专利名称：水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP及其重组植物超表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，特别涉及水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP，还涉 及该突变基因的重组植物超表达载体。
背景技术：
叶绿体是植物细胞和真核藻类的重要细胞器，是植物进行光合作用的场所。高等 植物的叶绿体具有由许多片层组成的片层系统，每个片层由周围闭合的两层膜组成，呈扁 囊状，称为类囊体。小类囊体垛叠在一起形成基粒，光合色素主要集中在基粒之中，光系统 II多存在于基粒类囊体的垛叠区，光合作用过程中光能向化学能的转化是在类囊体膜上进 行的。类囊体囊腔是类囊体膜包裹着的狭小区域，囊腔内充满溶液，大约含有80-200个蛋 白。囊腔内最为丰富的蛋白复合体有光系统II的外在蛋白PsbO、PsbP和PsbQ，以及质体 蓝素，此外还包括亲免疫因子、分子伴侣、蛋白质水解相关蛋白和大量公开蛋白如TL29。类 囊体囊腔蛋白虽然未直接参与到光电子传输，但对光合作用、类囊体的结构及发生起着重 要作用。例如，Dgel是一粘附在类囊体膜囊腔侧的蛋白酶，其通过降解光系统II反应中心 蛋白Dl参与光抑制的修复。TLP40(thylakoid lumen PPIase)是一定位于类囊体腔的亲 免素，其在光合作用中发挥着双重功能影响类囊体膜蛋白的去磷酸化和可能在质体发育 早期起到关键作用。TLP18. 3(thylakoid lumenprotein of 18. 3kDa)与光系统II中心蛋 白Dl的降解和合成有关，直接或间接地参与到光系统II三聚体在类囊体处的组装。类囊 体囊腔蛋白主要功能还包括协助类囊体蛋白的折叠和水解以及保护其免受氧胁迫等。水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白基因OsTLP的核苷酸序列已有文献报道，但其相关功 能迄今为止尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种与叶绿素含量提高相关的水稻叶绿体 类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP ；目的之二在于提供所述突变基因OsTLP重组植物超表达 载体，从而为植物光合作用研究以及高产育种研究提供有力的工具。为达到上述目的，首先，本发明提供了一种水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因 OsTLP，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。发明人在前期研究工作中发现了一个水稻高叶绿素含量突变体(李贤勇等.一 个水稻高叶绿素含量基因的发现.西南农业学报，2002，15 (4) :122-123 ；李贤勇等.一个 水稻高叶绿素基因的生物学特性研究.西南农业学报，2004，17 (3) 292-294 ；Wang FH et al. Heredity, physiology and mapping of a chlorophyll contentgene ofrice(Oryza sativa L). Journal ofPlant Physiology, 2008,165(3) :324_330)。本发明以该突变体为 材料，在前期基因定位的基础上，克隆了水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP。测序 结果显示该突变基因OsTLP全长cDNA为774bp，由3个外显子组成，编码257个氨基酸。与野生型珍汕97B相比，该突变基因OsTLP在第1个外显子上有G-T转换，并导致第71位 的脯氨酸(P)改变为苏氨酸(T)。其次，本发明提供了含有所述水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP的重组 植物超表达载体。进一步，所述重组植物超表达载体是在改良pCAMBIA1301载体的多克隆位点中 插入水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP而获得；所述改良pCAMBIA1301载体由 PCAMBIA1301载体与pCHFl载体改造而来，即采用限制性内切酶EcoR I和Hind III将 pCHFl载体中包括CaMV35S启动子及多克隆位点Sac I,KpnI,Smal I.BamH I.Sal I禾Π Pst I的片段切下，再连接至同样经EcoR I和Hind III双酶切的pCAMBIA1301载体上。