专利名称：染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测液相芯片以及特异性引物的制作方法
染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测液相芯片以及特异性引物技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种染色体 9p21区段、KIF6基因SNP位点检测液相芯片以及特异性引物。
背景技术：
WTCCC于2007年对1拟6例患有冠心病/心肌梗塞或有严重家族史者和 四38名对照受试者的全基因组关联研究结果显示与冠心病相关性最大的多态性位 点rsl333049(G > C)位于9p21区域(P = 1. 80X10-14)。该研究结果于2008年经 在东亚人群中得到验证。2009于中国人群中得到证实。PR0VEIT-TIMI 22研究同样证 实rsl333049C等位基因携带者应用他汀强化治疗较他汀常规治疗获益更多。同时，与 冠心病相关的多态性位点还有 A22086055G (rsl0757274)、A22114477G (rsl0757278)、 A22105026G (rs2383206)、A22105959G (rs2383207)和 A22088619G (rs2891168)，此 5 个位点 均与 rsl333049(G22115503C)完全连锁。
KIF6 (Kinesin-like protein 6)编码驱动蛋白样蛋白_6，为分子动力超家族中的 一员。CARE、W0SC0PS 及 PROVE IT-TIMI 22 三项研究均表明，KIF6 基因 Trp719Arg (rs20455T > C)与冠脉事件的相关性。KIF6基因Trp719Arg多态性在高加索人群中达到60%，具 有719Arg多态性的人患冠心病(CHD)的风险增加55%。与非携带者相比(HR = 0. 94)， KIF6719Arg等位基因携带者应用他汀强化治疗较他汀常规治疗获益更多(HR = 0. 59)，强 化治疗使携带者发生冠脉事件的绝对危险降低10. 0%，非携带者仅降低0. 8%。
目前国内外关于心血管疾病风险的检测日渐增多，目前的产品一般基于PCR技术 的荧光定量PCR法、RFLP法和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺 点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。而染色体9p21区段SNP位点， 目前国内外几乎没有相关的检测产品。发明内容
本发明的目的之一是提供染色体9p21区段SNP检测液相芯片，该液相芯片 可用于检测染色体区段 9p21 的 G22115503C(rsl333049)、A22086055G(rsl0757274)、 A22114477G(rsl0757278)、A22105026G (rs2383206)、A22105959G (rs2383207)禾口 A22088619G(rs2891168)突变的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下
一种染色体9p21区段SNP检测液相芯片，主要包括有
(A)针对染色体9p21区段的SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每 条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物 是针对染色体 9p21 区段 G22115503C SNP 的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、A22086055G SNP 的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20、A22114477G SNP 的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、A22105026G SNP 的 SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、A22105959G SNP 的 SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO.洸、和 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28 ；所述 tag 序列 选自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 14 ；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述 anti-tag序列选自SEQID N0. 29 SEQ ID N0. 42中的序列，且所述anti-tag序列能相应 地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂 序列；
(C)用于扩增具有 G22115503C、A22086055G、A22114477G、A22105(^6G、 A22105959G和/或A22088619G SNP位点的染色体9p21区段目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为针对G22115503C SNP位点的SEQ ID N0. 45和SEQ ID N0. 46、针对 A22086055G SNP 位点的 SEQ ID N0. 47 和 SEQ ID N0. 48、针对 A22114477G SNP 位点的 SEQ ID N0. 49 和 SEQ ID N0. 50、针对 A22105(^6G SNP 位点的 SEQ ID N0. 51 和 SEQ IDN0. 52、针对 A 22105959G SNP 位点的 SEQ ID N0. 53 和 SEQ ID N0. 54、和 / 或针对 A22088619GSNP 位点的 SEQ ID N0. 55 和 SEQ ID N0. 56。
所述ASPE引物对为针对G22115503CSNP位点的由 SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 17 组成的序列以及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 18组成的序列、针对A22086055G SNP位点的 由SEQID N0. 5和SEQ ID N0. 19组成的序列以及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 20组成的 序列、针对A22114477G SNP位点的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 21组成的序列以及由SEQ ID N0. 8 和 SEQID N0. 22 组成的序列、针对 A 22105026G SNP 位点的由 SEQ ID N0. 9 和 SEQ ID N0. 23组成的序列以及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. M组成的序列、针对A 22105959G SNP位点的由SEQ IDN0. 11和SEQ ID N0. 25组成的序列以及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 26组成的序列、和/或针对A22088619G SNP位点的由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 27 组成的序列以及由SEQ ID N0. 14和SEQ ID N0. 28组成的序列。
本发明的另一目的是提供对染色体9p21区段和KIF6基因SNP同步检测的液相芯 片。该液相芯片可用于检测KIF6基因T2155C(rs20455)的野生型和突变型以及染色体区 段 9p21 的 G22115503C(rsl333049)、A22086055G(rsl0757274)、A22114477G(rsl0757278)、 A22105026G (rs2383206)、A22105959G (rs2383207)和 A22088619G (rs2891168)突变的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下
一种染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测的液相芯片，主要包括有
(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条 ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述tag 序列选自 SEQID NO. 1 SEQ ID N0. 14 ；
所述特异性引物是针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID N0. 17 禾口 SEQ IDN0. 18、A22086055G SNP 的 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 20、A22114477G SNP 的 SEQ IDN0. 21 和 SEQ ID N0. 22、A 22105026G SNP 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24、 A22105959GSNP 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26、和 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID N0. 27 和 SEQ IDN0. 28 ；以及
