密度、大规模养殖引起病害的广泛发生与传播，给水产养殖业造成了严重的经济损失。除营养性因素和环境因素外，引起海水养殖鱼类疾病的原因主要是病毒、细菌、真菌、立克次氏体和寄生虫等传染性病原。其中由细菌感染引起的疾病流行面广，发病率高，危害大。弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，多为条件致病菌，在近岸及河口海水、海洋生物的体表及肠道中广泛分布，是海洋环境中的正常优势菌群，一旦条件适宜时就可成为致病菌。在夏季，特别是养殖密度和有机物含量较高的条件下易诱发弧菌病 (Vibriosis)。弧菌病是海水养殖鱼类中经常发生的传染病，目前发现的弧菌病原主要有鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、病海鱼弧菌(V. ordalii)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、创伤弧菌(V. vulnificus)、溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)、河流弧菌(V. f luvialis)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、拟态弧茵(V. mimicus)、杀娃弧菌(V. salmonicida)、牙鲆肠弧菌(V. ichthyoenteri)和大菱虾弧菌(V. scophthalmi)等。其中鳗弧菌引起的水产养殖动物疾病最为严重，在世界范围流行，是目前养殖业发展的最主要障碍之一，也是我国海水养殖的鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、对虾等动物的重要病原菌，常给水产养殖业造成较大的危害。一直以来，由于抗生素具有使用方便、见效快和疗效好等优点，在相当长的时间内作为控制水产动物疾病的主要手段，这些抗生素主要有呋喃妥因、磺胺、美洛西林、新生霉素、利福平、新霉索(禁用药)、氯霉素(禁用药)和庆大霉素等。抗生素等药物的大量使用的确达到了增产与抗病目的，有时作为一种辅助的防治手段也是必要的。但药物或抗生素的长期滥用会引起水环境污染，导致养殖环境恶化，妨碍水产动物的正常生长，甚至导致群体的抗病能力下降，增加了疾病产生的可能性。另外耐药性微生物的出现和药物残留对食用者的潜在威胁也不容忽视，近年来国家采取严厉的手段，严格限制抗生素或禁止某些抗生素的使用，并积极寻求其替代品。抗生素替代品(如微生态制剂、寡糖、抗菌肽等)的研制成为各国学者的研究热点。此时有益菌就应运而生，虽然有益菌对水产养殖动物的有利影响往往是通过几种机制协同作用的结果，但通过竞争营养、附着位点或产生拮抗物质，是其主要作用，而拮抗物质的产生是有益菌能够抑制病原菌生长的重要因素。目前有益菌的使用方式是把益生菌制备成菌悬液，拌入饵料或者直接加入养殖水体中，虽然能够起到一定的防治效果，但是益生菌的大量使用具有潜在的危害，益生菌可能产生条件性感染，也可能产生炎症，并且大多数情况下是伴随抗生素一起使用，敏感的益生菌很容易被杀死，造成水体的二次污染。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种防治鳗弧菌的假交替单胞菌拮抗物质粗提物的制备方法，该方法可以获得活性较高的拮抗物质粗提物。本发明所述的一种利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法，由以下步骤组成(1)菌种的斜面活化培养采用保藏的假交替单胞菌(I^eudoalteromonas sp.) 作为活化培养的菌种；将活化好的菌种接种在2216E固体培养基，25-30°C温箱培养2-3天， 待长出大量菌苔后，用生理盐水洗下菌体，调节菌体浓度为IO7-IO8个/mL，置于无菌试管， 4°C保存备用；所述2216E培养基配制方法是蛋白胨5g，酵母粉lg，FeS04*7H20 0.01g，pH 7.6， 陈海水IL ；固体培养基需加琼脂20g，121°C灭菌20分钟备用；(2)液体发酵培养将上述的细胞悬液以体积百分比为5-10%的接种量，接种于 2216E液体培养基或者豆饼粉水解液培养基中，25-30°C，150-180rpm培养，2-3天后，10000 离心10分钟，收集发酵液，弃去菌体，所获得的发酵液含鳗弧菌杀菌剂；所述豆饼粉水解液培养基配制方法是2%的豆饼粉水解液加3.5%的妝(^， 121°C灭菌20分钟备用；所述豆饼粉水解液的制备方法称取豆饼粉32g，加入0. 25N盐酸250mL，15磅水解30分钟，冷却至室温；用0. 25N氢氧化钠中和至ρΗ6· 0-6. 5之间，5000rpm离心5分钟， 收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤一遍，合并上清液后定容至800mL，得4%的豆饼粉水解液配成液体培养基；(3)发酵液粗提将上述发酵液用截留分子量为IKDa的超滤膜进行超滤，滤液通过大孔径树脂XAD-2，先用水洗涤，然后分别用40 %，60 %，100 %的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，检测活性，具有活性的40%洗脱液进行真空冷冻干燥，得到的干粉为粗提的杀菌剂粗品；性质相当稳定，可长期保存；上述利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法中步骤⑴或(2)所述培养温度是；上述利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法中步骤( 所述振荡培养条件是 150-180rpm ；上述利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法中步骤( 所述培养时间是 2-3 天。本发明所述的一种利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂方法的优点是采用液体培养技术，方法简单，培养基原料廉价、易于制备，利于放大和实现工业