本发明将突变基因OsTLP重组植物超表达载体采用农杆菌转化法转化烟草，通过 GUS染色及PCR扩增验证了阳性转基因烟草植株，与对照植株(转空载体植株及未转化植 株)相比，转基因烟草叶片颜色变绿。扫描电镜结果显示，转基因烟草植株的叶绿体结构发 生了变化。从而推测本发明的突变基因OsTLP是通过改变植物叶绿体类囊体的结构而提高 了植物叶绿素的含量。本发明的有益效果在于本发明发现了一个和叶绿素含量提高相关的水稻突变基 因OsTLP，并构建了其重组植物超表达载体，为植物光合作用研究以及高产育种研究提供了 有力的工具。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为基因OsTLP的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定，M泳道为DL1，200DNA Marker, 1泳道为基因OsTLP (高叶绿素突变体)的RT-PCR产物，2泳道为基因OsTLP (野生 型)的RT-PCR产物；图2为重组载体pMD19T_0sTLP的酶切鉴定，M泳道为DNA Marker II，1泳道为EcoR I酶切pMD19T-0sTLP (高叶绿素突变体)，3泳道为EcoR I/Hind III酶切pMD19T_0sTLP (高 叶绿素突变体)，4泳道为EcoR I酶切pMD19T-0sTLP(野生型)，5泳道为EcoR I/Hind III 酶切pMD19T-0sTLP (野生型)；图3为基因OsTLP编码蛋白的氨基酸同源性对比结果，箭头所指处为基因OsTLP 的突变位点；图4为突变基因OsTLP重组植物超表达载体改良pCAMBIAl301-OsTLP的构建示 意图；图5为突变基因OsTLP重组植物超表达载体改良pCAMBIAl301-OsTLP的酶切鉴 定，M 泳道为 DNA Marker, 1 2 泳道为 BamH I/Pst I 酶切改良 pCAMBIAl301-OsTLP，3 泳 道为 BamH I/Pst I 酶切 pMD19T_0sTLP，4 泳道为 BamH I/Pst I 酶切改良 pCAMBIA1301 ；图6为转基因烟草的⑶S染色检测，A为转改良pCAMBIA1301空载体的烟草叶片， B为转改良pCAMBIA1301-0sTLP的烟草叶片，C为非转基因烟草叶片；图7为转基因烟草的PCR鉴定，M泳道为DNA marker，1 4泳道为转改良 pCAMBIAl301-OsTLP的烟草，5泳道为改良pCAMBIAl301-OsTLP质粒DNA的阳性对照，6泳道为转pCAMBIA1301空载体的烟草，7泳道为非转基因烟草，8泳道为无菌水代替DNA的阴性 对照；图8为转基因烟草的照片，A为转pCAMBIA1301空载体的烟草，B为转改良 pCAMBIAl301-OsTLP 的烟草；图9为转基因烟草叶片的照片，A为转pCAMBIA1301空载体的烟草叶片，B为转改 良pCAMBIAl301-OsTLP的烟草叶片；图10为转基因烟草叶绿体类囊体的电镜观察，A为转pCAMBIA1301空载体的烟草 叶片，B为转改良pCAMBIAl301-OsTLP的烟草叶片。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例中使用的材料野生型水稻材料珍汕97B(Wt.)和高叶绿素突变体 (Mut.)由重庆市农业科学研究院提供；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA 聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、PMD19-T载体、Trizo 1试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DLl, 200DNA Marker 购自 TaKaRa 公司；DNA Marker II购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素(Kanamycin，Kan)为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有 限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌JM109、农杆菌 GV3101由本实验室保存。一、突变基因OsTLP的克隆与测序根据GenBank已登录的水稻日本晴基因OsTLP序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0 软件设计特异引物上游引物 OsTLP F :5，-gtacgtttgtaatgacgtcatc-3，(SEQ IDNo. 2)；下 游引物 OsTLP R :5，-gaatttggacgagttgtacttg-3，(SEQ ID No. 3)。