一种水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法与流程

本发明涉及一种水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法，属于食品检测分析技术领域。

背景技术：

在我国种植业中，水果和蔬菜仅次于粮油，分列第三位和第二位。水果、蔬菜及其制品与我国居民日常生活密不可分，是居民膳食不可或缺的重要组成部分。叶绿素是绿色植物光合作用的基础物质，可反映植物的生长发育状况、生理代谢变化以及营养状况，因此，叶绿素含量常常用作研究植物生长发育的生理指标，对于富含叶绿素的水果、蔬菜及其制品尤其如此。在水果、蔬菜及其制品生产、加工、贸易、管理中往往均需对叶绿素含量进行检测和评价。

目前，国内外已针对植物材料开展了大量研究，建立了分光光度法、荧光光谱法、高效液相色谱法、高校液相色谱质谱法和反射光谱法等多种叶绿素含量测定方法。其中荧光光谱法和反射光谱法前处理比较复杂；而高效液相色谱法和高效液相色谱质谱法的检测过程中，叶绿素容易对仪器造成污染，不适合大批量样品的检测；分光光度法，是研究最为透彻的一种方法，该方法具有简便、经济、实用等诸多优点，被广泛认可和使用；因此，本研究采用分光光度法对叶绿素含量进行检测。

叶绿素含量测定的分光光度法又有多种方法，例如丙酮法、乙醚法、乙酸乙酯、石油醚、二甲基亚砜法、二甲基酰胺法、无水乙醇法、丙酮乙醇水混合液法等，提取溶剂差异很大。并且，研究内容大多是针对植物叶片中叶绿素含量的测定，涉及到水果和制品的研究鲜有报道。此外，我国制定的叶绿素含量测定的方法标准只有2个，gb/t22182-2008和ny/t1287-2007，均是针对油菜籽中叶绿素含量的测定，水果和蔬菜及制品中叶绿素含量测定方法标准在我国尚属空白。

技术实现要素：

为克服现有技术不足，本发明提供一种水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法，旨在为保障食品安全和质量提供技术支持。

本发明技术方案如下：

一种水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法，包括制备供试样品和比色法检测。

所述制备供试样品的方法包括：准确称取适量待测样品于容器中，加入适量提取溶剂，封口密封后于室温下避光提取，过滤，制得供试样品；备用。

优选地，将待测样品切成细丝或匀浆后进行提取。对于含水量较少的待测样品(例如葡萄干)，可以加入适当比例(例如等重量)的蒸馏水后再进行匀浆处理。

优选地，采用丙酮/乙醇(v:v＝1/1)的混合液作为提取溶剂。

优选地，以g/ml计，待测样品(或经匀浆后制备的待测样品)与提取溶剂的比例为0.5:100-300，例如0.5:100、0.5:150、0.5:200、0.5:250、0.5:300。

具体地，当待测样品为菠菜时，以g/ml计，待测样品(或经匀浆后制备的待测样品)与提取溶剂的比例为0.5:100或0.5:200。

或者，以g/ml计，待测样品(或经匀浆后制备的待测样品)与提取溶剂的比例为0.5:10-50，例如0.5:10、0.5:20、0.5:30、0.5:40、0.5:50。

具体地，当待测样品为黄瓜时，以g/ml计，待测样品(或经匀浆后制备的待测样品)与提取溶剂的比例为0.5:10-30，例如0.5:10、0.5:20、0.5:30。

