专利名称：水稻高叶绿素含量突变基因det1及其重组植物超表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，特别涉及水稻高叶绿素含量突变基因DET1 ，还涉及该突变 基因的重组植物超表达载体。
背景技术：
水稻是C3植物，其光呼吸较强，有效光合速率较低，尤其是在高温伏旱区水稻的灌 浆期，由于气温高，其光呼吸将浪费大量的光合产物，不但会影响产量，还会严重影响米质。 因此，提高有效光合速率是提高水稻产量和改善米质的一条有效途径。提高有效光合速率 的途径是降低光呼吸或提高光合速率，而C3植物的生理和解剖结构决定了其高光呼吸特 性，由于叶绿素是水稻光合作用必备的物质基础，因此，通过提高叶绿素含量来提高光合速 率是提高水稻有效光合速率的一条有效途径。发明人在前期研究工作中发现了一个由简单遗传的高叶绿素性状的突变株系， 并对其遗传行为和生理功能进行了研究，结果表明该性状由显性单基因控制；该基因的主 要生理功能是通过显著提高叶绿素b的含量来实现总叶绿素含量的提高，从而通过提高 对光能的“捕捉”能力来提高光合速率，可提高生物产量和经济产量16%以上，降低垩白 粒率17%左右；分子标记定位结果显示该基因定位于水稻第1染色体短臂，与微卫星标记 RM 6464、RM6340和RM462之间的遗传距离分别为0cM、0. 588cM和1. 18cM(李贤勇等.一 个水稻高叶绿素含量基因的发现.西南农业学报，2002，15 (4) :122-123;李贤勇等.一个 水稻高叶绿素基因的生物学特性研究.西南农业学报，2004，17 (3) 292-294 ；Wang FH et al. Heredity,physiology and mapping of a chlorophyll content gene of rice(Oryza sativa L.). Journal of Plant Physiology, 2008,165(3) :324_330)。因此，确定该基因的 核苷酸序列，将有利于高产优质水稻的育种研究，促进水稻生产上一个新的台阶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻高叶绿素含量突变基因的核苷酸序 列；目的之二在于提供所述水稻高叶绿素含量突变基因的重组植物超表达载体，从而为水 稻转基因研究提供有力的工具，促进高产优质水稻的育种研究。为达到上述目的，首先，本发明提供了水稻高叶绿素含量突变基因DET1，具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。本发明在前期基因定位的基础上，先通过基因预测、同源搜索及基因序列差异比 较，初步确定了水稻高叶绿素含量突变基因为DETl (DE-ETIOLATED 1)。随后，本发明以水稻 高叶绿素突变体为材料，克隆了突变基因DETl的cDNA。测序结果显示突变基因DETl全 长cDNA为1536bp，由11个外显子组成，编码512个氨基酸。与野生型珍汕97B相比，突变 基因DETl在第7个外显子上有T-C的转换，该改变引入了一个EcoR I酶切位点，并导致第 328位的亮氨酸(L)改变为丝氨酸(S)，且突变位点处于高度保守区域内。突变基因DETl的氨基酸序列与玉米等其它高等植物的氨基酸序列同源性高达62%以上。其次，本发明提供了含有所述水稻高叶绿素含量突变基因DETl的重组植物超表 达载体。进一步，所述重组植物超表达载体是在pCUPHN载体的多克隆位点中插入水稻高 叶绿素含量突变基因DETl而获得；所述pCUPHN载体由pCAMBIA_1300载体改造而来，即在 pCAMBIA-1300载体的多克隆位点处通过限制性内切酶PstI引入玉米泛素启动子基因，之 后通过Sac I和Spe I引入HA标签基因，再通过Spe I及EcoR I引入终止子NOS基因。本发明的有益效果在于本发明提供了一个与水稻叶绿素含量提高相关的突变基 因DET1，并构建了其重组植物超表达载体，为水稻转基因研究提供了有力的工具，可促进高 产优质水稻的育种研究。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中图1为基因DETl的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定，1泳道为DL2，000DNA Marker，2泳道为空白对照，3泳道为DETl (高叶绿素突变体)的RT-PCR产物， 4泳道为DETl (野生型)的RT-PCR产物；图2为重组载体pMD19T-DETl的酶切鉴定，1泳道为DNA Marker III，2泳道为Spe I酶切pMD19T-DETl (高叶绿素突变体)，3泳道为Spe I/BamH I酶切pMD19T_DETl (高叶 绿素突变体)，4泳道为Spe I酶切pMD19T-DETl(野生型)，5泳道为Spe I/BamH I酶切 PMD19T-DET1 (野生型)；图3为基因DETl包含突变位点的部分核苷酸序列对比结果，下划线部分为突变引 入的EcoR I酶切位点；图4为基因DETl编码蛋白的氨基酸同源性对比结果，箭头所指处为基因DETl的 突变位点，下划线所示区域为基因DETl的高度保守区域；图5为基因DETl的系统进化树；图6为基因DETl编码蛋白的亲水性和疏水性分析；图7为突变基因DETl重组植物超表达载体pCUPHN-DETl的构建示意图；图8为突变基因DETl重组植物超表达载体pCUPHN-DETl的PCR鉴定，1泳道为 DNAMarker III，2泳道为空白对照，3泳道为pCUPHN-DETl的PCR产物，4泳道为pCUPHN的 PCR产物(阴性对照)，5泳道为pMD19T-DETl的PCR产物(阳性对照)；图9为突变基因DETl重组植物超表达载体pCUPHN-DETl的酶切鉴定，1泳道为 λ -Hind III DNA Marker，2 泳道为 Spe I 酶切 pCUPHN-DETl，3 泳道为 Spe I/BamH I 酶切 pCUPHN-DETl，4 泳道为 Spe I 酶切 pCUPHN，5 泳道为 Spe I/BamH I 酶切 pCUPHN，6 泳道为 DNA Marker III。
