专利名称：一种近平滑假丝酵母真菌及其在普洱茶生产中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种近平滑假丝酵母真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领 域。
背景技术：
酵母菌用于发酵果汁、发酵面包和制造美味、营养的食物而服务于人类已经很多 世纪了。随着现代生物技术的发展，人们在广泛多样化的发酵过程中利用它们，酵母菌就显 得更重要，用途更广。由于酵母蛋白质含量高可以用来制造食用酵母或饲料酵母，其资源开 发潜力很大。同时，酵母菌体含有大量的蛋白质和丰富的维生素，可供食用、药用及加工饲 料，有机物经酵母菌发酵后蛋白质、维生素、氨基酸等物质的生物活性大幅度提高。酵母菌 在发酵食品中已经获得了广泛使用，具有很高的安全性，也存在较高的GAD活性，能够提高 发酵液中Y-氨基丁酸含量，Takahashi等人筛选到了 Saccharomycescerevisiae UT-1的 GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中GABA浓度 分别达到了 0. 4mM和0. 42mM，较野生株分别提高了 2. 0和2. 1倍。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，是一种非蛋白质组成的新资源食 品，具极强的生理活性，广泛存在于自然界的动植物体内。植物如参属、豆科属、中草药、 茶树等的根茎叶、种子和组织液中都含有GABA ；在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织 中(脑组织中的含量大约为0. 1 0. 6mg/g)，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神 经递质，参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，如降压、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑、 治疗癫痫、控制哮喘、调节激素分泌、防止肥胖、促进生殖、活化肝肾、改善神经细胞性老年 呆痴、缓解脑血栓、脑动脉硬化造成的头疼、耳鸣等生理功能。2009年9月27日，卫生部 批准Y-氨基丁酸、初乳碱性蛋白、共轭亚油酸、共轭亚油酸甘油酯、植物乳杆菌(菌株号 ST- III)、杜仲籽油为新资源食品，标志着GABA在国内进入崭新纪元，将引导中国进入新食 品消费时代。普洱茶是云南的特色茶，在其加工过程中，渥堆发酵是关键工序之一，微生物又是 渥堆发酵工序的重要影响因子，所以微生物与普洱茶加工和普洱茶品质的形成有密切关 系。国外研究表明，在普洱茶渥堆过程中，酵母菌是优势菌种之一，能抑制一些产毒霉菌的 生长，而且酵母菌不分泌有毒的抗生物，同时酵母菌还有丰富的营养物如维生素、蛋白质 等，对普洱茶品质的形成有重要意义。如果在普洱茶渥堆过程中数量控制得当，能够增加普洱茶中的有效营养物质及对 人体有保健作用的物质，有利于形成普洱茶甜、醇、香等品质风格。为此，我们可利用从自然 界中分离纯化得到的产GABA的酵母真菌作用于普洱茶生产过程中，提高普洱茶中GABA含 量，研发新的风味普洱茶。
发明内容
本发明的目的是从微生物的角度对普洱茶进行研究，为生产企业提供GABA普洱茶有益菌株来源。本发明的另一目的是通过控制有益菌种在普洱茶生产中的比例，为促进 云南普洱茶健康发展发挥作用。本发明的近平滑假丝酵母真菌，从天然物质中经酵母合成培养基、PDA培养基分 离纯化得到，经薄层层析定性，高效液相和氨基酸分析仪定量该菌株产GABA含量达2. 42g/ L，为生产GABA功能性食品提供菌株来源。GPT-5-11菌株保藏在中国典型培养物保藏中 心，地址为武汉大学生命科学院保藏中心，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010122。本发明的近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)GPT-5-ll的形态学特征 为在YM培养基培养72小时，显微形态为细胞椭圆形、长椭圆形，多极芽殖，有假菌 丝；菌落形态为奶油色，光滑湿润，有光泽，边缘整齐。近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)GPT-5_ll的Meg 4. 0建树结果为对所测菌株的26S rDNA D1/D2序列图谱校正，提交GenBank ‘并在GenBank， EMBL，DDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch)，以比较测试菌株 与酵母菌种模式菌株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴 定。菌株间的序列比较用Clustal. χ软件完成。用Neighbor-Joining方法进行分子系统 学分析，并进行1000次bootstrap统计学检验，用TreeView软件显示系统树。本发明经酵母合成培养基、PDA培养基分离纯化等传统工序后得到。本发明应用于普洱茶加工有提高普洱茶中GABA含量的作用。本发明的优点在于将酵母菌按重量比为5%的比例用于普洱茶的生产过程中， 普洱茶中的GABA含量显著提高，GABA含量达到153. 32mg/100g，在保持传统普洱茶风味的 基础上，香气和汤色方面也具有新的特点，且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱 茶的开发发挥重要作用。
