专利名称：用毕赤酵母pGAP调控表达漆酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的PGAP启动子调控生产生物蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的PGAP调控表达漆酶的方法。
背景技术：
漆酶(laccase，EC 1. 10. 3. 2)广泛地存在于自然界中，因最初发现于漆树的树脂而得名。从植物和一些微生物中能分离到漆酶。漆酶有多种工业用途。漆酶能除去酚类物质而应用于污水处理和作为食品添加剂等；漆酶具有分解木质素的作用而应于纸浆、造纸工业和纤维素乙醇工业。虽然从植物中能分离到漆酶，但是工艺烦琐，成本高；多种微生物具有产生漆酶的功能，但是，由于或是天然的产漆酶菌株的生长缓慢，营养要求较高，或是产物在胞内形成包涵体(细菌菌株)不利于目标蛋白的纯化，生产成本较高。毕赤酵母 (Pichiapastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Pichia pastoris分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。pGAP (三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是Pichia pastoris的组成型强启动子，与Pichia pastoris的pAOXl (醇氧化酶1启动子)相比其优越性主要是不需要有毒性的甲醇作为碳源。
发明内容
本发明的目的是为解决应用天然植物或天然的产漆酶的菌株生产漆酶的成本较高、产物难于纯化的问题，而提供一种应用毕赤酵母的PGAP (三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 调控表漆酶的方法。本发明所采用的技术方案是一种用毕赤酵母pGAP调控表达漆酶的方法，其步骤是1、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2、在漆酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控漆酶基因的由G418 抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；即涂布于含G418为彡300 μ g/mL的 YPD (2%蛋白胨，yeast extract，2%葡萄糖)平板上；3、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株(毕赤酵母的基因组中没有G418抗性基因，在含G418抗性的平板上不能生长；由于重组子含有G418 抗性基因，所以在含G418抗性的平板上能生长。也就是说在G418抗性平板上能生长的就是重组子)；4、将步骤3获得的工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于观 30°C在生物反应器中发酵工程菌1 2d分泌表达漆酶。所述液体培养基是由以下组分组成85%磷酸 25 28ml/L、CaSO4 · 2Η200· 8 1. 2g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/ L、K0H3. 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeast extract 8 12g/L、PTM43 5ml/L ；所述 PTM4 是由以下组分组成CuS04 · 5H20 2. Og/L、NaI · 2H20 0. lg/L、 MnSO4 · H2O 3. Og/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L、H3BO3 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl2 7. Og/L, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达的漆酶，具有下列优点1、生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵培养基。2、可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度达200A以上，能以足够多的细胞数量表达漆酶，有利于漆酶的大规模生产。3、发酵周期短，整个发酵周期只需1 2d。4、使用无毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作为碳源。5、由于pGAP是毕赤酵母的强启动子，由pGAP调控表达的L漆酶约占总分泌蛋白的比例较高，并且由于在漆酶的C端融合了 His6标签，有利于产物的纯化。
具体实施例方式下面才用非限定性实施例对本发明作进一步说明。实施例一1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；2、在漆酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控漆酶基因的由G418 抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上。3、从步骤2的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，甘油 40g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达漆酶。其发酵参数为温度^ 30°C，pH5.0，搅拌转速200-900r/min。发酵1 2d后离心收获上清，用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化漆酶，通过蛋白电泳(在 SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够催化愈创木酚生成醌类物质)对表达的漆酶进行鉴定。分泌于发酵液中的漆酶占 Pichia pastoris总的分泌蛋白的7%以上。实施例二步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，油酸 20g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达漆酶。其发酵参数为温度^ 30°C，pH5.0，搅拌转速200-900r/min。发酵1 2d后
4离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化漆酶，通过蛋白电泳(在 SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够催化愈创木酚生成醌类物质)对表达的漆酶进行鉴定。分泌于发酵液中的漆酶占 Pichia pastoris总的分泌蛋白的8%以上。实施例三步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,山梨醇 35g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达漆酶。其发酵参数为温度^ 30°C，pH5.0，搅拌转速200-900r/min。发酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化漆酶，通过蛋白电泳(在 SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够催化愈创木酚生成醌类物质)对表达的漆酶进行鉴定。分泌于发酵液中的漆酶占 Pichia pastoris总的分泌蛋白的5%以上。实施例四步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, C0Cl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达漆酶。其发酵参数为温度^ 30°C，pH5.0，搅拌转速200-900r/min。发酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化漆酶，通过蛋白电泳(在 SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够催化愈创木酚生成醌类物质)对表达的漆酶进行鉴定。分泌于发酵液中的漆酶占 Pichia pastoris总的分泌蛋白的6%以上。实施例五步骤1、2、3同实施例一。4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，乳酸 30g，蛋白胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达漆酶。其发酵参数为温度^ 30°C，pH5.0，搅拌转速200-900r/min。发酵1 2d后离心收获上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化漆酶，通过蛋白电泳(在 SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合漆酶的分子量)和酶活性(纯化的目标蛋白能够催化愈创木酚生成醌类物质)对表达的漆酶进行鉴定。分泌于发酵液中的漆酶占Pichia pastoris总的分泌蛋白的5%以上。
权利要求
1.一种用毕赤酵母PGAP调控表达漆酶的方法，其特征在于，其步骤是1)、首先从毕赤酵母中扩增PGAP启动子；2)、在漆酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控漆酶基因的由G418抗性基因作为筛选标记的毕赤酵母表达载体，将这一载体转化毕赤酵母基因组，并将转化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；3)从步骤幻的G418-YPD平板上再挑选毕赤酵母重组子作为工程菌株；4)、将步骤幻获得的工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于观 301在生物反应器中发酵工程菌1 2d分泌表达漆酶；所述液体培养基是由以下组分组成85%磷酸25 28ml/L、CaSO4 · 2Η200· 8 1. 2g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/L、K0H3. 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeast extract 8 12g/L、PTM4 3 5ml/ L ；所述 PTM4 是由以下组分组成=CuSO4 ‘ 5H20 2. 0g/L、NaI · 2H20 0. 1 g/L,MnSO4 · H2O 3. Og/ L^Na2MoO4 ·2Η20 0. 2g/L、H3BO3O. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl27. Og/L, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。
2.根据权利要求1所述的用毕赤酵母pGAP调控表达漆酶的方法，其特征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本发明公开了一种用毕赤酵母pGAP调控表达漆酶的方法，属生物技术领域，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控漆酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达漆酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的漆酶有利于产物的纯化，解决应用天然植物或天然的产漆酶的菌株生产漆酶的成本较高、产物难于纯化的问题，有利于漆酶的大规模生产。
文档编号C12N9/02GK102242084SQ20101018487
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者张添元, 张爱联, 杨穗珊, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所