专利名称：一种变性梯度凝胶电泳技术的使用方法
技术领域：
本发明涉及变性梯度凝胶电泳技术在海洋浮游植物种类和/或数量检测中的应 用的技术领域，特别涉及一种变性梯度凝胶电泳技术的使用方法。
背景技术：
浮游生物是一个在水体中营随波逐流生活方式的独特类群，易于在风和水流的作 用下做被动运动，没有或仅有微弱的游动能力；浮游生物包括浮游植物和浮游动物两大类。 浮游生物个体小，生活周期短，繁殖速度快，对环境的变化十分敏感，对水体的营养状态的 变化能够迅速地做出反应。在水质好的水域，浮游生物的多样性指数及均度指数均较大；反 之，浮游生物的种类多样性下降，分布呈现不均勻的情况。因此浮游生物群落结构特征的变 化可作为指示生态环境变化的重要生物学参数。赤潮浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生动物或细菌在一定的环境条件 下爆发性增殖或聚集在一起而引起水体变色的一种生态异常现象。在我国海域中，赤潮发 生的区域分布很不均勻，浙江沿海及长江口临近海域的赤潮灾害最为严重，此外发生赤潮 比较集中的海区还有渤海、福建沿海、珠江口海域等地。1998年春季，珠江口海域发生一次 特大面积米氏凯伦藻赤潮，所影响到的海区养殖鱼类几乎全部死亡，造成了珠江口海域三 地(深圳、珠海和香港)水产养殖业损失逾4亿元之多；2000年长江口海域发生大面积具 齿原甲藻赤潮，危害面积达7000平方千米，2004年5月东海长江口海域发生大规模东海原 甲藻赤潮，面积达10000平方千米，世界罕见。近年来，近海海域赤潮更加肆虐，赤潮的爆发 越来越频繁，且涉及的范围也越发广泛。赤潮严重破坏了海洋生态平衡，给渔业及旅游业等 造成了巨大的损失。除此之外，有些赤潮生物体内或代谢产物中含有生物毒素，通过食物链 富集，会严重危害人类的健康。在众多的分子多态性技术中，变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)以其显著的优点得 到了广泛的应用。DGGE技术不仅结果可靠、重现性好、操作简便快速，而且可以同时对大量 的样品进行分析，并能对微生物的时空变化进行检测，已经成为研究微生物生态的一种重 要技术。此外，充分了解该技术的局限性并综合使用PCR-DGGE技术与其它生物学技术，可 以更加详尽地了解微生物群落的结构及动态变化，获得全面可靠的生物学信息。近年来DGGE之所以得到了如此广泛的应用，是由于它具有其它分子多态性技术 不能比拟的优点第一，操作简便、快速，加样量小，重复性好；第二，可以对大量的样品同 时进行分析，通过对回收的DNA条带进行测序确定群落的组成；第三，可以用于研究微生物 群落的时空分布；第四，可以确定复杂的样品中的特定的DNA序列。但是，同时该技术也存 在缺陷(1)仅能检测到环境中的主要微生物，占总量以上的微生物才可以被检测到；
(2)DGGE可分离的片段大小位于200-700bp之间，大于700bp的片段不能进行很好的分离；
(3)不同序列的DNA有可能迁移到胶的同一位置，有时即使对条带进行回收，重新扩增，重 新电泳也不能得到很好的分离；(4)有些物种基因的不同拷贝之间存在异质性问题，即使 它们仅有微小的差异，DGGE也能将其分开，因此一个种在DGGE图谱上不仅显示一条带，这
5样就过高地估计了环境中的微生物多样性；(5)此外整个分析过程的各个步骤本身都存在 一定的局限性样品的收集及保存过程中，可能会损失部分微生物种类；由于不同物种的 细胞壁组成不同，相同的提取方法对不同物种的提取效率不同；PCR本身存在扩增的偏好 性问题，并且扩增过程中可能产生嵌合体及异源双链，这些对实验结果均有一定影响。鉴于上述所述，研究浮游植物赤潮的爆发机制，探索预警、预报乃至防治赤潮的方 法已成为一个极具挑战性的课题，其中在检测浮游植物群落结构的过程中，如何改进并使 用变性梯度凝胶(DGGE)技术，具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术运用到微藻 的鉴定中，并运用该技术对浮游植物多样性进行研究，分析多样性组成与环境因子的关系。为了实现上述目的，本发明提供了一种变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特 征在于，包括以下步骤(1)藻细胞搜集(2)总DNA的提取(3)PCR引物设计及优化(4)琼脂糖电泳检测(5)变性梯度凝胶的制备(6)电泳条件的优化(7)运用变性梯度凝胶电泳技术对微藻进行分析。