优选地，所述提取时间为5-24h，例如5h、10h和24h；优选为5h。

具体地，当待测样品为菠菜时，所述提取时间为5-24h，例如5h、10h和24h；优选为5h。

具体地，当待测样品为黄瓜时，所述提取时间为5-10h，例如5h、10h；优选为5h。

具体地，当待测样品为莴苣、绿茄子或韭菜花时，以g/ml计，待测样品或经匀浆后制备的待测样品与提取溶剂的比例为2:10-30，优选为2:10。

具体地，当待测样品为猕猴桃、青苹果或葡萄干时，以g/ml计，待测样品或经匀浆后制备的待测样品与提取溶剂的比例为5:10-30，优选为5:10。

更具体地，所述制备供试样品的方法包括：准确称取适量匀浆后的待测样品于容器中，加入适量提取溶剂，封口密封后于室温下避光提取5-10h，过滤，制得供试样品；所述提取溶剂为丙酮/乙醇(v:v＝1/1)的混合液；当待测样品为菠菜时，以g/ml计，经匀浆后制备的待测样品与提取溶剂的比例为0.5:100或0.5:200；当待测样品为黄瓜时，以g/ml计，经匀浆后制备的待测样品与提取溶剂的比例为0.5:10-30。

具体地，所述叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b。

具体地，所述比色法检测包括检测供试样品在663nm处和645nm处的吸光度值。

结果计算方法：

待测样品中叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素总含量均以质量分数ω表示，单位为毫克每克(mg/g)，分别按公式(1)、(2)和(3)计算。

ω1＝(12.72×a1－2.59×a2)×v/(1000×m)……………………(1)

ω2＝(22.88×a2－4.67×a1)×v/(1000×m)……………………(2)

ω3＝(8.05×a1+20.29×a2)×v/(1000×m)……………………(3)

式中：

ω1——叶绿素a含量；

ω2——叶绿素b含量；

ω3——叶绿素总含量；

a1——供试样品在663nm处的吸光度值；

a2——供试样品在645nm处的吸光度值；

v——供试样品体积，单位为毫升(ml)；

m——待测样品质量，单位为克(g)。

本发明所述水果、蔬菜及其制品包括菠菜、黄瓜、绿茄子、莴苣、猕猴桃、青苹果、葡萄干和韭菜花等。

本发明对水果、蔬菜及制品中叶绿素含量的测定展开了研究，根据叶绿素含量的不同，分别从叶菜类、瓜果类、茄果类、根茎类蔬菜中选择菠菜、黄瓜、绿茄子和莴苣4种蔬菜样品，从浆果类和仁果类水果中选择猕猴桃和青苹果2种水果样品，选择韭菜花和葡萄干2种制品，共计8种样品作为代表性试材，对提取溶剂、提取时间、提取体积和提取方式进行了优化，既能保证检测工作简便、高效、实用、经济，又不至影响检测人员身体健康，同时为果蔬中叶绿素含量测定方法标准的制定提供理论依据。

本发明方法对于待测样品中叶绿素的提取率高，检测方法结果准确，操作简单，分析周期短，可应用于多种水果、蔬菜及其制品中叶绿素的检测，具有较高地推广应用价值。

附图说明

图1表示实验例中不同处理方式对菠菜叶片的提取效果；

图2表示实验例中6种提取溶剂对菠菜和黄瓜中叶绿素的提取效果；

图3为实验例中叶绿素标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下所用仪器与试剂：

u－3900型紫外－可见分光光度计(日本hitachi公司)；shz-b(a)型振荡器(常州诺基仪器有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒－托利多公司)；高速组织捣碎机(0-2000rpm，美国waring公司)。

叶绿素a(纯度90％，10mg，日本和光纯药工业株式会社)；叶绿素b(纯度≥90％，5mg，美国sigma公司)；丙酮、无水乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；实验用水为蒸馏水。

实施例1

水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法，包括如下步骤：

1、制备供试样品

1)深绿色样品：以菠菜为例，准确称取0.5g匀浆试样于三角瓶中，加入100ml提取剂，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取5h，过滤，制得供试样品。

2)绿色样品：以黄瓜为例，准确称取0.5g匀浆试样于三角瓶中，加入10ml提取剂，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取5h，过滤，制得供试样品。

3)浅绿色样品：以莴苣、绿茄子、猕猴桃、青苹果、葡萄干和韭菜花为例，其中，莴苣、绿茄子、韭菜花分别称取2.0g匀浆试样，猕猴桃、青苹果、葡萄干分别称取5.0g匀浆试样于三角瓶中，加入10ml提取剂，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取5h，过滤，制得供试样品。

