专利名称：一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领 域。
背景技术：
近年来，普洱茶由于其良好的降脂功效和独特品质而受到广泛关注，且有多位 学者报道在普洱茶中发现了洛伐他汀，他汀药物是羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶 抑制剂，是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗，但目前还未有关 于洛伐他汀和普洱茶中微生物的系统研究，也尚未有产洛伐他汀菌株应用在普洱发酵中 的研究。利用红曲霉菌生产红曲米和红曲色素的生产和应用已有上千年的历史，其用途 也由医用领域逐渐扩展到食品领域。红曲霉在发酵过程称产生的次级代谢产物洛伐他汀 做为良好的天然降脂药成为研究与生产的热点，天然红曲中的洛伐他汀多为酸式，其空 间结构与体内HMG-CoA更为接近，无需水解，直接发挥抑制体内胆固醇合成的作用， 其活性较内酯式高约一倍，福建、浙江一带已经开发出多种含有洛伐他汀的功能性荞麦 红酒、饼干等保健食品。在普洱茶研究领域，由于长期缺乏学科的研究，尤其是从微生物的角度来进行 普洱茶的研究。而如何通过对云南普洱茶加工中微生物的研究，控制普洱茶中洛伐他汀 的含量尚未见公开的文献报道。
发明内容
本发明的目的是从微生物的角度对普洱茶进行研究，为生产企业提供生产含洛 伐他汀普洱茶的有益菌株来源。本发明的另一目的是通过控制有益菌种在普洱茶生产中 的比例，为促进云南普洱茶品质稳定和提高发挥作用。本发明的产洛伐他汀真菌，由生产菌株的分离、纯化、经薄层层析初筛、高 效液相复筛工序后得到。生产菌株为产洛伐他汀紫色红曲菌霉(Monascus purpurevs) MPT13,保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010123，保藏单位中国 典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。本发明的紫色红曲霉(Monascuspurpurevs)的形态学特征为培养7d，在PDA培养基上菌落直径达2.9cm，菌落稍隆起，有放射状沟纹，边 缘整齐，气生菌丝稀少，基内菌丝发达，菌落颜色以桔红色为主，边缘为浅肉色；菌落 背面有放射状沟纹，边缘整齐，颜色以深桔红色为主，边缘桔黄色。在麦芽汁培养基上 菌落直径达2.5cm，菌落稍隆起，有放射状深沟纹，边缘整齐，气生菌丝非常稀少，基内 菌丝发达，菌落边缘凹陷，菌落表面有皮膜状，菌落颜色由里到外从土色变成桔红色； 菌落背面有放射状沟纹，有呈开裂状，边缘整齐，颜色呈土色。在察氏培养基菌株生长 弱，菌落平，直径为1.2cm，边缘不整齐，界限不清，气生菌丝稀疏，基内菌丝生长弱，菌落颜色呈淡桔红色；菌落背面颜色呈淡桔红色，边缘界限不清。本发明经公知的初 筛、复筛、天然培养基培养、根霉纯化培养等传统工序后得到。显微形态为菌丝不规则地分枝、有隔膜，内有油滴，壁上附有许多颗粒，直径 为2.9 9.2μιη。分生孢子单生或成链，球形或倒梨形，6.6 9.2 X 7.9 13.1 μ m。闭 囊壳无孔口，球形或稍椭圆形，直径20.4 71.4 μ m，呈桔红色或稍浅红色。子囊孢子 卵形或椭圆形，3.9 5.3X4.7 6.6 μ m。红曲霉所产生的大量酶类和色素对普洱茶品质形成有着重要作用，接种产洛伐 他汀菌株(紫色红曲霉M0nascus pUrpUrevS)MPT13发酵的普洱，在保持传统普洱茶品风 味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点。本发明的产洛伐他汀的真菌应用于普洱茶的生产中。本发明的优点在于将紫色红曲霉(Monascus purpurevs)按一定的比例接种应用
到普洱茶发酵过程中，得到了含洛伐他汀的普洱茶且在保持传统普洱茶风味的基础上， 香气和汤色方面也具有新的特点，并且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶 的开发发挥重要作用。
