嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法，具体地公开了一种突变的假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr。本发明还公开了该酶的制备方法，本发明的制备嘌呤核苷磷酸化酶具有产量高且热稳定性好的特点。本发明还公开了编码该嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列的多核苷酸，含有该多核苷酸的载体和宿主细胞。
【专利说明】嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]嘌呤核苷憐酸化酶(purine nucleoside phosphorylase),简称PNP,是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，广泛存在于哺乳动物、寄生虫和微生物中。按照嘌呤核苷磷酸化酶的蛋白结构可分为两类:低分子量的同源三聚体类和高分子量的同源六聚体类。其中哺乳动物和部分微生物(例如鼠伤寒沙门氏菌salmonella typhimurium,嗜热古菌芝田硫化叶菌Sulfolobus solfataricus等)的嘌呤核苷磷酸化酶属于同源三聚体类,其分子量约为80~IOOkDa,每个亚基的分子量为30~32kDa，通常此类嘌呤核苷磷酸化酶只能以鸟嘌呤核苷和肌苷作为底物。而同源六聚体类的嘌呤核苷磷酸化酶，底物专一性不强，既可接受鸟嘌呤核苷和肌苷作为底物，也可以腺嘌呤核苷作为底物。其分子量约为150kDa，亚基分子量为25kDa左右。
[0003]由于PNP特殊的生物活性，使得其在医药领域得到了较大的应用:①应用于核苷类药物的合成，大量研究表明，核苷类(核苷及其类似物)具有广泛的抗肿瘤抗病毒的效果。②应用于肿瘤靶向治疗；③应用于无机磷和ATPase酶活力等的定量测定。
[0004]鉴于PNP的广泛应用前景，近年来，关于PNP的基因工程研究越来越多，但多以大肠杆菌PNP和嗜热菌PNP为主。而本发明选取克隆假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的PNP，简称为PiPNP，其相对于其他菌属的PNP有着一个显著的优点，即该酶在低温(小于400C )下的即有较高的催化效率，研究发现，在体外，催化低浓度或高浓度的肌苷反应时，PiPNP的最适温度为30— 35°C或50— 60°C，明显低于其他菌属的PNP (例如大肠杆菌PNP催化低浓度或高浓度的肌苷反应最适温度分别为50°C或60-70°C)，这就使得在常规反应温度下(37°C )，PiPNP使用较少的量就可获得较高的催化效率。但PiPNP相较于其他菌属的PNP也存在其缺陷——温度稳定性较低，将PiPNP保温30min，在37-42°C时酶活发生急剧变化，50°C完全失活，EcPNP在50-55°C发生急剧变化，65°C时完全丧失失活。
[0005]另外，据已报道的各方面研究，重组菌发酵生产的PNP产量仍较低，多为100~200U/ml，对于工业化生产而言，仍不能达到很好的效果，产量有待提高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种经过分子改造并具有较高热稳定性的嘌呤核苷磷酸化酶，以及高产量的制备该嘌呤核苷磷酸化酶的方法。
[0007]本发明第一方面提供了一种突变的假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr0
[0008]在另一优选例中，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一种或多种特性:
[0009](a)比酶活≥30U/mg,较佳地为≥45U/mg ；[0010](b)储存在碱性环境中；
[0011](C)失活温度<60°C ;
[0012](d)在O — 55°C，保存时间汕。
[0013]在另一优选例中，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的最适PH值为7.0-9.0，较佳地为7.5-8.5，更佳地为8.0。
[0014]在另一优选例中，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0016]在另一优选例中，所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密码子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一个或多个密码子被替换为大肠杆菌相对应的偏爱密码子。
[0017]在另一优选例中，所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密码子AGG、CTA、CTA、ΑΤΑ、CTA和CTA中的一个或多个密码子被替换为CGA、CTG、CTG、ATC、CTG 和 CTG。
[0018]在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0019]本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有第二方面所述的多核苷酸。
[0020]在另一优选例中，所述载体为表达载体,更佳地为适合在大肠杆菌中表达的表达载体。
[0021]本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含第三方面所述的载体或基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。
[0022]在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0023]在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。
[0024]本发明第五方面提供一种第一方面所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，包括以下步骤:
[0025](a)在适合表达的条件下，培养第四方面所述的宿主细胞，从而表达出第一方面所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶；
[0026](b)分离所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0027]在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌。
[0028]在另一优选例中，在步骤(a)之前，所述方法还包括以下步骤:
[0029](I)提供一假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0030](2)将所述多核苷酸序列中对应于野生型假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密码子突变为编码Tyr的密码子，并且任选地，将所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一个或多个密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替换为大肠杆菌相对应的偏爱密码子，从而制得编码第一方面所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0031](3)将上一步骤制得的所述多核苷酸序列导入宿主细胞，从而制得第四方面所述的宿主细胞。