以上所述提取溶剂为丙酮/乙醇(v:v＝1/1)的混合液。

2、将以上供试样品用紫外分光光度计检测在663nm处和645nm处的吸光度值，以叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b为标准品，按下式计算叶绿素总含量：

待测样品中叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素总含量均以质量分数ω表示，单位为毫克每克(mg/g)，分别按公式(1)、(2)和(3)计算。

ω1＝(12.72×a1－2.59×a2)×v/(1000×m)……………………(1)

ω2＝(22.88×a2－4.67×a1)×v/(1000×m)……………………(2)

ω3＝(8.05×a1+20.29×a2)×v/(1000×m)……………………(3)

式中：

ω1——叶绿素a含量；

ω2——叶绿素b含量；

ω3——叶绿素总含量；

a1——供试样品在663nm处的吸光度值；

a2——供试样品在645nm处的吸光度值；

v——供试样品体积，单位为毫升(ml)；

m——待测样品质量，单位为克(g)。

实际样品的检测结果

采用本方法对市售的黄瓜、绿茄子、莴苣、猕猴桃、青苹果、葡萄干、韭菜花、菠菜(两个品种样品)共8种果蔬及其制品进行了检测，前7种样品中叶绿素的含量分别为0.088mg/g，0.017mg/g，0.0087mg/g，0.029mg/g，0.011mg/g，0.019mg/g，0.062mg/g；品种1菠菜和品种2菠菜中叶绿素的含量分别为1.75mg/g和2.63mg/g。

实施例2

水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法，与实施例1的区别仅在于供试样品的制备方法不同，具体如下：

1)深绿色样品。以叶绿素含量较高的菠菜(同实施例1品种2)为例，准确称取0.5g匀浆试样于三角瓶中，加入150ml提取剂，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取5h，过滤，制得供试样品。

2)绿色样品。以黄瓜为例，准确称取0.5g匀浆试样于三角瓶中，加入10ml提取剂，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取24h，过滤，制得供试样品。

以上所述提取溶剂为丙酮/乙醇(v:v＝1/1)的混合液。

将以上供试样品用紫外分光光度计按实施例相同的方法进行检测。

实际样品的检测结果

1.采用本方法对菠菜样品进行了检测，其叶绿素的含量为2.41mg/g，较100ml提取溶剂的提取效果(2.63mg/g，即实施例1)差，且二者存在显著性差异。

2.采用本方法对黄瓜进行了检测，其叶绿素的含量呈下降趋势，为0.061mg/g，较避光提取5h后的效果(0.088mg/g，即实施例1)差，且二者存在显著性差异。

对比例

水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定方法，与实施例1的区别仅在于供试样品的制备方法不同，具体如下：

1)深绿色样品。以菠菜为例，准确称取0.5g匀浆试样于三角瓶中，加入100ml提取剂丙酮，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取5h，过滤，制得供试样品。

2)绿色样品。以黄瓜为例，准确称取0.5g匀浆试样于三角瓶中，加入10ml提取剂丙酮，三角瓶用封口膜密封，充分摇匀，室温下避光提取5h，过滤，制得供试样品。

将以上供试样品用紫外分光光度计按实施例相同的方法进行检测。

实际样品的检测结果

1.采用本方法对菠菜样品进行了检测，其叶绿素含量为1.08mg/g，较实施例1提取溶剂的提取效果差，且二者存在显著性差异。

2.采用本方法对黄瓜进行了检测，其叶绿素的含量呈下降趋势，为0.043mg/g，较实施例1提取溶剂的提取效果差，且二者存在显著性差异。

实验例

一、实验部分

(一)仪器与试剂

u－3900型紫外－可见分光光度计(日本hitachi公司)；shz-b(a)型振荡器(常州诺基仪器有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒－托利多公司)；高速组织捣碎机(0-2000rpm，美国waring公司)。

