专利名称：一种动物细胞的超低温保存溶液及保存方法
技术领域：
本发明涉及生物保存技术，特别地，涉及一种动物细胞的超低温保存溶液及保存方法。
背景技术：
在低于-80℃的超低温状态下，各种细胞内部的生化反应极其缓慢甚或终止，利用这一原理，将细胞置于-196℃以下，使其生命活动“固定”而非死亡，需要时以适当的方法解冻，恢复其活性的方法即为细胞的超低温保存。
冻存过程中引起细胞损伤或死亡的情况很多，其对细胞造成的伤害主要有以下几个方面1)细胞膜流动性减小，细胞膜僵化将导致细胞的进一步损伤；2)在复温过程中产生氧自由基；3)导致细胞坏死和凋亡。
但是至今为止，除少数几种细胞以外，超低温的保存技术还不成熟，而且很难形成一套统一的方案。可见，超低温保存液的成分尚需要进一步的改良与优化。这对于采用离体细胞通过体外组装成的人工器官尤其重要。且有望用于化妆品和药品临床前的体外安全性检测等。因此，本专利针对超低温保存引起的细胞损伤现象，改良超低温保存液成分，提高超低温保存效果。
随着中药现代化，中药有效成分具有抑制细胞凋亡、稳定细胞膜和清除自由基等保护功能，可以通过各自机制保护细胞免于超低温状态下的细胞受损。以下是文献所报道的部分中药有效成分的一些具体作用。甘草酸[1]对细胞有抑制凋亡、清除氧自由基的功效，苦参碱在0.2～10mg/L浓度范围下能清除自由基，保护细胞膜结构，减轻细胞的损伤，且能明显抑制由肿瘤坏死因子所诱导的体外大鼠肝细胞的凋亡，且对细胞功能有很强的促进作用。山莨菪碱[2]有稳定细胞膜和抗氧自由基损伤的作用。五味子乙素[3]对两种不同自由基产生系统所引起的肝细胞脂质过氧化损伤均有保护作用，使肝细胞存活串提高，并能保持细胞膜形态完整。有相关功效的中药有效成分还有丹参素[4]、黄芪多糖[5]、柴胡皂甙[6]等。
因此，这些中药中的有效成分均是离体细胞超低温保存的良好保护剂。根据超低温损伤机理，所添加的中药保护成分，主要用来清除氧自由基、抑制钙通道、增加细胞膜的稳定性和抑制超低温引起的细胞凋亡等渠道来保护超低温保存中的离体细胞。但至今未有文献报道将五味子乙素、山莨菪碱、甘草酸、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙等中药有效成分应用于离体细胞的超低温保存。
史桂兰，胡志浩，甘草酸药理作用及临床应用研究进展，天津药学2001，13(1)10-12。
王火、张淑环、黄良生，樟柳碱和山莨菪碱预防急性肺损伤的实验研究，中国急救医学，1999，19(11)19-20。
刘耕陶，五味子乙素对原代培养大鼠肝细胞脂质过氧化的抗氧化作用，中国药理学报，1989，10(4)353[4]张文生朱陵群张丽慧牛福玲，丹参素对缺氧/缺糖损伤神经细胞线粒体的保护作用，北京中医药大学学报，2004，27(3)53-56[5]李汶霞，孙圣刚，袁慧，王海涛，张颜波，孙保亮，黄芪多糖对星形胶质细胞培养液中自由基系统损伤保护作用的时间依赖性，中国临床康复，200610(11)59-61[6]周世文，周宁，徐传福。中草药抗肝细胞损伤有效成分研究进展，中国药学杂志，1995，30(2)67-69。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种动物细胞的超低温保存溶液，同时，也提供一种应用此保存溶液进行超低温的保存方法。
该发明的基本思路是在动物细胞基础培养基中加入各种保护因子，抑制因为超低温保存所造成的细胞损伤，而且超低温保存中以及前后的预培养和复温培养中都添加了保护因子，强化其对细胞的保护作用。该保护因子主要由中药有效成分组成。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种动物细胞的超低温保存溶液，它包括动物细胞基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜和中药有效成分山莨菪碱、五味子乙素、甘草酸、苦参碱、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙；所述动物细胞基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜的体积比为7∶2∶1，各中药有效成分的浓度分别为山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
进一步地，所述动物细胞基础培养基为1640培养基、HTS液、L-15或Ham’sF12。