所述步骤(1)为当目标藻培养至对数生长期时，进行目标藻的收集，采用离心收 集的方法(4000rmp，lOmin)，弃上清夜，将藻细胞移至2ml离心管中并置于_80°C保存待用。所述步骤⑵为a、收集和洗涤藻细胞在收集的藻细胞中中加入750 yl TE缓冲液洗涤藻细胞， lOOOOrpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；加入250 u 1 TE缓冲液悬浮藻细胞；b、裂解藻细胞加入500 ill预热55°C的抽提缓冲液，混和均勻，放入55°C水浴中 一小时，直到藻液呈透明状；放进4°C冰箱冷却3分钟；c、抽提加入lml氯仿异戊醇(24 1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；14000rpm 4°C离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600 ill)至印pendorf管中，重复抽提一 次；d沉淀加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱 30分钟；14000rpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；e洗涤DNA沉淀用预冷的70%酒精洗两次；f溶解自然风干，溶于20-40 ill TE缓冲液中，置于_20°C待用。所述步骤(3)为从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS区序 列；运用DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用 Primer premier 5. 0进行引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评 估，选出最优引物进行合成。PCR反应体系(50ul)包括约50ng模板DNA，
200 uM dNTP,
1.5mM MgC12,
0. 3iiM 引物，
2.5U Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa),
IXEx Taq Buffer。
引物EuklA Euk516的PCR反应程序为
94°C，变性 130s ；
94°C,变性 30 s, XX°C,退火45 s, L 35个循环； 72°C,延伸 130 s，^72°C，延伸 lOmin。退火温度分别取54°C，56°C，58°C，60°C四个温度进行优化。引物Eukl209 1649R的PCR反应采用降落PCR 94°C，变性 4min;
94°C,变性 lmin，
XX。C ,退火1 min, L 10个循环(每个循环降低1°C )； 72 °C,延伸 3min，^
94°C,变性 lmin，)
XX°C ,退火1 min, I 20个循环；
72°C,延伸 3 min,
__^72°C，延伸 lOmin。退火温度分别取65 55°C，67 57°C，69 59°C三个温度梯度进行优化。引物28SD1F 28SD1R的PCR反应采用降落PCR 94°C，变性 4min;
94°C,变性 lmin,、
XX°C ,退火1 min, l 10个循环(每个循环降低1 °C )； 72°C,延伸 lmin, ^
94°C,变性 lmin, i
XX°C，退火1 min, L 20个循环；
72°C，延伸 lmin。72°C，延伸 lOmin
退火温度分别取60 55°C，55 50°C，48 43°C三个温度梯度进行优化。引物18SF 5. 8SR的PCR反应采用降落PCR PCR反应程序同引物28SD1F 28SD1R，退火温度分别取60 55°C，55 50°C， 50 45°C三个温度梯度进行优化。所述步骤(4)为将5ul PCR扩增的产物与lul Loading buffer混合后上样，1 % 琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0. 5iig/ml EB的1XTAE缓冲液中染色10 30min，用凝胶成像系统进行拍照。所述步骤(5)进一步包括垂直胶的制备和平行胶的制备，所述垂直胶的凝胶尺 寸7. 