针对KIF6 基因 T2155C SNP 位点的 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 16 ；
(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述 anti-tag序列选自SEQID NO. 29 SEQ ID NO. 42中的序列，且所述anti-tag序列能相应 地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂 序列；
(C)用于扩增具有色体区段 9p21 的 G22115503C、A22086055G、A22114477G、 A22105026G, A22105959G 和 / 或 A22088619G 以及 KIF6 基因 T2155C SNP 位点的目标序列 的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为针对G22115503C SNP位点的SEQ ID NO. 45和SEQ ID NO. 46、针对 A 22086055G SNP 位点的 SEQ ID NO. 47 和 SEQ ID N0. 48、针对 A 22114477G SNP 位点的 SEQ ID N0. 49 和 SEQ ID N0. 50、针对 A22105(^6G SNP 位点的 SEQ ID N0. 51 和 SEQ IDN0.52、针对 A 22105959G SNP 位点的 SEQ ID N0. 53 和 SEQ ID N0. 54、和 / 或针对 A22088619GSNP 位点的 SEQ ID N0. 55 和 SEQ ID N0. 56 ；以及针对 KIF6 基因 T2155C 的 SEQ ID N0. 43 和 SEQID N0. 44。
优选地，所述ASPE引物对为针对G22115503C SNP位点的由SEQ ID N0. 3和SEQ IDN0. 17组成的序列以及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 18组成的序列、针对A 22086055G SNP位点的由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 19组成的序列以及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 20组成的序列、针对A22114477G SNP位点的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 21组成的 序列以及由SEQID N0. 8和SEQ ID N0. 22组成的序列、针对A22105(^6G SNP位点的由SEQ ID N0. 9和SEQ IDN0. 23组成的序列以及由SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. M组成的序列、 针对A22105959G SNP位点的由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 25组成的序列以及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 26组成的序列、和/或针对A22088619G SNP位点的由SEQ ID N0. 13 和SEQ ID N0. 27组成的序列以及由SEQ ID N0. 14和SEQ ID N0.沘组成的序列；以及针对 KIF6 基因 T2155C SNP 的由 SEQ IDN0. 1 和 SEQ ID N0. 15 组成的序列以及由 SEQ ID N0. 2 和SEQ ID N0. 16组成的序列。
优选地，上述所有液相芯片中所述间隔臂序列为5-10个T。
本发明的主要优点在于
1.本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100%。所制备的 KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片具有非常好的信号_噪声比，并且所设计的 探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的 选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的 并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别 的基因型。
3本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。
4本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同 时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强 的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增 强，检测结果更加准确可靠。
5.本发明的所述液相芯片的检测方法步骤简单，且七种SNPs检测可通过一步多 重PCR即可完成九个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过 程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分 析特征。
具体实施方式
实施例1 KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片，主要包括有
一、ASPE 引物
针对KIF6基因的SNP位T2155C (rs20455)，以及染色体9p21区段的SNP位 点 G22115503C(rsl333049)、A22086055G(rsl0757274)、A22114477G(rsl0757278)、A 22105026G (rs2383206)、A22105959G (rs2383207)和 A22088619G(rs2891168)，分别设计特 异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所 示
表1 ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种染色体9p21区段SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对染色体9p21区段的SNP位点设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是针 对染色体 9p21 区段 G22115503C SNP 的 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、A22086055G SNP 的 SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20、A22114477G SNP 的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、 A22105026G SNP 的 SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、A22105959G SNP 的 SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO.洸、和 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28 ；所述 tag 序列 选自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 14 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQID NO. 29 SEQ ID NO. 42中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增具有G22115503C、A22086055G、A22114477G、A22105(^6G、A22105959G 和 /或A22088619G SNP位点的染色体9p21区段目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的染色体9p21区段SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引 物为针对 G22115503C SNP 位点的 SEQ ID NO. 45 和 SEQ ID NO. 46、针对 A22086055G SNP 位点的 SEQ ID NO. 47 和 SEQ ID NO. 48、针对 A22114477G SNP 位点的 SEQ ID NO. 49 和 SEQ ID NO. 50、针对 A22105026G SNP 位点的 SEQ ID NO. 51 和 SEQ ID NO. 52、针对 A22105959G SNP 位点的 SEQ ID NO. 53 和 SEQ ID NO. 54、和 / 或针对 A22088619G SNP 位点的 SEQ ID NO. 55 和 SEQ IDN0. 56。
