专利名称：一种通过检测叶绿素含量鉴别蜂胶与杨树胶的方法
技术领域：
本发明涉及蜂胶与杨树胶鉴别技术领域，特别是通过叶绿素含量的含量检测来鉴别蜂胶与杨树胶的一种方法。
背景技术：
蜂胶具有降血脂、降血糖、提高人体免疫力、增强机体抵抗力、抗氧化、抗肿瘤、预防感染等多种生物学特性，被广泛地应用在人体保健和疾病治疗之中，是近年来国内外蜂广品研究和开发的热点。蜂胶是西方蜜蜂采集植物芽、叶或树皮破裂处分泌的树脂并混入蜜蜂上颚腺分泌 物和蜂蜡而成的芳香固体物，被蜜蜂涂布在蜂箱的缝隙、框耳等处，经人工收集的具有天然属性的蜜蜂产品。我国天然蜂胶年产量约400吨，每公斤收购价在400元。杨树胶是人工利用杨柳科杨属植物的嫩枝、幼芽、树皮等进行熬制提取的胶体，是国内假蜂胶的主要类型，其成本价每公斤150元左右。由于杨树胶价格便宜，受利益驱动，目前我国蜂胶市场上有相当数量的产品是以杨树胶冒充的蜂胶产品，这一现象倍受国内蜂业界及有关部门的关注。蜂胶和杨树胶在感官性状上十分相似，总黄酮类物质化学成分相差无几，依据目前国内关于蜂胶的相关标准，难以区分两者。比如1、中华人民共和国农业部发布NY5136-2002无公害食品蜂胶中，用高效液相色谱法测定蜂胶中的总黄酮含量，仪器昂贵，过程繁杂，而且八种黄酮高良姜素、芦丁、槲皮素、杨梅酮、莰菲醇、芹菜素、松属素、柯因标样价格昂贵，国内购买不全。而且杨树胶中也同样含有前述八种黄酮只是各自的比例不同，无法从根本上区分蜂胶和杨树胶。2、中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布GB/T 24283-2009蜂胶中，用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，测定蜂胶中的总黄酮含量，检测仪器和和对照品成本较高，而且杨树胶中以芦丁为对照的总黄酮与蜂胶中总黄酮相同，同样无法区分蜂胶和杨树胶。3、NY5136-2002和GB/T 24283-2009中，均有测定乙醇提取物含量和氧化时间，在相同条件下杨树胶同样可以满足这两项检测指标，也无法区分蜂胶和杨树胶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效鉴别蜂胶和杨树胶的方法。本发明的技术问题通过下述方法解决
一种检测叶绿素含量鉴别蜂胶与杨树胶的方法，以丙酮提取试样中的叶绿素，用乙醚分层萃取，硫酸钠溶液洗涤净化，于两处一定的波长下比色定量，进行鉴别；具体工艺步骤如下
a、分析步骤
a.I、蜂胶的炮制及提取取毛蜂胶样品，先在-5 一 10°C以下冷冻24 48小时，然后捣碎精密称定；置于玻璃研钵中，加与样品等量的碳酸钙及石英砂，研磨，加相当两倍样品量的乙醇继续研磨成糊状；将研磨物全部转移至具塞锥形瓶中，用乙醇洗涤研钵至无色，使乙醇量达到样品量的二十倍，密塞、冷浸、振摇混匀、静置24 48小时，用63玻璃漏斗抽滤，用丙酮水溶液洗涤抽干；将漏斗内残渣倒回研钵中加丙酮水溶液研磨，再转移至漏斗中，抽滤，继续用丙酮水溶液洗涤研钵及漏斗中的残渣，至滤液无色，使用丙酮水溶液量达到样品量的二十倍；精密吸取总抽滤液的四分之一，置于干燥恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，在90°C 110°C温度下干燥3小时并冷却至室温，迅速精密称定重量，以干燥品计算出毛蜂胶中浸出物的含量(％);
a.2、试样的溶解取上述干燥蜂胶提取物，精密称定，置烧杯中，加丙酮水溶液使供试品全部溶解，备用；
a.3、分离净化将上述试样溶解液全部转入内盛硫酸钠溶液的分液漏斗中，用乙醚分次洗涤烧杯，并入分液漏斗中，振摇，使分层，水层放入另一分液漏斗中，加试样溶解液五分之三的乙醚萃取，弃去水层；有机层并入第一个分液漏斗中，用水洗涤，弃去水层；将乙醚层通过一装有无水硫酸钠的小漏斗滤入棕色容量瓶中，用试样溶解液五分之一的乙醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠层中的色素，定容，摇匀，待用；
