专利名称：金丽假交替单胞菌新菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水产有益微生物筛选技术领域，具体涉及一种金丽假交替单胞菌新菌株及其应用。
背景技术：
水产养殖业作为当代一个快速发展的产业，在带来丰富水产食品的同时也创造了数万亿美元的经济价值。联合国粮农组织(FAO)的数据报告显示，2006年世界水产养殖业总产量达到5163万吨，占2006年世界渔业总产量的36%。自1970年以来，世界水产养殖业规模以平均每年9. 2%的速度增长，而与之形成对比的是，捕捞业和陆地养殖业的年平均增长速度分别只有1. 4%和2. 8%。然而在迅速发展、创造巨大财富的同时，水产养殖业也面临着严峻的考验，例如伴随着水产养殖业的集约化生产、养殖动物产品的商业化以及行业内部竞争日益激烈的趋势，水产养殖病害相继发生，给养殖业带来了巨大的损失。由于水产养殖动物始终处于养殖环境中，对养殖水体的组成及环境相当敏感，当养殖水体中的病原菌数量达到一定程度时， 会导致水产养殖动物疾病的产生以及养殖环境的失衡。此外，由于养殖密度过高或者投饵不力而造成“宿主动物-致病菌-环境”的平衡被打破，最终引发水产养殖动物一系列疾病的暴发。针对这一情况，各国养殖者普遍采用了施加抗生素的方法。抗生素虽然在一定程度上可抑制或杀死病原菌，提高水产养殖动物的生存率，但是却会产生很多负面效应，因而受到许多专家学者的质疑，Schwarz等针对抗生素在动物中的过量使用和存在的潜在危险做出了具体的论述。抗生素这种化学治疗方法的滥用会增加病原细菌的耐药性，产生大量耐药性菌株。20世纪90年代，许多亚洲国家水产品数量急剧下滑的主要原因之一就是抗生素的滥用，其中也包括我们国家。中国作为世界上水产养殖业最发达的国家之一，在控制水产养殖病害方面，却走过不少弯路。由于抗生素的盲目使用及其它多种因素，对虾病害日益严重，导致1993年暴发性虾病的大流行，致使我国的对虾产量减少了 70%，对虾养殖业蒙受了巨大的经济损失。如今，抗生素对发光弧菌病(luminescent vibriosis)已没有任何治疗效果。另一方面，抗生素的滥用会破坏和干扰养殖环境中的正常微生物区系，导致微生态平衡失调。同时，水产养殖中抗生素的滥用也给人类健康带来了巨大威胁。养殖环境中已产生抗生素抗性的病原菌质粒很有可能转移到一些人类病原菌中，增加人类疾病治疗的困难程度；人们不断食用抗生素残留的水产品，体内抗生素的大量积累也会成为危害健康的一大杀手。因此，许多国家都对抗生素的使用实行了比较严格的控制。人们在质疑或否定使用抗生素的同时，也在积极寻找更为安全有效的水产养殖病害防治方法。有益菌(probiotics)由于其对病原菌良好的抑制能力而受到越来越多的关注。有益菌作为抗生素的替代品应用于水产养殖体系中，使水环境条件得到修复，病原菌得到控制，养殖动物抗病力得到增强，已逐渐成为水产养殖动物病害防治的一种生物控制模式。利用自然环境中的有益菌对水产养殖环境进行生物调节(microbial intervention),其抑菌范围宽，针对多种病原菌引起的疾病都有很好的防治效果。当前，许多国家已意识到水产养殖中应用有益微生物和免疫制剂的经济价值及其潜在的社会效益，日益重视有益微生物的研究与开发，加大了这方面的科技投入。我国863科技攻关项目中就有针对这一方面的内容。因此，有益菌的开发以及在水产养殖中的应用已成为国内外研究热点，具有广阔的发展空间。许多有益菌都能对水产养殖中的病原微生物产生拮抗作用，抑制病原菌的生长， 从而达到“以菌治菌”的效果。最初用于水产养殖中的有益菌制剂来自为陆地动物设计的商品制剂，其中以陆生芽孢杆菌(Bacillus)和乳酸杆菌(Lactobacillus)等的使用最为广泛。这些制剂在一定程度上能够抑制病原菌的生长，并促进动物生长。但考虑到水生动物与陆生动物的生存环境、生长发育过程和肠道细菌区系组成存在差异，来自非养殖水体的有益菌制剂可能会对养殖动物造成伤害，或者不能尽快成为优势菌而失去微生态调节的功效。因此，从养殖水体环境以及养殖动物体表或体内分离土著菌来作为潜在有益菌成为国内外的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种金丽假交替单胞菌新菌株及其应用，即一种能抑制水产病害微生物的有益菌，从而弥补现有技术的不足。本发明的技术方案如下本发明的金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas f lavipulchra)的JGl菌株，已于2011年6月四日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号为CGMCC NO. 5009。金丽假交替单胞菌JGl菌株的培养温度范围为8°C 37°C，最佳培养温度为生长的PH值范围为5. O 12. 0，最适pH值为7. 5 8. 0，使用的培养基为2216E。本发明的菌株可用来制成用于抑制水产养殖病原菌的生长或增强水产养殖动物免疫力的菌制剂。上述的菌制剂中包含有金丽假交替单胞菌JGl菌株的活菌。上述的菌制剂为饲料添加剂。