3.根据权利要求1所述的染色体9p21区段SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE弓丨 物对为由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 17组成的序列以及由SEQ IDN0. 4和SEQID NO. 18组 成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 19组成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQID NO. 20 组成的序列、由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 21组成的序列以及由SEQ ID N0. 8和SEQID N0. 22组成的序列、由SEQ ID N0. 9和SEQ ID N0. 23组成的序列以及由SEQ ID NO. 10和 SEQ ID N0. 24组成的序列、由SEQ ID NO. 11和SEQ ID N0. 25组成的序列以及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 26组成的序列、禾口 /或由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 27组成的序列 以及由SEQID N0. 14和SEQ ID N0. 28组成的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的染色体9p21区段SNP检测液相芯片，其特征是，所 述间隔臂为5-10个T。
5.一种染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测的液相芯片，其特征是，其主要包括有(A)针对每种基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对，每条ASPE引 物由5，端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成，所述tag序列选自 SEQID NO. 1 SEQ ID N0. 14 ；所述特异性引物是针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID N0. 17和 SEQ IDN0. 18、A22086055G SNP 的 SEQ ID N0. 19 和 SEQ ID N0. 20、A22114477G SNP 的 SEQ IDN0. 21 和 SEQ ID N0. 22、A 22105026G SNP 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID N0. 24、 A22105959GSNP 的 SEQ ID N0. 25 和 SEQ ID N0. 26、和 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID N0. 27 和 SEQ IDN0. 28 ；以及针对 KIF6 基因 T2155C SNP 位点的 SEQ ID N0. 15 和 SEQ ID N0. 16 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO. 29 SEQ ID NO. 42中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增含有染色体区段 9p21 的 G22115503C、A22086055G、A22114477G、 A22105026G, A22105959G 和 / 或 A22088619G 以及 KIF6 基因 T2155C SNP 位点的目标序列 的扩增引物。
6.根据权利要求5所述的染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测的液相芯片，其特征 是，所述扩增引物为针对G22115503C SNP位点的SEQ ID NO. 45和SEQ ID NO. 46、针对 A22086055G SNP 位点的 SEQ ID NO. 47 和 SEQ ID NO. 48、针对 A22114477G SNP 位点的 SEQ IDN0. 49 和 SEQ ID NO. 50、针对 A 22105026G SNP 位点的 SEQ ID NO. 51 和 SEQ ID NO. 52、 针对 A22105959G SNP 位点的 SEQ ID NO. 53 和 SEQ ID NO. 54、和 / 或针对 A22088619G SNP 位点的 SEQ ID NO. 55 和 SEQ ID NO. 56 ；以及针对KIF6 基因 T2155C 的 SEQ ID NO. 43 和 SEQ ID NO. 44。
7.根据权利要求5所述的染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测的液相芯片，其特征 是，所述ASPE引物对为由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 17组成的序列以及由SEQ ID NO. 4 和SEQID NO. 18组成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 19组成的序列以及由SEQ ID NO. 6和SEQID NO. 20组成的序列、由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 21组成的序列以及由SEQ ID NO. 8和SEQID NO. 22组成的序列、由SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 23组成的序列以及由 SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 24 组成的序列、由 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0. 25 组成的序 列以及由SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0.洸组成的序列、和/或由SEQ ID N0. 13和SEQ ID N0. 27组成的序列以及由SEQID N0. 14和SEQ ID N0. 28组成的序列；以及针对KIF6基因 T2155C SNP位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 15组成的序列以及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 16组成的序列。
8.根据权利要求5-7任一所述的染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测的液相芯片， 其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
9.一种用于检测染色体9p21区段SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有针对 染色体 9p21 区段 G22115503C SNP 的 SEQ ID N0. 17 和 SEQ ID N0. 18、A22086055G SNP 的 SEQ IDN0. 19 和 SEQ ID N0. 20、A22114477G SNP 的 SEQ ID N0. 21 和 SEQ ID N0. 22、 A22105026GSNP 的 SEQ ID N0. 23 和 SEQ ID NO. 24、A22105959G SNP 的 SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、禾口 / 或 A22088619G SNP 的 SEQ ID N0. 27 和 SEQ ID N0. 28。
全文摘要
本发明公开了一种染色体9p21区段SNP检测液相芯片和特异性引物，主要包括有ASPE引物对，每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性引物是针对染色体9p21区段G22115503C SNP的SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、A22086055G SNP的SEQID NO.19和SEQ ID NO.20、A22114477G SNP的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、A22105026G SNP的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、A22105959G SNP的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、和/或A22088619G SNP的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明还公开了染色体9p21区段和KIF6基因SNP检测液相芯片。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的KIF6基因和染色体9p21区段SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比。
文档编号C12N15/11GK102031286SQ20101019684
公开日2011年4月27日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者余刚, 曾涛, 秦会娟, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司