5cmX lOcmX 1mm,其制备方法为用洗涤剂彻底擦洗玻璃板，先用自来水冲洗干净，后用双蒸水冲洗三遍，晾干；取相同厚度的隔板，带槽的一侧面向大玻璃板，两个隔板的凹面相对应；插入梳 子，两侧及中间的隔板与玻璃板底部平齐；垂直放置制胶板系统，松梳子衬垫系统的螺丝，将两系统放置至两者刚好完全匹 配，拧衬垫系统的螺丝直到碰到玻璃板，再拧1/4圈；平放压力夹，松螺丝；带螺丝的一面朝下，出气口一面朝上；将压力夹放置于制胶板系统中间位置，拧压力夹的螺丝直到碰到梳子衬垫系统， 再拧两圈；再拧梳子衬垫系统的螺丝一圈，移走压力夹；按上旋塞，将海绵垫放在制胶架上，把制胶板系统(一定要用校正板进行校正，以 免漏胶)垂直放在海绵上方并固定好，将短玻璃的一面对着自己；一边拧开旋塞，打开出气口，另一侧关上；将倾斜杆调到最高的刻度线处；用梯度 传送系统将凝胶注入到两玻璃板之间，保证整个过程要恒定勻速且缓慢；灌胶完毕后，关上旋塞和出气口，将倾斜杆放平；聚合60min后，取下梳子衬垫系统，在另一侧添加含有催化剂的丙烯酰胺溶液，聚 合60min，此时打开循环泵及加热器，预热电泳缓冲液到60°C，迅速清洗用完的设备。聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，用双蒸水清洗点样孔三次，随后加 样；用20V预电泳lOmin，随后按照优化的电泳参数进行电泳。电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻 璃板脱离；倒掉去离子水，将胶放入0. 5 u g/ml的EB溶液中，摇床上摇荡染色15min ；凝胶成像系统拍照。所述水平胶的凝胶尺寸为16cmX 16cmX 1mm，其制备步骤如下用洗涤剂彻底擦洗玻璃板，先用自来水冲洗干净，后用双蒸水冲洗三遍，晾干；将海绵垫放在制胶架上，把制胶板系统(一定要用校正板进行校正，以免漏胶)垂 直放在海绵上方并固定好，将短玻璃的一面对着自己；将两根长的聚乙烯细管(15. 5cm)分别连上30ml注射器，短的(9cm)聚乙烯细管 连于Y形三通的一端；在两个注射器上分别标记“高浓度”与“低浓度”，并安装上相关的配件，调整梯度
8传送系统的刻度到适当的位置本试验中使用的为16CmX16CmXlmm的胶板，调整装置到 体积刻度为14. 5处；分别将15ml两种变性浓度的丙烯酰胺溶液倒入两个塑胶管中，每管加入15 yl TEMED (1/1000)，150 ill 10% APS (1/100)，颠倒数次混勻，吸入到标有浓度的注射器中；分别将标有高浓度和低浓度的注射器正确安装在梯度传送系统上，再将注射器的 聚丙烯管连于Y形三通；用梯度传送系统将凝胶注入到两玻璃板之间，保证整个过程要恒定勻速且缓慢；小心斜插入梳子，凝胶聚合大约两小时；待胶凝固一小时后，打开循环泵及加热 器，预热电泳缓冲液到60°C，迅速清洗用完的设备。步骤(6)为对DGGE的变性梯度和电泳时间进行优化，电泳温度均为60°C。所述步骤(7)进一步包括⑶DE鉴定分析的步骤，DGGE特征性图谱构建的步骤和 条带稳定性分析的步骤。使用Quantity One软件对图像进行处理，基于DGGE图谱，采用非加权配对算数平 均法聚类分析对相似性进行分析，根据各条带的亮度，计算多样性指数(H)，进而对物种结 构多样性进行分析；所述多样性指数的计算公式为H = E (ni/N) ln(ni/N)，其中ni为每条 带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和本发明的优点如下本发明将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术运用到微藻的鉴定中，并运用该技术对 浮游植物多样性进行了研究，分析了多样性组成与环境因子的关系。主要如下(1)本发明分别针对核糖体基因的18S rDNA、28S rDNA及ITS区序列设计引物，经 过PCR退火温度的优化，选择了特异性较好的三对引物(分别针对18S rDNA和28S rDNA 序列)，对微藻进行了 DGGE分析，获得了每种藻每对引物的扩增片段在变性梯度凝胶上的 迁移率。(2)本发明在变性梯度凝胶上的迁移率，可以较好地将其区分鉴定；而将其中的 两对或三对引物相结合，可以得到更为满意的区分效果。(3)基于DGGE图谱的聚类分析结果与环境特征较为一致；证明温度是影响研究海 域浮游植物分布的主要因子，其次是溶解无机氮和硅酸盐。(4)运用DGGE技术浮游植物多样性研究，了解营养盐、温度等环境因子对浮游植 物群落组成的影响。基于DGGE图谱的相似性进行聚类分析。
具体实施例方式本发明提供了一种变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，包括以下步 骤(1)藻细胞搜集(2)总DNA的提取(3) PCR引物设计及优化(4)琼脂糖电泳检测(5)变性梯度凝胶的制备(6)电泳条件的优化