[0032]在另一优选例中，步骤(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0033]在另一优选例中，所述野生型或野生型的酶是来自假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷憐酸化酶。
[0034]在另一优选例中，将第97位Asp的密码子GAC突变为编码Tyr的密码子TAT。
[0035]在另一优选例中，将所述密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替换为CGA、CTG、CTG, ATC, CTG 和 CTG。
[0036]在另一优选例中，所述方法获得的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的表达活性> 300U/ml，较佳地为 350 - 450U/ml。
[0037]本发明第六方面提供了一种改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，所述方法包括步骤:
[0038](I)提供一假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0039](2)将所述多核苷酸序列中对应于野生型假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密码子突变为编码Tyr的密码子，从而制得编码突变的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列；
[0040](3)表达上一步骤制得的所述多核苷酸序列，从而制得突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0041]在另一优选例中，所述方法用于提高嘌呤核苷磷酸化酶的稳定性。
[0042]在另一优选例中，步骤(I)中的多核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0043]本发明第七方面提供了一种第一方面所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷进行磷酸解反应；或用作对肌苷进行磷酸解反应的催化剂。
[0044]本发明第八方面提供了一种催化反应，包括步骤:在第一方面所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶或第四方面所述的宿主细胞存在下，对肌苷进行酶催化反应(磷酸解反应)，生成次黄嘌呤。
[0045]本发明第九方面提供了一种酶制剂，所述的酶制剂含有第一方面所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
[0046]在另一优选例中,所述的酶制剂为固定化酶。
[0047]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1 为 PNP (O) -pET-28a (+)的质粒图谱。
[0049]图2A为PCR扩增的目的条带电泳图。
[0050]图2B为PNP(0)-pET_28a(+)筛选阳性克隆电泳图
[0051]图3为pMD19-T载体的结构示意图。
[0052]图4为密码子优化的工程菌PNP (O) -pET-28a (+) -BL21与未优化的工程菌PNP-pET-28a (+) -BL21 发酵液 SDS-PAGE 图。
[0053]图5为密码子优化的工程菌PNP (O) -pET-28a (+) -BL21与未优化的工程菌PNP-pET-28a (+) -BL21的分泌表达产量对比数据图。
[0054]图6为将Ile87的密码子改为ATT与改为ATC的工程菌之间表达活性的对比数据图。
[0055]图7为PiPNP与rPiPNP的酶保留活力随温度变化图。
[0056]图8为PiPNP与rPiPNP的酶保留活力随时间变化图。【具体实施方式】
[0057]发明人经过广泛深入的研究，意外地发现，通过将来自假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的嘌呤核苷磷酸化酶PNP基因序列中编码Asp97的密码子GAC改为编码Tyr的密码子TAT，所制得的突变酶具有明显提高的热稳定性。此外，通过将PNP基因序列中分别编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA改为CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG后，经过基因工程制备方法可进一步显著提高PNP的产量。在此基础上完成了本发明。
[0058]如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0059]本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0060]本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明酶的功能。
[0061]如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
[0062]本发明的酶的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0063]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0064]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0065]应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段 。
[0066]本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述酶的方法。
[0067]通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产嘌呤核苷磷酸化酶。一般来说有以下步骤:
[0068](1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0069](2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
[0070](3).从培养基或细胞中分离、纯化嘌呤核苷磷酸化酶。
[0071]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0072]此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0073]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0074]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、NS0,C0S7、或293细胞的动物细胞等。相应地，也可以将来源于假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列中分别编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密码子替换为上述宿主细胞偏爱的密码子。
[0075]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0076]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0077]在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0078]本发明包括以下主要优点:
[0079](I)本发明的嘌呤核苷磷酸化酶具有较高热稳定性，酶失活温度可提高至60°C以上，并且在O — 55°C，酶的保存时间延长至3h以上。[0080](2)本发明的嘌呤核苷磷酸化酶热稳定性提高的同时，还保持较高的酶活性。
[0081](3)本发明的制备方法极大地提高了嘌呤核苷磷酸化酶的产量，产品的表达活性可以达到或超过400U/mL，这是目前的基因工程制备方法所无法企及的。从而有利于大规模工业化生产。
[0082]本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何被提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0083]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0084]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0085]本发明实施例中的实验材料的来源如下所示:
[0086]pET_28a (+)购于 Novagen 公司
[0087]pMD19_T Simple Vector 购于 TaKaRa 公司
[0088]Solution I 购于 TaKaRa 公司
[0089]T4DNA连接酶购于TaKaRa公司
[0090]10*T4DNA连接酶缓冲液购于TaKaRa公司
[0091]胰蛋白胨购于上海源聚生物科技有限公司
[0092]酵母粉购于安琪酵母股份有限公司
[0093]NaCl购于国药集团化学试剂有限公司
[0094]实施例1假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)PNP基因序列的优化及克隆载体的构建
[0095]①基因序列的优化
[0096]基因序列的优化是将Pseudoalteromonas sp.1590的PNP基因序列(GEN BANKEF222283，SEQ ID N0.3)进行了部分分子改造，分为两项:一是将整条序列中的编码氨基酸的 Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34、Leul45 的密码子 AGG、CTA、CTA、ATA、CTA、CTA 改为CGA、CTG、CTG、ATC、CTG、CTG ;二是将97位Asp改造为Tyr，密码子由GAC改为TAT。优化后的基因序列进行全基因合成。
[0097] 全基因合成:
[0098]委托上海生工合成。首先从NCBI数据库中获得Pseudoalteromonas sp.1590的野生型的PNP基因序列，并第97位氨基酸残基的密码子从Asp97改为Tyr。此外，本发明人为了在大肠杆菌中实现高效表达，对基因序列进行了优化，其中主要对六处密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子(即将Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45的密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA中的六个密码子被替换为CGA、CTG、CTG、ATC、CTG和CTG)。所述序列的全合成采用人工合成法进行合成。
[0099]人工合成是将所要合成的寡聚核苷酸链的3’ -末端先以3’ -OH与一个不溶性载体连接，然后依次从3’-5’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，在添加到核苷酸链上时，去除3’端的保护，而后再释放5’端用以连接下一个核苷酸单体。
[0100]②引物的设计
[0101]根据上述优化后的基因序列和pET_28a ( + )(购于Novagen公司)的酶切位点,利用Primerf.0引物设计软件进行引物的设计:
[0102]上游引物(引物I) 5，-ctagctagcatgcgaactccgcatatcaatg-3’ (SEQ ID N0.4)
[0103]下游引物(引物2)5，_ccgctcgagttagatagactctaatgcaattttaac_3 (SEQ ID N0.5)
[0104]③基因的扩增
[0105]以化学合成的全基因产物为模板，在DNA Taq酶的催化下进行PCR反应。反应体系及反应条件分别如表1和表2所示:
[0106]表1反应体系
[0107]
【权利要求】
1.一种突变的假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，与野生型的氨基酸序列相比，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中第97位Asp突变为Tyr。
2.如权利要求1所述的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶具有以下一种或多种特性: (a)比酶活≥30U/mg，较佳地为≥45U/mg； (b)储存在碱性环境中； (c)失活温度≥600C ； (d)在O— 55°C，保存时间≥3h。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。
7.—种权利要求1所述突变的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶； (b)分离所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)之前，所述方法还包括以下步骤: (1)提供一假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (2)将所述多核苷酸序列中对应于野生型假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密码子突变为编码Tyr的密码子，并且任选地，将所述多核苷酸序列中编码氨基酸Arg2、Leu24、Leu77、Ile87、Leul34和Leul45中的一个或多个密码子AGG、CTA、CTA、ATA、CTA和CTA替换为大肠杆菌相对应的偏爱密码子，从而制得编码权利要求I所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (3)将上一步骤制得的所述多核苷酸序列导入宿主细胞，从而制得权利要求5所述的宿主细胞。
9.一种改造嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (1)提供一假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (2)将所述多核苷酸序列中对应于野生型假交替单胞菌属的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列中的第97位Asp的密码子突变为编码Tyr的密码子，从而制得编码突变的嘌呤核苷磷酸化酶的多核苷酸序列； (3)表达上一步骤制得的所述多核苷酸序列，从而制得突变的嘌呤核苷磷酸化酶。
10.一种权利要求1所述的突变的嘌呤核苷磷酸化酶的用途，其特征在于，用于催化肌苷进行磷酸解反应；或用作对肌苷进行磷酸解反应的催化剂。
【文档编号】C12N15/70GK103468656SQ201310451323
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】李子樵, 沈露 申请人:上海蓝怡科技有限公司