a.4、测定取上述溶液到棕色容量瓶中，用乙醚定容，摇匀，立即于分光光度计上测定642nm及660nm波长处的吸光值,用乙醚作空白。a. 5通过一定的公式计算出试样中叶绿素的含量。所述试剂为化学纯或分析纯，水为蒸馏水。所述试剂包括乙醇、碳酸钙、石英砂试剂级、丙酮、无水硫酸钠、乙醚、丙酮水溶液及硫酸钠水溶液中的一种。所述的试剂无水硫酸钠为在650°C灼烧4h的无水硫酸钠。所述的试剂丙酮水溶液的质量体积比为85+15，V/V。所述的试剂硫酸钠水溶液为2%，m/V。上述试样及加入物为固体时以g为计量单位，试样及加入物为液体时以ml为计量单位，在倍数换算时Ig相当于1ml。本发明采用极性较低的有机溶剂萃取和分离蜂胶或以杨树皮或芽为材料制成的杨树胶中的叶绿素，以分光光度法对其含量进行定量检测，分别求出蜂胶和杨树胶各自叶绿素含量的最高值和平均值，设定蜂胶叶绿素含量安全限值为15mg/100g，通过对比检测叶绿素含量可准确鉴别蜂胶和杨树胶。如果被检测样品叶绿素含量值<15mg/100g，可判定样品是真蜂胶；如果被检测样品叶绿素含量值> 15mg/100g，可判定样品是假蜂胶，或是在蜂胶中掺入了杨树胶，检测样品叶绿素含量值越高说明杨树胶掺入量越大。本发明的检测方法简便，检测样品及设备简单易得，检测准确率高。具体实施方法 实施例I
方法原理以丙酮提取试样中的叶绿素，用乙醚分层萃取，硫酸钠溶液洗涤净化，于642nm及660nm波长下比色定量。试剂乙醇。仪器设备
多孔电子恒温水浴锅，分光光度计，具塞锥形瓶、250ml，瓷蒸发皿，玻璃研钵、150ml, G3玻璃砂芯漏斗，分液漏斗、250ml，棕色容量瓶、50ml，移液管、IOml、20ml。I、分析步骤
I.I、蜂胶的炮制及提取取毛蜂胶样品5g，先在-5°C下冷冻24h，然后捣碎精密称定；置于玻璃研钵中，加碳酸钙5g及石英砂5g，缓缓研磨成极细粉，加乙醇IOml继续研磨成糊状；将研磨物全部转移至250ml具塞锥形瓶中，用乙醇洗涤研钵近无色，使乙醇的总体积至100ml，密塞，冷浸，前6h内时时振摇，再静置18h，全部用G3玻璃漏斗抽滤，用丙酮水溶液(85%)反复洗漆锥形瓶至漏斗内抽干；将漏斗内残洛倒回研钵中用丙酮水溶液研磨5min,再转移至漏斗中，抽滤，继续用丙酮水溶液反复洗涤研钵及漏斗中的残渣，至滤液近无色，使用丙酮水溶液的总体积为IOOml。精密吸取抽滤液50ml，置于干燥恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，在110°C干燥3h，置干燥器中冷却30min至室温，迅速精密称定重量，以干燥品计算出毛蜂胶中浸出物的含量(％)。I. 2、试样的溶解取上述干燥蜂胶提取物约0. 2g，精密称定，置50ml烧杯中，加丙酮水溶液(85%) 50ml使供试品全部溶解，得50ml试样溶液，备用。I. 3、分离净化将上述试样溶解液全部转入内盛50mL 2%硫酸钠溶液的250ml分液漏斗中，用20ml乙醚分次洗涤烧杯，并入分液漏斗中，振摇lmin，使分层，水层放入另一分液漏斗中，加20ml乙醚萃取，弃去水层；有机层并入第一个分液漏斗中，用水洗涤两次，每次20ml，弃去水层。将乙醚层通过一装有5g无水硫酸钠的小漏斗滤入50ml棕色容量瓶中，用乙醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠层中的色素，定容，摇匀，待用。I. 4、测定取上述溶液IOml到50ml棕色容量瓶中，用乙醚定容，摇匀，立即于分光光度计上测定642nm及660nm处的吸光值，I cm比色皿，用乙醚作空白。I. 5结果计算
按下式(I)、( 2 )计算试样中的总叶绿素质量分数含量。X1= . 12A660+16 . 8A642 ....................................... (I)
X2= [(X1XVXF) (mX 1000)] XlOO ............... (2)
式中A1 —样液中总叶绿素的含量，单位为毫克每升(mg/L)；
A 一相应波长处(660nm，642nm)测得吸光值；
X2 一试样中总叶绿素的质量分数,单位为毫克每100克(mg/100g)
V一提取液的总体积，单位为晕升(ml)；
F一试样的稀释倍数； m 一试样的质量,单位为克(g)；