具体实施例方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例中使用的材料野生型水稻材料珍汕97B(Wt.)和高叶绿素突变体(Mut.)由重庆市农业科学研究院提供；M-MLV逆转录酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA 聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、PMD19-T载体、Trizo 1试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL2, 000DNA Marker 购自 TaKaRa 公司；DNA Marker III购自天根生化科技(北京)有限公司；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉 霉素(Kanamycin，Kan)为Sigma公司产品；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有 限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌JM109、农杆菌 GV3101由本实验室保存。本发明在前期基因精细定位的基础上，首先通过在线基因预测(http://mendel. cs. rhul. ac. uk)及 BLAST 在线比对(http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/)，初步确定了水稻 高叶绿素含量突变基因为DET1。基因DETl在番茄、拟南芥、玉米、高粱中有报道。在番茄 中，基因DETl使总叶绿素含量提高，整个植株均表现为深绿色。在拟南芥中，基因DETl调 控一光调控启动子的启动能力，当喜光植物拟南芥处于黑暗环境中时，基因DETl通过时空 调节光调控启动子的启动能力；此外，基因DETl还可以通过调节蛋白酶体的降解来调控拟 南芥的昼夜纪律钟。随后，本发明以水稻高叶绿素突变体为材料，克隆了突变基因DETl的cDNA，利用 生物信息学手段对突变基因DETl的核苷酸序列、进化树、编码蛋白的理化性质及亲疏水性 等进行了分析，并构建了突变基因DETl重组植物超表达载体用于水稻的转基因研究。一、突变基因DETl的克隆与测序根据GenBank已登录的水稻日本晴基因DETl序列，利用Primer5. 0和01igo6. 0 软件设计特异引物上游引物 DETlF :5，-cggatccggtgatggcgaccttcttc-3，(SEQID No. 2)， 下划线部分为 BamH I 酶切位点；下游引物 DETlR :5'-ggactagtccg-ctcacaactgttacaaatac -3’ (SEQ ID No. 3)，下划线部分为Spe I酶切位点。分别取水稻野生型和高叶绿素突变体光照培养两周的幼叶2g，迅速放入液氮中研 磨成粉末，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。所得水稻野生型和高叶绿素突变体总RNA 的电泳结果显示主带清晰完整，28S和18S的条带亮度比约为2 1，说明RNA的浓度和纯 度符合实验要求，可以用于合成双链cDNA。分别以所得水稻野生型和高叶绿素突变体总RNA为模板，按照M-MLV逆转录酶说 明书，使用Oligo(dT)引物进行逆转录获得cDNA ；再以逆转录合成的cDNA为模板，采用特 异引物DET1F/DET1R及高保真DNA聚合酶PFU进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性 4分钟；然后94°C变性30秒，60°C复性30秒，72°C延伸2分钟，共32个循环；最后72°C延 伸10分钟。将RT-PCR产物进行1. 0% (g/mL)琼脂糖凝胶电泳检测，再按照DNA凝胶回收 试剂盒说明书进行切胶回收纯化；纯化的DNA片段与pMD19-T载体在T4DNA连接酶的作用 下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平 板筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定片段大小后测序，得重组载体PMD19T-DET1。基因DETl的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定如图1所示，可见DETl (野生型) 和DETl (高叶绿素突变体)的RT-PCR产物均在约1600bp处呈单一特异性条带，与GenBank 报道的基因DETl大小相符。