分别取水稻野生型和高叶绿素突变体光照培养两周的幼叶2g，迅速放入液氮中研 磨成粉末，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。所得水稻野生型和高叶绿素突变体总RNA 的电泳结果显示主带清晰完整，28S和18S的条带亮度比约为2 1，说明RNA的浓度和纯 度符合实验要求，可以用于合成双链cDNA。分别以所得水稻野生型和高叶绿素突变体总RNA为模板，按照M-MLV逆转录酶说明书，使用Oligo(dT)引物进行逆转录获得水稻野生型和高叶绿素突变体cDNA ；再以逆转 录合成的cDNA为模板，采用特异引物OsTLP F/0sTLP R及高保真DNA聚合酶PFU进行PCR 扩增，PCR反应条件为94°C预变性4分钟；然后94°C变性30秒，50°C复性30秒，72°C延伸 2分钟，共32个循环；最后72°C延伸10分钟。将RT-PCR产物进行1. 0% (g/mL)琼脂糖 凝胶电泳检测，再按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行切胶回收纯化；纯化的DNA片段与 PMD19-T载体在T4DNA连接酶的作用下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感 受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小后测 序，得重组载体pMD19T-0sTLP。基因OsTLP的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图1所示，可见OsTLP (野生型)和OsTLP (高叶绿素突变体)的RT-PCR产物均在约850bp处呈单一特异性条带，与 GenBank报道的基因OsTLP大小相符。重组载体pMD19T_0sTLP的酶切鉴定结果如图2所示，可见pMD19T_0sTLP (野生型)和pMD19T-0sTLP (高叶绿素突变体)用EcoR I/Hind III双酶切均可得到约900bp的 目的片段，与预期结果相符，证实目的片段已连入PMD19-T载体。测序结果显示，水稻野生型和高叶绿素突变体的OsTLP全长cDNA均为774bp，由3 个外显子组成，编码257个氨基酸。其中，高叶绿素突变体的OsTLP全长cDNA序列如SEQ ID No.l所示。与野生型相比，高叶绿素突变体的基因OsTLP在第1个外显子上发生了 1个 碱基突变，即第211位的G突变为T，该突变导致了编码蛋白第71位氨基酸的差异，野生型 为脯氨酸(Pro)，高叶绿素突变体为苏氨酸(Thr)。利用DNA Man软件对水稻OsTLP、拟南芥 AtTLP及蓖麻RcTLP编码蛋白的氨基酸序列进行比对，结果如图3所示，水稻OsTLP与拟南 芥AtTLP、蓖麻RcTLP编码蛋白的同源性高达50%以上。二、突变基因OsTLP重组植物超表达载体的构建及转化改良pCAMBIA1301载体由pCAMBIA1301与pCHFl改造而来，即采用限制性内切 酶EcoR I和Hind III将pCHFl载体中包括CaMV35S启动子及多克隆位点Sac I、Kpn I、 Smal I、BamH I、Sal I和Pst I的片段切下，再连接至同样经EcoR I和Hind III双酶切 的pCAMBIA1301载体上。改良pCAMBIA1301载体可以直接将要表达的目标基因片段通过多 克隆位点插入在CaMV35S启动子的后面进行表达，简便易行，适用于所有基因重组植物超 表达载体的构建。将含有突变基因OsTLP的重组载体PMD19T_0sTLP用BamH I/Pst I双酶切，回 收突变基因OsTLP片段，再与同样经BamH I/Pst I双酶切的改良pCAMBIA1301载体在 T4DNA连接酶的作用下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用 含有卡拉霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定，即得突变基因OsTLP重组 植物超表达载体改良pCAMBIA1301-0sTLP，其构建过程如图4所示。采用冻融法将改良 pCAMBIA1301-0sTLP转化农杆菌GV3101，所得阳性土壤农杆菌株于_80°C保存备用。改良pCAMBIAl301-OsTLP的酶切鉴定结果如图5所示，目的片段突变基因OsTLP 已经连入改良PCAMBIA1301载体中。三、烟草的遗传转化与鉴定将烟草在MS培养基上无菌培养3周后，取无菌烟草苗的幼嫩、健壮叶片，切去边 缘，切除主脉，切成Icm2左右的小块，浸入上述阳性土壤农杆菌株的MS悬液中共培养。