一种应用上述超低温保存溶液进行的超低温保存方法，用于保存动物细胞，它包括如下步骤(1)将刚分离得到的或已经过一段时间培养的动物细胞在二氧化碳培养箱中预培养0～24小时；(2)将预培养后的动物细胞在权利要求1所述的超低温保存溶液中保存0～48月；(3)保存完毕后，在二氧化碳培养箱中复温培养。
进一步地，所述动物细胞是从组织器官中分离得到的原代细胞。
进一步地，所述步骤(1)和(3)中，所述二氧化碳培养箱中，为防止细胞在逐渐升温过程中受损，使用的动物细胞基础培养基中添加了各保护因子，其组成为钙离子Ca2+0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
本发明专利的有益效果是，通过独特的中药有效成分和其他化学保护剂成分的添加，优化了超低温保存液配方，较好地通过超低温保存方法维持细胞的生物学活性及特异性功能。同时，在-80～-196℃下超低温保存情况下，细胞运输和保存过程中不需要任何营养和氧气供给，操作简单可行，为离体细胞的长期保存和远程运输带来便利，具有很大的实用价值。
具体实施例方式
下面根据具体实施例详细介绍本发明内容，本发明的目的和效果将变得更加明显。
为了克服现有的超低温保存过程中保存细胞效果差的严重不足，本发明以基于添加各种不同功能的中药保护成分为主要发明创造点，此外结合廉价的化学保护剂来研制一种有效的用于超低温保存离体细胞的溶液，同时也提供一种相应的便于操作的超低温保存方法。
在预培养和复温过程中，为了防止细胞在逐渐升温时受到损伤，二氧化碳培养箱中在现有的动物细胞基础培养基中加入了各种保护因子Ca2+0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L，pH调节至7.4；二氧化碳培养箱的培养条件为37℃，内含5％的二氧化碳。
现有的基础培养基可为Eagle’s MEM，DMEM，Ham’s F10或12，DMEM/F12，PRMI 1640，L-15，M199，Williams’E等培养基。
本发明的超低温保存溶液是在0.7升现有的动物细胞基础培养基中加入0.2升的胎牛血清(FBS)、0.1升二甲基亚砜(DMSO)、0～500mg/L的山莨菪碱、0～100mg/L的五味子乙素、0～100mg/L的甘草酸、0～100mg/L的苦参碱、0～100mg/L的丹参素、0～100mg/L的黄芪多糖、0～100mg/L的柴胡皂甙，最终pH为7.4。
超低温保存溶液所使用的动物细胞基础培养基可为1640培养基，HTS液，L-15，Ham’s F12等。
超低温保存方法的步骤为将体外培养或刚分离得到的细胞先在正常培养温度(37℃)下采用含有效保护成分的培养基来预培养0～24小时，将培养基切换成0～4℃的超低温冻存溶液，保存细胞密度为5.0×106/毫升，放入-80℃冰箱过夜保存(12～15小时)后，再将其放入液氮中保存0～48月。保存完毕后采用37℃水浴快速复温，采用新鲜的动物细胞培养基进行复温培养，该培养基仍添加了有效保护成分。
保存和培养细胞的方式有悬浮培养、贴壁培养、凝胶包埋培养、聚球体培养等。这样所得到的高活率细胞可用于人工器官和其他医药研究。
实施例1新鲜分离肝细胞，Williams’E培养基(添加有5mg/L苦参碱、5mg/L山莨菪碱、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、10mg/L柴胡皂甙)，37℃，5％CO2培养箱悬浮预培养0.5小时。将培养基换成1640培养基，该溶液成分为50％的1640培养基，添加体积比为10％的二甲基亚砜(DMSO)，此外复合保存液中还添加有100mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、50mg/L五味子乙素、50mg/L甘草酸、100mg/L黄芪多糖、100mg/L柴胡皂甙等，细胞最终密度1×107。-80℃冰箱过夜保存(15-20小时)，最后放入液氮中保存15天。于37℃水浴中进行解冻，然后进行复温培养。该复温时使用的Williams’E培养基中添加了与预培养时相同成分的保护剂，复温并贴壁培养24小时、48小时、96小时后检测各项指标。
单层贴壁培养方式下，使用添加有各种中药保护成分的超低温保存液与不含中药保护成分的超低温保存液的结果差别
由实验数据，加药组与对照组相比，其细胞存活率更高，可见使用添加有各种中药成分的超低温保存液其保存效果优于普通超低温保存液。