(7)运用变性梯度凝胶电泳技术对微藻进行分析。步骤(1)为当目标藻培养至对数生长期时，进行目标藻的收集，采用离心收集的 方法(4000rmp，lOmin)，弃上清夜，将藻细胞移至2ml离心管中并置于_80°C保存待用。步骤(2)为a、收集和洗涤藻细胞在收集的藻细胞中中加入750 yl TE缓冲液洗涤藻细胞， lOOOOrpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；加入250 u 1 TE缓冲液悬浮藻细胞；b、裂解藻细胞加入500 u 1预热55°C的抽提缓冲液，混和均勻，放入55°C水浴中 一小时，直到藻液呈透明状；放进4°C冰箱冷却3分钟；c、抽提加入1ml氯仿异戊醇(24 1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；14000rpm 4°C离心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600 ill)至印pendorf管中，重复抽提一 次；d沉淀加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱 30分钟；14000rpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；e洗涤DNA沉淀用预冷的70%酒精洗两次；f溶解自然风干，溶于20-40 ill TE缓冲液中，置于_20°C待用。步骤(3)为从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS区序列；运 用DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primer premier 5.0进行引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最 优引物进行合成。PCR反应体系(50ul)包括约50ng模板DNA，200 uM dNTP,1. 5mM MgC12,0. 3iiM 引物，2. 5U Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa),IXEx Taq Buffer。引物EuklA Euk516的PCR反应程序为94 °C，变性 130s;
94°C,变性 30 s，1
XX°C,退火45 s, ^35个循环；
72°C,延伸 130 s,)72°C，延伸 lOmin。退火温度分别取54°C，56°C，58°C，60°C四个温度进行优化。引物Eukl209 1649R的PCR反应采用降落PCR 94°C，变性 4min;
1094°C,变性 lmin,
XX°C ,退火1 min, I 10个循环(每个循环降低1°C )； 72°C,延伸 3 min,)
94°C,变性 lmin,
XX°C ,退火1 min, 1 20个循环；
72°C,延伸 3 min,
__‘72°C，延伸 lOmin。退火温度分别取65 55°C，67 57°C，69 59°C三个温度梯度进行优化。引物28SD1F 28SD1R的PCR反应采用降落PCR <formula>formula see original document page 11</formula>72°C，延伸 lOmin退火温度分别取60 55°C，55 50°C，48 43°C三个温度梯度进行优化。引物18SF 5. 8SR的PCR反应采用降落PCR PCR反应程序同引物28SD1F 28SD1R，退火温度分别取60 55°C，55 50°C， 50 45°C三个温度梯度进行优化。步骤(4)为将5ul PCR扩增的产物与lul Loading buffer混合后上样，1 %琼脂 糖凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0. 5i! g/ml EB的1 XTAE缓冲液中染色10 30min， 用凝胶成像系统进行拍照。所述步骤(5)进一步包括垂直胶的制备和平行胶的制备，所述垂直胶的凝胶尺 寸7. 