化生产。提供的是胞外拮抗物质，利于实施，不会造成水体的二次污染。杀菌剂粗品为干粉制剂，活性高，性质稳定，可长期保存，有良好的应用价值。
具体实施例方式
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一
将I^seudoalteromonas sp.菌体接种到试管琼脂培养基斜面上，2216E培养基配制方法是蛋白胨5g，酵母粉lg, FeSO4 · 7H20 0. Olg, pH 7. 6，陈海水IOOOmL ；于28°C下培养2天，待长出大量菌苔后，用生理盐水洗下菌体，调节菌体浓度为IO7-IO8个/mL，置于无菌试管，获得种子液；用500mL三角瓶扩大培养，2216E液体培养基；在每个三角瓶中装入150ml液体培养基，120°C灭菌20min，冷却后接入5ml的种子液，于下，150rpm培养2天，以鳗弧菌为指示菌，检测发酵液的抑菌活性，抑菌圈直径达最大时，收集发酵液，弃菌体，上清液通过 IKDa的超滤膜进行超滤，滤液通过大孔径树脂XAD-2，先用水洗涤，然后用40%的甲醇水溶液洗脱，洗脱液真空冷冻干燥，即成为可供使用的微生物杀菌剂。实施例二 基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为蛋白胨3g，酵母粉0.5g， FeSO4 · 7H20 0. 005g, pH 7. 0，陈海水IOOOmL ；接种量为IOml种子液，培养温度25°C，培养时间为1. 5天，摇床转速为180rpm。实施例三基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为4%的豆饼粉水解液，3. 5%的 NaCl, pH 7. 6，余量为蒸馏水IOOOmL ；接种量为5ml种子液，培养温度^°C，培养时间为2 天，摇床转速为150rpm。实施例四基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方为2%的豆饼粉水解液，3. 5%的 NaCl,pH 7.0，余量为蒸馏水；接种量为IOml种子液，培养温度25°C，培养时间为1.5天，摇床转速为180rpm。
权利要求
1.一种利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法，由以下步骤组成(1)菌种的斜面活化培养采用保藏的假交替单胞菌O^eudoalteromonassp.)作为活化培养的菌种；将活化好的菌种接种在2216E固体培养基，25-30°C温箱培养2-3天，待长出大量菌苔后，用生理盐水洗下菌体，调节菌体浓度为IO7-IO8个/mL，置于无菌试管，4°C保存备用；所述2216E培养基配制方法是蛋白胨5g，酵母粉lg, FeSO4 · 7H20 0. Olg, pH 7. 6，陈海水IL ；固体培养基需加琼脂20g，121°C灭菌20分钟备用；(2)液体发酵培养将上述的细胞悬液以体积百分比为5-10%的接种量，接种于2216E 液体培养基或者豆饼粉水解液培养基中，25-30°C，150-180rpm培养，2_3天后，10000离心 10分钟，收集发酵液，弃去菌体，所获得的发酵液含鳗弧菌抑制剂；所述豆饼粉水解液培养基配制方法是2%的豆饼粉水解液加3. 5%的NaCL，121°C灭菌20分钟备用；所述豆饼粉水解液的制备方法称取豆饼粉32g，加入0. 25N盐酸250mL，15磅水解30 分钟，冷却至室温；用0. 25N氢氧化钠中和至pH6. 0-6. 5之间，5000rpm离心5分钟，收集上清液，沉淀用蒸馏水洗涤一遍，合并上清液后定容至800mL，得4%的豆饼粉水解液配成液体培养基；(3)发酵液粗提将上述发酵液用截留分子量为IKDa的超滤膜进行超滤，滤液通过大孔径树脂XAD-2，先用水洗涤，然后分别用40 %，60 %，100 %的甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，检测活性，具有活性的40%洗脱液进行真空冷冻干燥，得到的干粉为粗提的杀菌剂粗品；性质相当稳定，可长期保存。
2.如权利要求1所述的利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法，其特征是步骤(1)或( 所述培养温度是观！。
3.如权利要求1所述的利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法，其特征是步骤(2)所述摇床转速是150-180rpm。
4.如权利要求1所述的利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法，其特征是步骤 (2)所述培养时间是2-3天。
全文摘要
本发明涉及一种微生物杀菌剂的制备方法，属微生物发酵工业领域。本发明公开了一种利用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)制备鳗弧菌杀菌剂的方法，由(1)菌种的斜面活化培养，(2)液体发酵培养，(3)发酵液粗提，(4)抑菌剂的制备等步骤组成。本发明所述方法简单，培养基廉价、易于制备，并采用液体培养技术，利于放大和实现工业化生产，性质稳定，有良好的应用价值。
文档编号C12R1/01GK102266356SQ201110215570
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者夏亚穆, 宿烽, 张媛媛, 李俊峰, 李峰, 李红芳 申请人:青岛科技大学