具体实施例方式实施例1 紫色红曲霉(Monascuspurpurevs)菌种的分离纯化从采集到的样品中，通过PDA培养基(200g马铃薯洗净去皮切块，加水IOOOmL 煮半小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和18g琼脂，121°C灭菌30分钟后倒平板)和麦芽 汁培养基(麦芽汁750 800ml，加水至IOOOmL,加15 18g琼脂，121°C灭菌30分钟 后倒平板)分离纯化。分离纯化方法如下(1)将固体培养基熔化，冷却至45°C，注入无菌培养皿中，每皿约15 20毫 升，稍微摇转，静置，使成平板备用。(2)取要分离的粉碎样品lg，在火焰旁加到装有9ml无菌水的试管中，此时得到 的是10_2的菌悬液。(3)稀释按十倍稀释法把菌悬液稀释至10_8，十倍法是指下一管的菌悬液要比 上一管的稀十倍。(4)接种事先准备好的平板9套，分别标号为10_6、10_7、ΙΟ"8,每个稀释度 写三套平皿，以便比较。在每个已标号的平皿中注入Iml相应的菌悬液，用涂布棒涂均 勻，放入25 28°C培养24小时观察。(5)培养2 5天后，挑取单个菌落，多次划线纯化得到纯化菌株。实施例2:产洛伐他汀紫色红曲霉(Monascuspurpurevs)的筛选(1)液态发酵分离纯化得到的菌株，接种麦芽汁斜面，28°C培养6d后，以IOmL无菌水洗入 带玻璃珠的小三角瓶中制成孢子悬液。取3mL孢子悬液接种于50mL液体种子培养基中 (每250ml三角瓶装液50ml) 30°C，150r/m,培养2 3d至液体颜色微红。按5%的接种量将液体种子培养基接入液体发酵培养基中(250mL装液量 50mL)28°C, 150r/m 培养 12 14d 左右。
(2)薄层层析初筛取发酵液lmL，加乙酸乙酯5mL — 30°C下150r/min振摇3小时一离心，收集上
清液一沉淀再以5mL乙酸乙酯抽提2次一合并上清液，蒸干一以少许苯溶解干燥物一待 苯溶液会发后，加0.2mL甲醇溶解。待测液在薄层层析板上点样10 μ L，在环己烷氯 仿异丙醇=6:3:1的展开剂中展开，吹干后，以10%磷钼酸显色。(3)高效液相复筛取ImL发酵液，加入IOmL甲醇，超声波提取lh，先用滤纸过滤，再用微膜过 滤，收集滤液，进行高效液相检测分析，分析条件为紫外检测波长238nm ；色谱柱 EclipseXDB-C 18 (5 μ m，4.4X 150mm)；流动相:A 甲醇；B 60 % 甲醇；柱温 30 "C ； 洗脱程序0-12min(A 液，100 % -0 ； B 液，0-100 % )，12_15min(100 % B 液)， 15-20min(100% A 液)；流速lmL/min ；进样量10 μ 1。实施例3 紫色红曲霉(Monascuspurpurevs)在普洱茶发酵中的应用将毛茶按传统的方法进行湿热，随后在毛茶中接种重量比5%的紫色红曲霉 (Mcmascus purpurevs)的固态发酵剂让其发酵，定期翻堆，当堆温升高到25士3°C时， Monascus purpurevs开始进行代谢，洛伐他汀为红曲霉的次级代谢产物，在接种发酵后的 3-5天后开始产生，12-15天产量达到最高。经接种紫色红曲霉(Monascus purpurevs)后生产的普洱茶，洛伐他汀含量最高达 到0.263mg/mL，且形成了汤色红浓明亮，滋味甘滑，香气酯香突出的风味特征。
权利要求
1.一种产洛伐他汀真菌，由生产菌株的分离、纯化、经薄层层析初筛、高效液相 复筛工序后得到，其特征在于生产菌株为产洛伐他汀紫色红曲霉(Monascus purpurevs) MPT13,保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010123，保藏单位中国典 型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。
2.权利1所述的产洛伐他汀真菌，其特征在于产洛伐他汀真菌应用于普洱茶的生产中。
全文摘要
本发明涉及一种产洛伐他汀真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领域。本发明的生产菌株由生产菌株的分离、纯化、经薄层层析初筛、高效液相复筛工序后得到。生产菌株为产洛伐他汀紫色红曲霉(Monascus purpurevs)MPT13，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010123，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。本发明将产洛伐他汀的真菌应用于普洱茶的生产中。本发明的优点在于将紫色红曲霉(Monascus purpurevs)按一定的比例接种应用到普洱茶发酵过程中，得到了含洛伐他汀的普洱茶且在保持传统普洱茶风味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点，并且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶的开发发挥重要作用。
文档编号C12N1/14GK102010831SQ20101018296
公开日2011年4月13日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者卓婧, 周红杰, 李亚莉, 李家华, 秘鸣, 袁文侠, 赵明, 魏珍珍 申请人:云南农业大学