5cmX lOcmX 1mm,其制备方法为用洗涤剂彻底擦洗玻璃板，先用自来水冲洗干净，后用双蒸水冲洗三遍，晾干；取相同厚度的隔板，带槽的一侧面向大玻璃板，两个隔板的凹面相对应；插入梳 子，两侧及中间的隔板与玻璃板底部平齐；垂直放置制胶板系统，松梳子衬垫系统的螺丝，将两系统放置至两者刚好完全匹 配，拧衬垫系统的螺丝直到碰到玻璃板，再拧1/4圈；平放压力夹，松螺丝；带螺丝的一面朝下，出气口一面朝上；将压力夹放置于制胶板系统中间位置，拧压力夹的螺丝直到碰到梳子衬垫系统，
11再拧两圈；再拧梳子衬垫系统的螺丝一圈，移走压力夹；按上旋塞，将海绵垫放在制胶架上，把制胶板系统(一定要用校正板进行校正，以 免漏胶)垂直放在海绵上方并固定好，将短玻璃的一面对着自己；一边拧开旋塞，打开出气口，另一侧关上；将倾斜杆调到最高的刻度线处；用梯度 传送系统将凝胶注入到两玻璃板之间，保证整个过程要恒定勻速且缓慢；灌胶完毕后，关上旋塞和出气口，将倾斜杆放平；聚合60min后，取下梳子衬垫系统，在另一侧添加含有催化剂的丙烯酰胺溶液，聚 合60min，此时打开循环泵及加热器，预热电泳缓冲液到60°C，迅速清洗用完的设备。聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，用双蒸水清洗点样孔三次，随后加 样；用20V预电泳lOmin，随后按照优化的电泳参数进行电泳。电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻 璃板脱离；倒掉去离子水，将胶放入0. 5 u g/ml的EB溶液中，摇床上摇荡染色15min ；凝胶成像系统拍照。所述水平胶的凝胶尺寸为16cmX 16cmX 1mm，其制备步骤如下用洗涤剂彻底擦洗玻璃板，先用自来水冲洗干净，后用双蒸水冲洗三遍，晾干；将海绵垫放在制胶架上，把制胶板系统(一定要用校正板进行校正，以免漏胶)垂 直放在海绵上方并固定好，将短玻璃的一面对着自己；将两根长的聚乙烯细管(15. 5cm)分别连上30ml注射器，短的(9cm)聚乙烯细管 连于Y形三通的一端；在两个注射器上分别标记“高浓度”与“低浓度”，并安装上相关的配件，调整梯度 传送系统的刻度到适当的位置本试验中使用的为16CmX16CmXlmm的胶板，调整装置到 体积刻度为14. 5处；分别将15ml两种变性浓度的丙烯酰胺溶液倒入两个塑胶管中，每管加入15 yl TEMED (1/1000)，150 ill 10% APS (1/100)，颠倒数次混勻，吸入到标有浓度的注射器中；分别将标有高浓度和低浓度的注射器正确安装在梯度传送系统上，再将注射器的 聚丙烯管连于Y形三通；用梯度传送系统将凝胶注入到两玻璃板之间，保证整个过程要恒定勻速且缓慢；小心斜插入梳子，凝胶聚合大约两小时；待胶凝固一小时后，打开循环泵及加热 器，预热电泳缓冲液到60°C，迅速清洗用完的设备。步骤(6)为对DGGE的变性梯度和电泳时间进行优化，电泳温度均为60°C。步骤(7)进一步包括⑶DE鉴定分析的步骤，DGGE特征性图谱构建的步骤和条带 稳定性分析的步骤。使用Quantity One软件对图像进行处理，基于DGGE图谱，采用非加权配对算数平 均法聚类分析对相似性进行分析，根据各条带的亮度，计算多样性指数(H)，进而对物种结 构多样性进行分析；所述多样性指数的计算公式为H = E (ni/N) ln(ni/N)，其中ni为每条 带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。
本发明中PCR进行扩增所使用的引物为FP-5’ CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’， RP-5’ ACGGGCGGTGTGTRC3’，PCR扩增所用引物或者为F1427-5 ’ CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTT CTGGG3，，R1616-5，GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3，，引物EuklA Euk516, Eukl209 Unil392均针对18S rDNA，该两对引物为真核 生物核糖体小亚基的通用引物，通过与序列库中已有藻的ISSrDNA序列比对发现，将反向 引物Unil392的简并碱基R改为A后可以得到更好的匹配结果，因此为了避免扩增过程中 错配碱基的出现，减少错配的几率，反向引物改为5’ -ACGGGCGGTGTGTAC-3’，命名为1649R。 引物28SD1F 28SD1R，18SF 5. 8SR为发明中设计，分别针对核糖体28S rDNA的D1区和 ITS1区。如下表