具体实施例方式本发明经传统的酵母合成培养基及PDA培养基分离纯化工序后得到。实施例1 :GPT-5_11菌种的纯化从天然牛奶、泡菜等中分离纯化，将样品稀释涂布于酵母合成培养基上，28°C培养 48h，挑取单菌落划线纯化得到酵母菌纯菌株，共获23株。酵母合成培养基为葡萄糖20g， 酵母提取物5g，蛋白胨10g，琼脂粉20g，水IOOOmL, pH 6. 0 ； 121 °C灭菌20min。纯化方法如下(1)将固体培养基(酵母合成培养基)熔化，冷却至45°C，注入无菌培养皿中，每 皿约15 20毫升，稍微摇转，静置，使成平板备用。(2)稀释按十倍稀释法把菌悬液稀释至10-8，十倍法是指下一管的菌悬液要比 上一管的稀十倍。(4)接种事先准备好的平板9套，分别标号为10-6、10-7、10-8，每个稀释度写三 套平皿，以便比较。在每个已标号的平皿中注入Iml相应的菌悬液，用涂布棒涂均勻，放入 25 28°C培养24小时观察。(5)培养2 5天后，挑取单个菌落，用PDA斜面培养基进行菌株活化传代，菌株每4周接转1次。菌株转接到新的PDA固体平板上26°C活化培养48h，再转接到种子培养 基24h用作发酵种子。(6)最后把选出的菌种接种到液态培养基，即250ml三角瓶中装入50mlCza培养 基(葡萄糖 30g, NaNO 33g，酵母提取物 lg, K2HP0 lg, MgS04 · 7H20 0. 5g, KC10. 5g, FeS04 7H20 O.Olg，，水1000mL，pH 6. 0 ；含0. 5%谷氨酸)，按2%的接种量接入菌株，28°C摇床培 养48h，取发酵液通过薄层层析定性，高效液相、氨基酸分析仪定量分析发酵液中GABA含 量，进行产GABA菌株的筛选。实施例2 酵母菌的生产应用将毛茶按传统的方法进行湿热，环境湿度70 % ；潮水量30 %，随后在毛茶中接种重 量比为5%的GPT-5-11让其发酵，当堆温升高到26士3°C时，GPT-5-11开始进行代谢，并且 随着堆温进一步的升高，分泌出大量的酶，尤其是谷氨酸脱羧酶(GAD)，谷氨酸在该酶的作 用下可转化为GABA，提高发酵茶样中GABA含量。经接种近平滑假丝酵母菌后生产的普洱茶，其GABA含量有明显的提高，普洱茶中 的GABA含量达到153. 32mg/100g,形成的GABA普洱茶，其汤色红浓明亮，滋味醇滑回甘，独 特香气。
权利要求
一种近平滑假丝酵母真菌，由生产菌株经酵母合成培养基、PDA培养基分离纯化工序得到；其特征在于生产菌株为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)GPT 5 11，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010122，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。
2.权利1要求近平滑假丝酵母真菌，其特征在于该近平滑假丝酵母真菌应用于普洱茶 的生产中。
全文摘要
本发明涉及一种近平滑假丝酵母真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领域。本发明的近平滑假丝酵母真菌，由生产菌株经酵母合成培养基、PDA培养基分离纯化工序得到；生产菌株为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)GPT-5-11，保藏日期2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010122，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉武汉大学。该近平滑假丝酵母真菌应用于普洱茶的生产中。本发明的优点在于将酵母菌按重量比为5％的比例用于普洱茶的生产过程中，普洱茶中的GABA含量显著提高，GABA含量达到153.32mg/100g，在保持传统普洱茶风味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点，且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶的开发发挥重要作用。
文档编号A23F3/10GK101974440SQ201010182948
公开日2011年2月16日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者卓婧, 周红杰, 李亚莉, 李家华, 秘鸣, 袁文侠, 赵明, 魏珍珍 申请人:云南农业大学