专利名称：用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的pGAP启动子调控生产生物 蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的PGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法。
背景技术：
L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase EC 5. 3. 1.4)是由一系列微生物产 生的、具有变构作用的酶。L-阿拉伯糖异构酶能催化L-阿拉伯糖为L-核酮糖；由于L-阿 拉伯糖和D-半乳糖结构的相似性，故L-阿拉伯糖异构酶也能催化D-半乳糖异构为D-塔 格糖。D-塔格糖是甜味剂，具有低能量，降低血糖和抗龋齿等功能。虽然多种微生物具有 产生L-阿拉伯糖异构酶的功能，但是，由于或是天然的产L-阿拉伯糖异构酶菌株的生长缓 慢，营养要求较高，或是产物在胞内形成包涵体(细菌菌株)不利于目标蛋白的纯化，导致 生产成本较高。毕赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不 高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Pichiapastoris分泌自身的蛋白很少，有 利于表达产物的纯化。PGAP (三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是Pichia pastoris的组成型 强启动子，与Pichia pastoris的pAOXl (醇氧化酶1启动子)相比其优越性主要是不需要 有毒性的甲醇作为碳源。
发明内容
本发明的目的是为解决应用天然产L-阿拉伯糖异构酶的菌株生产木糖异构酶的 成本较高、产物难于纯化的问题，而提供一种用毕赤酵母PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子)调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法。本发明所采用的技术方案是一种用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，其步骤是1、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2、在L-阿拉伯糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控L-阿拉 伯糖异构酶基因的由G418抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化 毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；即涂布于含 G418 为彡 300 μ g/mL 的 YPD (2%蛋白胨，yeast extract，2%葡萄糖)平板上；3、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株(毕赤酵母 的基因组中没有G418抗性基因，在含G418抗性的平板上不能生长；由于重组子含有G418 抗性基因，所以在含G418抗性的平板上能生长。也就是说在G418抗性平板上能生长的就 是重组子)；4、将步骤3获得的工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28 30°C在生物 反应器中发酵1 2d分泌表达L-阿拉伯糖异构酶。所述液体培养基是由以下组分组成 85%磷酸 25 28ml/L、CaSO4 · 2Η20 0· 8 1. 2 g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/L、K0H 3· 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeastextract 8 12g/ L、PTM43 5ml/L。所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或 甘露醇。所述 PTM4 是由以下组分组成=CuSO4 ‘ 5H20 2. 0g/L、NaI · 2H20 0. lg/L、MnSO4 · H2O 3. Og/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L、H3BO3 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl2 7. Og/L、 Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶，具有下列优点1、生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵培养基。2、可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度达200A以上，能以 足够多的细胞数量表达L-阿拉伯糖异构酶，有利于L-阿拉伯糖异构酶的大规模生产。3、发酵周期短，整个发酵周期只需1 2d。4、使用无毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作为碳源。5、由于pGAP是毕赤酵母的强启动子，由pGAP调控表达的L-阿拉伯糖异构酶约占 总分泌蛋白的比例较高，并且由于在L-阿拉伯糖异构酶的C端融合了 His标签，有利于产 物的纯化。
具体实施例方式下面才用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例一1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；2、在L-阿拉伯糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控L-阿拉 伯糖异构酶基因的Pichia pastoris表达载体，将这一载体转化Pichia pastoris基因组， 并将转化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；3、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株；4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，甘油 40g，蛋白 胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达 L-阿拉伯糖异构酶。其发酵参数为温度28 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发 酵1 2d后离心收获上清。用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化L-阿拉伯糖异构酶，通过蛋白 电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖异构酶的分子量)和 酶活性(纯化的目标蛋白能够转化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能够催化D-半乳糖异构 为D-塔格糖)对产物进行测定。分泌于发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶占Pichia pastoris 总的分泌蛋白的6%以上。实施例二实施步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，油酸 20g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达 L-阿拉伯糖异构酶。其发酵参数为温度28 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发 酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化L-阿拉伯糖 异构酶，通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖异 构酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够转化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能够催 化D-半乳糖异构为D-塔格糖)对产物进行测定。分泌于发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶 占Pichia pastoris总的分泌蛋白的5%以上。实施例三实施步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,山梨醇 35g，蛋白 胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达 L-阿拉伯糖异构酶。其发酵参数为温度28 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发 酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化L-阿拉伯糖 异构酶，通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖异 构酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够转化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能够催 化D-半乳糖异构为D-塔格糖)对产物进行测定。分泌于发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶 占Pichia pastoris总的分泌蛋白的7%以上。实施例四实施步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2504 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白 胨 20g，Yeast extract 10g, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl2 7. Og, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达 L-阿拉伯糖异构酶。其发酵参数为温度28 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发 酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化L-阿拉伯糖 异构酶，通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖异 构酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够转化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能够催 化D-半乳糖异构为D-塔格糖)对产物进行测定。分泌于发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶 占Pichia pastoris总的分泌蛋白的9%以上。实施例五实施步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，乳酸 30g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 ·5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl2 7. Og, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml)，在生物反应器中进行发酵表达 L-阿拉伯糖异构酶。其发酵参数为温度28 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发 酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化L-阿拉伯糖 异构酶，通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖异 构酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够转化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能够催 化D-半乳糖异构为D-塔格糖)对产物进行测定。分泌于发酵液中的L-阿拉伯糖异构酶 占Pichia pastoris总的分泌蛋白的4%以上。
权利要求
一种用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于，其步骤如下1)、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2)、在L-阿拉伯糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控L-阿拉伯糖异构酶基因的由G418抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418≥300μg/mL的G418-YPD平板上；3)、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株；4)、将步骤3获得的工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵1～2d分泌表达L-阿拉伯糖异构酶；所述液体培养基是由以下组分组成85％磷酸25～28ml/L、CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L、K2SO4 17～19g/L、MgSO4·7H2O 13～16g/L、KOH 3.5～4.5g/L、碳源15～45g/L、蛋白胨18～22g/L、Yeastextract 8～12g/L、PTM43～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成CuSO4·5H2O 2.0g/L、NaI·2H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 3.0g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2g/L、H3BO30.02g/L、CoCl2·6H2O 1.05g/L、ZnCl27.0g/L、Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L、生物素0.2g/L、硫酸1ml/L。
2.根据权利要求1所述的用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特 征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本发明公开了一种用毕赤酵母pGAP调控表达L-阿拉伯糖异构酶的方法，属生物技术领域，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达L-阿拉伯糖异构酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的L-阿拉伯糖异构酶有利于产物的纯化，解决应用天然产L-阿拉伯糖异构酶的菌株生产L-阿拉伯糖异构酶的成本较高、产物难于纯化等的问题，有利于L-阿拉伯糖异构酶的大规模生产。
文档编号C12R1/84GK101831418SQ20101018484
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者崔艳艳, 张添元, 张爱联, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所