引物正向(F)/反向(R)序列(5，-3’)来源EuklAFCTGGTTGATCCTGCCAGDiez etEuk516aRACCAGACTTGCCCTCCal.,2001Eukl209bFCAGGTCTGTGATGCCCDiez etUnil392RACGGGCGGTGTGTRCal.,200128SDlFbFCGGAGGAAAAGAAACTAAC28SD1RRACTCTCTTTTCAAAGTCCTT本发明设计18SFaFACAAGGTTTCCGTAGGTG5.8SRRCGCTGCGTCCTTCATCG本发明设计a 在引物的 5，端加一个 40bp 的 GC 夹，序列为 CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGb 在引物的 5，端加一个 40bp 的 GC 夹，序列为 CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCG CCCCCGCCCG综上所述，本发明将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术运用到微藻的鉴定中，并运用 该技术对浮游植物多样性进行了研究，分析了多样性组成与环境因子的关系。本发明分别 针对核糖体基因的18S rDNA、28S rDNA及ITS区序列设计引物，经过PCR退火温度的优化， 选择了特异性较好的三对引物(分别针对18S rDNA和28S rDNA序列)，对微藻进行了 DGGE 分析，获得了每种藻每对引物的扩增片段在变性梯度凝胶上的迁移率。本发明在变性梯度 凝胶上的迁移率，可以较好地将其区分鉴定；而将其中的两对或三对引物相结合，可以得到 更为满意的区分效果。基于DGGE图谱的聚类分析结果与环境特征较为一致；证明温度是影 响研究海域浮游植物分布的主要因子，其次是溶解无机氮和硅酸盐。运用DGGE技术浮游植
13物多样性研究，了解营养盐、温度等环境因子对浮游植物群落组成的影响。基于DGGE图谱 的相似性进行聚类分析。
权利要求
一种变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，包括以下步骤(1)藻细胞搜集(2)总DNA的提取(3)PCR引物设计及优化(4)琼脂糖电泳检测(5)变性梯度凝胶的制备(6)电泳条件的优化(7)运用变性梯度凝胶电泳技术对微藻进行分析。
2.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(1) 为当目标藻培养至对数生长期时，进行目标藻的收集，采用离心收集的方法(4000rmp， lOmin)，弃上清夜，将藻细胞移至2ml离心管中并置于_80°C保存待用。
3.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)为a、收集和洗涤藻细胞在收集的藻细胞中中加入750yl TE缓冲液洗涤藻细胞， lOOOOrpm 4°C离心10分钟，小心弃上清；加入250 u 1 TE缓冲液悬浮藻细胞；b、裂解藻细胞加入500yl预热55°C的抽提缓冲液，混和均勻，放入55°C水浴中一小 时，直到藻液呈透明状；放进4°C冰箱冷却3分钟；c、抽提加入lml氯仿异戊醇(24 1)，轻柔颠倒，使之呈乳浊液；14000rpm 4°C离 心10分钟，小心用微量吸头取出上清液(约600 ill)至印pendorf管中，重复抽提一次；d沉淀加二倍体积的冰冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc，混勻，放入_80°C冰箱30分 钟；14000rpm 4°C离心10分钟，小心弃上清； e洗涤DNA沉淀用预冷的70%酒精洗两次； f溶解自然风干，溶于20-40 yl TE缓冲液中，置于-20°C待用。
4.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(3) 为从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA, 28S rDNA及ITS区序列；运用DNAStar软件进 行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primer premier 5.0进行 引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最优引物进行合成。PCR反应体系(50ul)包括约50ng模板DNA， 200 uM dNTP, 1.5mM MgC12, 0. 3iiM 引物，2. 5U Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa), IXEx Taq Buffer。