测定结果取平行试验结果的算术平均数，保留小数点后第一位。平行试验允许误差(相对)不大于3%。a.杨树(芽)胶的检测结果见下表I :表I吸光值吸光值I相对误差I叶绿素含量 样口口编 5 取样里(匕)A642A660(%)(n g./100g)
杨树胶 I0.2026CL 1300. 125L 375, I
杨树胶 II0. 20010, 2130, 1951,5124. 4
杨树胶III0.20390, 1910. 180I. 3HO. I
权利要求
1.一种检测叶绿素含量鉴别蜂胶与杨树胶的方法，以丙酮提取试样中的叶绿素，用乙醚分层萃取，硫酸钠溶液洗涤净化，于两处波长下比色定量，进行鉴别；具体工艺步骤如下 a、分析步骤 a. I、蜂胶的炮制及提取取毛蜂胶样品，先在_5°C 一 10°C下冷冻24 48小时，然后捣碎精密称定；置于玻璃研钵中，加与样品等量的碳酸钙及石英砂，研磨，加相当两倍样品量的乙醇继续研磨成糊状；将研磨物全部转移至具塞锥形瓶中，用乙醇洗涤研钵至无色，使乙醇量达到样品量的二十倍，密塞、冷浸、振摇混匀、静置24 48小时，用G3玻璃漏斗抽滤，用丙酮水溶液洗涤抽干；将漏斗内残渣倒回研钵中加丙酮水溶液研磨，再转移至漏斗中，抽滤，继续用丙酮水溶液洗涤研钵及漏斗中的残渣，至滤液无色，使用丙酮水溶液量达到样品量的二十倍；精密吸取总抽滤液的四分之一，置于干燥恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，在90°C 110°C温度下干燥3小时并冷却至室温，迅速精密称定重量，以干燥品计算出毛蜂胶中浸出物的含量(％); a. 2、试样的溶解取上述干燥蜂胶提取物，精密称定，置烧杯中，加丙酮水溶液使供试品全部溶解，备用； a. 3、分离净化将上述试样溶解液全部转入内盛硫酸钠溶液的分液漏斗中，用乙醚分次洗涤烧杯，并入分液漏斗中，振摇，使分层，水层放入另一分液漏斗中，加试样溶解液五分之二的乙醚萃取，弃去水层；有机层并入第一个分液漏斗中，用水洗涤，弃去水层；将乙醚层通过装有四分之一乙醚量的无水硫酸钠的小漏斗滤入棕色容量瓶中，用试样溶解液五分之三的乙醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠层中的色素，定容，摇匀，待用； a. 4、测定取上述溶液到棕色容量瓶中，用乙醚定容，摇匀，立即于分光光度计上测定642nm及660nm波长处的吸光值,用乙醚作空白； a. 5计算出试样中叶绿素的含量。
2.根据权利要求I所述的一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，其特征在于所述试剂为化学纯或分析纯，水为蒸懼水。
3.根据权利要求I或2所述的一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，其特征在于所述试剂包括乙醇、碳酸钙、石英砂试剂级、丙酮、无水硫酸钠、乙醚、丙酮水溶液及硫酸钠水溶液中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，其特征在于所述的试剂无水硫酸钠为在650°C灼烧4h的无水硫酸钠。
5.根据权利要求3所述的一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，其特征在于所述的试剂丙酮水溶液的质量体积比为85+15，V/V。
6.根据权利要求3所述的一种蜂胶与杨树胶的鉴别方法，其特征在于所述的试剂硫酸钠水溶液为2%, m/Vo
全文摘要
本发明提供了一种检测叶绿素含量鉴别蜂胶与杨树胶的方法，以丙酮提取试样中的叶绿素，用乙醚分层萃取，硫酸钠溶液洗涤净化，于两处一定的波长下比色定量，进行鉴别。本发明采用极性较低的有机溶剂萃取和分离蜂胶或以杨树皮或芽为材料制成的杨树胶中的叶绿素，以分光光度法对其含量进行定量检测，分别求出蜂胶和杨树胶各自叶绿素含量的最高值和平均值，设定蜂胶叶绿素含量安全限值为15mg/100g，通过对比检测叶绿素含量可准确鉴别蜂胶和杨树胶。本发明的检测方法简便，检测样品及设备简单易得，检测准确率高。
文档编号G01N1/34GK102778437SQ20121017585
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘泊, 杨茂森, 王鑫 申请人:杨茂森