重组载体pMD19T-DETl的酶切鉴定结果如图2所示，可见pMD19T_DETl (野生型) 和pMD19T-DETl (高叶绿素突变体)用Spe I/BamH I双酶切均可得到约1600bp的目的片 段，与预期结果相符，证实目的片段已连入PMD19-T载体且为正向连接。测序结果显示，水稻野生型和高叶绿素突变体的DETl全长cDNA均为1536bp，编 码512个氨基酸。其中，高叶绿素突变体的DETl全长cDNA序列如SEQ ID No. 1所示。基 因DETl包含突变位点的部分核苷酸序列对比结果如图3所示，与野生型相比，高叶绿素突 变体的基因DETl由11个外显子组成，在第7个外显子上发生了 1个碱基突变，即第983位 的T突变为C，该突变引入了一个EcoR I酶切位点，并导致了编码蛋白第328位氨基酸的差 异，野生型为亮氨酸(Leu)，高叶绿素突变体为丝氨酸(Ser)。二、突变基因DETl的生物信息学分析禾IjM NCBI ψ 白勺 ORF Finder (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html) it 开放卖框i只另ll ；^1Jffl CDD(conserved domain database) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)进行蛋白质保守结构域分析；利用Clustalx和DNA Man软 件进行氨基酸序列的比对及进化树的生成；利用ExPASy (http ://Cn. expasy. org/)在线分 析蛋白质结构及其理化特性。ORF Finder软件分析显示突变基因DETl由一个完整且连续的开放阅读框组成。⑶D分析显示基因DETl有两个高度保守区域，分别为从第282到336位氨基酸和 第400到442位氨基酸，突变基因DETl的突变位点发生在第一个高度保守区域内。突变基因DETl编码蛋白的氨基酸序列比对结果如图4所示，突变基因DETl (图中 表示为 OsDETl)与拟南芥 AtDETl (GenBank 登录号为 NP_192756)、番茄 SlDETl (GenBank 登 录号为 Q9ZNU6)、高粱 SbDETl (GenBank 登录号为 XP_002443935)、玉米 ZmDETl (GenBank 登 录号为NP_001147932)及蓖麻RcDETl (GenBank登录号为XP_002519399)编码蛋白的同源 性高达62%以上，且突变位点发生在高度保守区域内。突变基因DETl的系统进化树如图5所示，突变基因DETl (图中表示为OsDETl)与 高粱SbDETl的亲缘性较近，与玉米ZmDETl的亲缘性次之。突变基因DETl编码蛋白的组成及理化性质分析表明其编码蛋白由512个氨基酸 组成，相对分子质量为59126. 8，分子式为C2683H4mciN716O768S16，等电点(pi)为7. 65，丝氨酸含 量高达10. 6%。通过在线软件ExPASy中的ProtParam工具对突变基因DETl编码蛋白进行亲疏 水性分析，结果如图6所示，统计结果显示GRAVY (Grand average ofhydropathicity)值 为-0. 098，说明突变基因DETl编码的蛋白质为亲水性蛋白质，这可能与基因的功能相关， 因为叶绿素的合成是一个需要水参与的过程，该基因产物的亲水性增加，有利于水分的运 输，从而加快叶绿素的生物合成。三、突变基因DETl重组植物超表达载体的构建pCUPHN载体由pCAMBIA-1300载体改造而来，即在pCAMBIA_1300载体的多克隆位 点处通过限制性内切酶Pst I引入玉米泛素启动子(Ubi Promter)基因，之后通过Sac I 及SpeI引入HA标签(tag)基因，再通过Spe I及EcoR I引入了终止子NOS基因。玉米泛 素启动子具有较强的启动能力，特别适合于在禾本科植物中应用。HA tag尽管不是双元表 达载体中所必须的，但它的引入为将来分离纯化基因的表达产物提供了很大便利。PCUPHN载体适用于所有植物基因的表达。将含有突变基因DETl的重组载体PMD19T-DET1用BamH I/Spe I双酶切，回收突变基因DETl片段，再与同样经BamH I/Spe I双酶切的pCUPHN载体在T4DNA连接酶的 作用下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有卡拉霉素的LB 平板筛选阳性克隆，提取质粒，PCR和酶切鉴定，即得突变基因DETl重组植物超表达载体 pCUPHN-DETl，其构建过程如图7所示。随后将pCUPHN_DETl转化农杆菌GV3103，-80°C保 存备用。突变基因DETl重组植物超表达载体pCUPHN-DETl的PCR鉴定和酶切鉴定结果分 别如图8和图9所示，目的片段突变基因DETl已经连入pCUPHN载体中。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
水稻高叶绿素含量突变基因DET1，其特征在于具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述水稻高叶绿素含量突变基因DET1的重组植物超表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组植物超表达载体，其特征在于所述重组植物超表达载 体是在PCUPHN载体的多克隆位点中插入水稻高叶绿素含量突变基因DET1而获得；所述 pCUPHN载体由pCAMBIA-1300载体改造而来，即在pCAMBIA_1300载体的多克隆位点处通过 限制性内切酶Pst I引入玉米泛素启动子基因，之后通过Sac I和Spe I引入HA标签基因， 再通过Spe I及EcoR I引入终止子N0S基因。
全文摘要
本发明公开了水稻高叶绿素含量突变基因DET1，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，还公开了含有该突变基因的重组植物超表达载体，为水稻转基因研究提供了有力的工具，可促进高产优质水稻的育种研究。
文档编号C12N15/29GK101831439SQ201010177039
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月19日 优先权日2010年5月19日
发明者岳彩黎, 王贵学, 秦峰, 胡锋, 黄俊丽 申请人:重庆大学