转 化植株的再生和培养按照文献方法进行(Horsch RB et al. Asimple and general method for transferring genes into plants. Science. 1985,277 -.1229 1231)。转基因烟草的GUS染色检测取烟草转基因植株的各组织(包括叶、茎、根)，用无 菌水冲洗3 4次，置盛有X-Gluc溶液的小离心管中(保证外植体全部浸入溶液中)，37°C 温育过夜，取出组织材料，用体积分数为95%的乙醇脱色后，在显微镜下观察是否有蓝色斑 点出现(以非转基因烟草为阴性对照)。结果如图6所示，改良pCAMBIA1301空载体及改良 pCAMBIAl301-OsTLP已成功转入烟草中。转基因烟草的PCR检测取烟草转基因苗幼嫩叶片为材料，用改良CTAB法小量提 取烟草基因组DNA，再以所得DNA为模板，非转基因烟草基因组DNA和无菌水为阴性对照，改良pCAMBIA1301-0sTLP质粒DNA为阳性对照，以OsTLP基因特异引物(OsTLP F/0sTLP R)进行转基因烟草的PCR鉴定，PCR反应条件为94°C预变性4分钟；然后94°C变性30秒，50°C 复性30秒，72°C延伸2分钟，共32个循环；最后72°C延伸10分钟。结果如图7所示，改良 PCAMBIA1301空载体及改良pCAMBIA1301_0sTLP已成功转入烟草中。转基因烟草及转基因烟草叶片的照片分别如图8和图9所示，从外观来看，与转 PCAMBIA1301空载体的烟草叶片相比，转改良pCAMBIA1301_0sTLP的烟草叶片变绿。从叶绿 素含量测定来看，转改良pCAMBIA1301-0sTLP的烟草叶片的叶绿素含量提高了 20%左右， 初步推测突变基因OsTLP与叶绿素含量提高有关。转基因烟草叶绿体类囊体的电镜观察将烟草转基因苗幼嫩叶片同一部位用刀片 切成Imm2左右的小块，用体积分数为25%的戊二醛固定液(用浓度为0. lmol/L、pH为7. 2 的磷酸缓冲液配制，0 4°C保存)进行前固定4小时，用浓度为0. lmol/L、pH为7. 2的磷 酸缓冲液清洗3次后，再用质量体积分数为的四氧化锇固定液(用浓度为0. Imol/L.pH 为7. 2的磷酸缓冲液配制)进行后固定2 3小时，用浓度为0. lmol/L、pH为7. 2的磷酸 缓冲液清洗3次后，依次用体积分数为40 %、50 %、70 %、90 %、100 %、100 %、100 %的丙酮 逐级脱水，每次15分钟，再用体积比依次为1 3、1 1、3 1的环氧树脂-丙酮混合物 进行渗透，最后用100%环氧树脂于30°C包埋5小时，再升温至60°C聚合36 48小时。包 埋块经LKB超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，在JEM100CX型透射电镜下观 察并拍照。结果如图10所示，与转pCAMBIA1301空载体的烟草叶绿体类囊体相比，转改良 pCAMBIA1301-0sTLP的烟草叶绿体类囊体垛叠层明显密集，且垛叠层增厚。因此，推测突变 基因OsTLP是通过改变植物叶绿体类囊体的垛叠程度提高了植物的叶绿素含量。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP，其特征在于具有如SEQID No.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP的重组植物超表达 载体。
3.根据权利要求2所述的重组植物超表达载体，其特征在于所述重组植物超表达载 体是在改良PCAMBIA1301载体的多克隆位点中插入水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因 OsTLP而获得；所述改良pCAMBIA1301载体由pCAMBIA1301载体与pCHFl载体改造而来，即 采用限制性内切酶EcoR I和Hind III将pCHFl载体中包括CaMV35S启动子及多克隆位点 Sac I,Kpn I,Smal I.BamH I.Sal I禾Π Pst I的片段切下，再连接至同样经EcoR I禾Π Hind III双酶切的pCAMBIA1301载体上。
全文摘要
本发明公开了水稻叶绿体类囊体囊腔蛋白突变基因OsTLP，具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，其可能通过改变植物叶绿体类囊体结构而提高植物叶绿素含量；还公开了含有该突变基因的重组植物超表达载体，为植物光合作用研究以及高产育种研究提供了有力的工具。
文档编号C12N15/29GK101838656SQ20101017705
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者岳彩黎, 王贵学, 秦峰, 胡锋, 黄俊丽 申请人:重庆大学