叶绿素a(纯度90％，10mg，日本和光纯药工业株式会社)；叶绿素b(纯度≥90％，5mg，美国sigma公司)；丙酮、无水乙醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；实验用水为蒸馏水。(二)样品提取

1.深绿色样品。以菠菜为例，准确称取0.5g试样于三角瓶中，加入提取剂，三角瓶用封口膜密封，室温下避光提取，过滤。

2.绿色样品。以黄瓜为例，准确称取0.5g试样于三角瓶中，步骤同1。

3.浅绿色样品。以莴苣、绿茄子、猕猴桃、青苹果、葡萄干和韭菜花为例，称取2.0g～5.0g试样于三角瓶中，步骤同1。

(三)结果计算

试样中叶绿素a含量、叶绿素b含量和叶绿素总含量均以质量分数ω表示，单位为毫克每克(mg/g)，分别按公式(1)、(2)和(3)计算。

ω1＝(12.72×a1－2.59×a2)×v/(1000×m)……………………(1)

ω2＝(22.88×a2－4.67×a1)×v/(1000×m)……………………(2)

ω3＝(8.05×a1+20.29×a2)×v/(1000×m)……………………(3)

式中：

ω1——叶绿素a含量；

ω2——叶绿素b含量；

ω3——叶绿素总含量；

a1——供试样品在663nm处的吸光度值；

a2——供试样品在645nm处的吸光度值；

v——供试样品体积，单位为毫升(ml)；

m——待测样品质量，单位为克(g)。

二、结果与讨论

(一)样品前处理方法的优化

1.样品处理方式的选择。以叶绿素含量最高的菠菜为例，比较了2种处理方式对叶绿素含量的提取效果，第1种处理方式是将菠菜叶片切成细丝；第2种处理方式是将菠菜叶片切碎，置于高速组织捣碎机中匀浆。然后分别称取相同质量的样品，加入相同体积的提取液进行提取，结果见图1。细丝状菠菜叶片经提取液提取后，大部分叶片已经脱色，但叶脉部分仍有绿色残留(图1a)；匀浆后的菠菜叶片经提取后，残渣已经完全变为白色(图1b)，并且脱色迅速，因此，本实验选择采用高速组织捣碎机处理样品，对于含水量较少的制品(葡萄干)，需按1/1(w/v)的比例加入蒸馏水后进行匀浆处理。

2.提取溶剂的选择。提取叶绿素常用的溶剂一般为丙酮、乙醇、石油醚、乙酸乙酯或是几者的混合液等，由于石油醚的毒性较高，乙酸乙酯具有刺激性气味，且易燃易爆，所以选择丙酮和乙醇为主要提取溶剂，设置了以下6个处理：丙酮、80％丙酮、乙醇、95％乙醇、丙酮/乙醇(v:v＝1/1)、丙酮/乙醇/水(v:v＝4.5/4.5/1)，选择其中叶绿素含量较高的2种代表性蔬菜菠菜和黄瓜为试验对象，扫描测定叶绿素提取液在663nm处和645nm处吸光度值，结果如图2所示。

对于菠菜(图2a)，6种提取溶剂中叶绿素的吸光度值由高到低依次为：丙酮/乙醇(v:v＝1/1)＞乙醇＞丙酮/乙醇/水(v:v＝4.5/4.5/1)＞95％乙醇＞丙酮＞80％丙酮；对于黄瓜(图2b)，6种提取溶剂中叶绿素的吸光度值由高到低依次为：丙酮/乙醇(v:v＝1/1)＞80％丙酮＞丙酮/乙醇/水(v:v＝4.5/4.5/1)＞乙醇＞95％乙醇＞丙酮。