本发明还涉及一种产自JGl菌株的Pfa蛋白，其特征在于1)所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ；2)将1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白效果，由1)所衍生的蛋白。本发明还提供一种核苷酸，包括有1)所述的核苷酸，用于编码氨基酸序列为SEQ ID NO 1的蛋白质；2)所述的核苷酸，用于编码1)中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白质效果的，由1)所衍生的蛋白质。上述的核苷酸的序列为SEQ ID NO :2。所述的Pfa抑菌蛋白用作水产饲料添加剂。本发明的金丽假交替单胞菌JGl菌株，可通过细菌素蛋白、小分子化合物等多种方式达到抑菌效果，能够抑制多种水产养殖动物常见病原菌；对斑马鱼、虾蛄、扇贝、蛤蜊等动物试验的结果表明JGl对动物本身没有毒副作用，其制备的菌制剂能有效的作为水产养殖中的增效剂在实际生产中得到应用。所代谢生产的Pfa蛋白具有明显的抑菌效果，可用作提高水产动物的免疫制剂。
图1 本发明的抑菌蛋白Pfa的筛选电泳图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的菌株进行详细的描述。一、金丽假交替单胞菌JGl菌株的筛选2006年4月发明人将取自胶南卓越养殖厂的健康大菱鲆养殖海水的水样涂布于海洋细菌培养基2216E平板上，培养7d之后观察发现黄色单菌落周围14mm范围内无其他菌株生长，形成明显的抑菌圈.随即挑取该单菌落进行继代培养，直至得到纯化菌株， 命名代号为JGl。通过观察细胞形态、运动性，进行革兰氏染色、氧化酶等试验以及使用API20E试剂条对细菌进行生理生化鉴定。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)，对菌株JGl进行鉴定，并结合细菌16S rDNA序列确定本发明筛选的菌株为JGl鉴定为金丽假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas flavipulchra)0二、金丽假交替单胞菌JGl菌株的形态、理化参数1、金丽假交替单胞菌JGl菌株的形态特征菌株JGl在2216E平板上培养M小时的单菌落为圆形、全缘、湿润、半透明、易挑取，直径1 2mm，产生橙黄色色素。于4°C放置IOd左右，菌落边缘开始模糊，发生泳动现象。2、培养条件本发明筛选的金丽假交替单胞菌JGl菌株的生长温度范围为8°C 37°C，在下菌株能在最短时间内达到平台期JGl菌株的生长pH值范围为5. O 12. 0，最适pH值为 7. 5 8. 0。培养基可以选用2216E液体或固体培养基，也可以用其它的海洋细菌培养基。3、生化反应参数菌株JGl的生理生化特征如下表，其与杀鱼假交替单胞菌的比较也列在下表
权利要求
1.金丽假交替单胞菌I^seudoalteromonasf Iavipulchra的JGl菌株，其保藏编号为 CGMCC NO. 5009。
2.如权利要求1所述的JGl菌株，其培养温度范围为8°C 37°C。
3.如权利要求2所述的JGl菌株，其培养温度为^°C。
4.权利要求1所述的JGl菌株用于制备抑制水产养殖病原菌生长或增强水产养殖动物免疫力的菌制剂。
5.如权利要求4所述的菌制剂，其特征在于所述的菌制剂中包含有金丽假交替单胞菌 JGl菌株的活菌。
6.如权利要求5所述的菌制剂，其特征在于所述菌制剂为饲料添加剂。
7.权利要求1所述的JGl菌株生产的Pfa蛋白，其特征在于1)所述蛋白的氨基酸序列为SEQID NO 1 ；2)将1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白效果，由1)所衍生的蛋白。
8.编码权利要求7所述的Pfa蛋白的核苷酸，其特征在于1)所述的核苷酸用于编码氨基酸序列为SEQID NO 1的蛋白质；2)所述的核苷酸，用于编码1)中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有1) 中蛋白质效果的，由1)所衍生的蛋白质。
9.如权利要求8所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQIDNO :2。
10.如权利要求7所述的Pfa蛋白在制备水产饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种金丽假交替单胞菌新菌株及其应用，其中金丽假交替单胞菌JG1菌株，其保藏编号为CGMCC NO.5009；JG1菌株代谢生产出Pfa蛋白。本发明的金丽假交替单胞菌JG1菌株，可通过细菌素蛋白、小分子化合物等多种方式达到抑菌效果，能够抑制多种水产养殖动物常见病原菌；对斑马鱼、虾蛄、扇贝、蛤蜊等动物试验的结果表明JG1对动物本身没有毒副作用，其制备的菌制剂能有效的作为水产养殖中的增效剂在实际生产中得到应用。所代谢生产的Pfa蛋白具有明显的抑菌效果，可用作提高水产动物的免疫制剂。
文档编号C12R1/01GK102304484SQ20111023336
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者于敏, 史晓翀, 张晓华, 汤开浩, 金光 申请人:中国海洋大学