引物EuklA Euk516的PCR反应程序为 94°C，变性 130s ；94°C,变性 30 s， XX°C,退火45 s, L 35个循环； 72°C,延伸 130 s, ^72°C，延伸 lOmin。退火温度分别取54°C，56°C，58°C，60°C四个温度进行优化。 引物Eukl209 1649R的PCR反应采用降落PCR 94°C，变性 4min ；94°C,变性 lmin,XX。C ,退火1 min, L 10个循环(每个循环降低1°C )；72°C,延伸 3 min,)94°C,变性 lmin,XX°C，退火1 min, I 20个循环；72°C,延伸 3 min,」72°C，延伸 lOmin。退火温度分别取65 55°C，67 57°C，69 59°C三个温度梯度进行优化。 引物28SD1F 28SD1R的PCR反应采用降落PCR 94°C，变性 4min ；94°C,变性 lmin,XX°C,退火1 min, y 10个循环(每个循环降低1°C )； 72延伸 lmin, 一94°C,变性 lmin,，XXV ,退火1 min, L 20个循环； 72V,延伸 lmin，〉72°C，延伸 lOmin退火温度分别取60 55°C，55 50°C，48 43°C三个温度梯度进行优化。 引物18SF 5. 8SR的PCR反应采用降落PCR PCR反应程序同引物28SD1F 28SD1R，退火温度分别取60 55°C，55 50°C，50 45 °C三个温度梯度进行优化。
5.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(4) 为将5ul PCR扩增的产物与lul Loading buffer混合后上样，1 %琼脂糖凝胶电泳，100V 恒压电泳30min，在含0. 5 ii g/ml EB的1XTAE缓冲液中染色10 30min，用凝胶成像系统 进行拍照。
6.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(5) 进一步包括垂直胶的制备和平行胶的制备，所述垂直胶的凝胶尺寸7. 5cmX 10cmX 1mm。
7.根据权利要求6所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述水平胶 的凝胶尺寸为16cmX16cmXl匪。
8.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(6) 为对DGGE的变性梯度和电泳时间进行优化，电泳温度均为60°C。
9.根据权利要求1所述变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，所述步骤(7)进一步包括GDDE鉴定分析的步骤，DGGE特征性图谱构建的步骤和条带稳定性分析的步骤。
10.根据权利要求9所述变性梯度凝胶电影技术的使用方法，其特征在于，使用 Quantity One软件对图像进行处理，基于DGGE图谱，采用非加权配对算数平均法聚类分析 对相似性进行分析，根据各条带的亮度，计算多样性指数(H)，进而对物种结构多样性进行 分析；所述多样性指数的计算公式为H = E (ni/N)ln(ni/N)，其中ni为每条带的亮度峰 值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。
全文摘要
本发明公开了一种变性梯度凝胶电泳技术的使用方法，其特征在于，包括以下步骤(1)藻细胞搜集，(2)总DNA的提取，(3)PCR引物设计及优化，(4)琼脂糖电泳检测，(5)变性梯度凝胶的制备，(6)电泳条件的优化，(7)运用变性梯度凝胶电泳技术对微藻进行分析。从GenBank中下载常见微藻的18S rDNA，28S rDNA及ITS区序列；运用DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primerpremier 5.0进行引物设计；然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最优引物进行合成。本发明可精确检测浮游植物群落的结构组成，有利于浮游植物赤潮的爆发预警。
文档编号C12Q1/04GK101831502SQ20101018481
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者于志刚, 孙静, 甄毓, 米铁柱 申请人:中国海洋大学