根据公式ω3分别计算出6种提取溶剂中叶绿素的总含量，并进行了方差分析，结果见表1。对于菠菜，经丙酮/乙醇(v:v＝1/1)提取的叶绿素含量最高，且与其他5个处理之间存在显著性差异(p＝0.05)；对于黄瓜，虽然80％丙酮、丙酮/乙醇(v:v＝1/1)以及丙酮/乙醇/水(v:v＝4.5/4.5/1)3种提取剂的提取效果无显著性差异，但为保证与其他试样提取的统一性，本实验最终选择丙酮/乙醇(v:v＝1/1)的混合液作为提取溶剂。

表16种提取溶剂对叶绿素含量的提取效果

注：同一行中的不同小写字母表示差异显著性，p＝0.05，下同。

3.提取体积的优化。同样选择菠菜和黄瓜为试验对象，称取0.5g匀浆样品，分别设置5个提取体积，菠菜的提取体积分别为100ml、150ml、200ml、250ml和300ml，黄瓜的提取体积分别为10ml、20ml、30ml、40ml和50ml，静置5h后检测，结果如表2所示。

对于菠菜，提取体积为100ml时，叶绿素含量最高，但与200ml差别不大，与其他3个处理之间存在显著性差异，考虑到经济成本，选择100ml提取液进行提取。

对于黄瓜，10ml和30ml的提取效果较好，二者与20ml之间差异不显著，40ml和50ml的提取效果较差，且二者与其他3个处理间存在显著性差异，考虑到经济成本，最终选择10ml提取液进行提取。

表2不同提取溶剂体积对叶绿素的提取效果

4.提取时间的优化。以菠菜和黄瓜作为试验对象，分别设置5h、10h和24h，静置提取，结果见表3。对于2种试样，提取时间为5h时叶绿素含量最高。对于菠菜3个处理间并无显著性差异；对于黄瓜，5h和10h间无差异显著性，二者与24h之间差异显著，提取24h后，叶绿素含量反而下降，所以，本实验选择5h为最佳提取时间。

表3不同提取时间对叶绿素的提取效果

5.提取方式的选择。以菠菜和黄瓜作为试验对象，分别设置静置提取和摇床振荡提取2种提取方式，结果见表4。2种提取方式之间无显著差异，考虑到经济成本，本实验最终选择静置提取。

表4不同提取方式对叶绿素的提取效果

(二)方法的线性范围

比色法测定样品的含量，理论依据是朗伯-比耳定律，要得到准确的测定结果，样品测定浓度就必须在其线性范围内。以叶绿素a和叶绿素b为标准物质，在0～0.030mg/g范围内呈现良好的线性(图3)，r²都在0.999以上，符合方法要求。

(三)方法的精密度和准确度

从果蔬及其制品中选择菠菜、黄瓜、绿茄子、莴苣、猕猴桃、青苹果、葡萄干和韭菜花8种样品为试材，分别对叶绿素a和叶绿素b进行低、中和高3个水平的添加回收率试验，每个处理取5个平行样，结果见表5，叶绿素a的回收率为70.8％～109.0％，相对标准偏差在1.2％～9.2％之间，叶绿素b的回收率为70.1％～109.5％，相对标准偏差在1.5％～9.9％之间，表明该方法的准确度和精密度良好。

表58种试材中叶绿素a和叶绿素b的加标回收率及相对标准偏差

(四)实际样品的检测

采用本方法对市售的菠菜、黄瓜、绿茄子、莴苣、猕猴桃、青苹果、葡萄干和韭菜花8种果蔬及其制品进行了检测，8种样品中叶绿素的含量分别为1.75mg/g，0.088mg/g，0.017mg/g，0.0087mg/g，0.029mg/g，0.011mg/g，0.019mg/g和0.062mg/g。

三、结论

本研究以8种果蔬(菠菜、黄瓜、莴苣、绿茄子、猕猴桃、青苹果、葡萄干和韭菜花)为试材，建立了水果、蔬菜及其制品中叶绿素的检测方法。根据样品中叶绿素含量的不同，对提取方法进行了优化。精密度、准确度等指标考察结果表明，该方法操作简单、快速，准确度高，重现性好，适用于水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。