实施例2将无菌条件下收获的软骨细胞，置于37℃进行凝胶包埋，注入中空纤维丝，细胞密度为1×105。将中空纤维丝组件放入5cm玻璃皿，浸没于DMEM/F12培养基(培养液中的添加成分10mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、10mg/L柴胡皂甙，3mMCa2+。)，37℃，5％CO2培养箱静置预培养2h。将培养基换成保护剂添加含量和成分均相同的的HTS液，-80℃冰箱过夜保存(15-20小时)，最后放入液氮中保存2个月。于37℃水浴解冻，复温时使用的DMEM/F12培养基中也添加了与预培养时同样成分的保护剂，复温并贴壁培养24小时、48小时、96小时后检测各项指标。
凝胶包埋培养方式下，使用添加有各种中药保护成分的超低温保存液与不含中药保护成分的超低温保存液的结果差别
实施例3将无菌条件下收获的成纤维细胞细胞，置于37℃进行聚球体培养，注入中空纤维丝，细胞密度为1×106。将中空纤维丝装入硅胶管，加入RPMI 1640培养基(培养液中的添加成分10mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、10mg/L柴胡皂甙，3mMCa2+。)，37℃，5％CO2培养箱静置预培养1h。将培养基换成保护剂添加含量和成分均相同的的UW液，-80℃冰箱过夜保存(15-20小时)，最后放入液氮中保存5个月。于37℃水浴解冻，复温时使用的RPMI 1640培养基中也添加了与预培养时同样成分的保护剂，复温并贴壁培养24小时、48小时、96小时后检测各项指标。
聚球体培养方式下，使用添加有各种中药保护成分的超低温保存液与不含中药保护成分的超低温保存液的结果差别如下
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种动物细胞的超低温保存溶液，其特征在于，它包括动物细胞基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜和中药有效成分山莨菪碱、五味子乙素、甘草酸、苦参碱、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙。所述动物细胞基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜的体积比为7∶2∶1，各中药有效成分的浓度分别为山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
2.根据权利要求1所述的超低温保存溶液，其特征在于，所述动物细胞基础培养基为1640培养基、HTS液、L-15或Ham’s F12。
3.一种应用权利要求1所述的超低温保存溶液进行的超低温保存方法，用于保存动物细胞，其特征在于，它包括如下步骤(1)将刚分离得到的或已经过一段时间培养的动物细胞在二氧化碳培养箱中预培养0～24小时。(2)将预培养后的动物细胞在权利要求1所述的超低温保存溶液中保存0～48月。(3)保存完毕后，在二氧化碳培养箱中复温培养。
4.根据权利要求3所述的超低温保存方法，其特征在于，所述动物细胞是从组织器官中分离得到的原代细胞。
5.根据权利要求3所述的超低温保存方法，其特征在于，所述步骤(1)和(3)中，所述二氧化碳培养箱中，为防止细胞在逐渐升温过程中受损，使用的动物细胞基础培养基中添加了各保护因子，其组成为钙离子Ca2+0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。
6.根据权利要求5所述的超低温保存方法，其特征在于，所述动物细胞基础培养基为Eagle’s MEM、DMEM、Ham’s F10、Ham’s F12、DMEM/F12、PRMI 1640、L-15、M199或Williams’E。
全文摘要
本发明公开了一种动物细胞的超低温保存溶液及保存方法，用于保存细胞，特别是新鲜分离的原代动物细胞，如肝细胞，它是通过将已分离的动物细胞在37℃下预培养0～24小时后，将培养基切换成0～4℃的超低温保存溶液，然后在－80～－196℃下超低温保存0～48个月。保存结束后，采用新鲜细胞培养基在37℃条件下进行复苏培养，最后采用正常动物细胞培养基进行培养。在保存过程以及前后的培养基中采用添加中药有效成分以及其他化学保护剂，提高动物细胞经过超低温保存后的存活率以及细胞功能。本发明提出的离体动物细胞长期超低温保存技术，可以为生物人工肝及其他人工器官提供所需细胞的运输和保存手段，同时也可保存动物细胞用于其他医药研究领域。
文档编号C12N5/06GK101037667SQ200710067090
公开日2007年9月19日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者孟琴, 鲁燕华, 沈冲 申请人:浙江大学