专利名称：Nppa基因snp检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种NPPA基 因SNP检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)属于利钠肽家族，ANP通过与受
体结合激活鸟苷酸环化酶，促进细胞内环鸟苷酸水平升高，从而发挥生物学功能。心 房利钠肽具有利钠、利尿、舒张血管平滑肌、抑制细胞增殖等多种作用，在维持血压、 水/钠平衡以及在心血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用。心房利钠肽的编码基因 (Natriuretic peptide precursor A, NPPA)位于染色体 Ip36，研究表明，NPPA 基因多态性 在哮喘和高血压发生进展过程中起着重要作用，此多态性位点包括位于外显子3中的 T2238C(rs5065)突变，此突变使第152位的精氨酸被苏氨酸取代(Argl52Ter)，发生在外 显子1中的G664A突变(rs5063)，此突变使第32位的蛋氨酸突变成缬氨酸(Met32Val)， 以及发生在3，非编码区的T85C突变，即rs5067 (A > G)。目前，检测NPPA突变的检测方法一般是基于PCR技术的RT-PCR、荧光定量 PCR, PCR-RFLP等，该技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由 于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供NPPA基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检 测NPPA基因三种常见基因型rs5063 (A > G)、rs5065 (Τ > C)和rs5067 (A > G)的野生
型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种NPPA基因SNP检测液相芯片，主要包括有(A)针对NPPA基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对 每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特 异性引物是针对rs5063SNP位点的SEQ IDN0.7和SEQ IDN0.8、针对rs5065SNP位点 的 SEQ IDN0.9 和 SEQ IDN0.10、禾口 / 或针对 rs5067SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO.12 ；所述 tag 序列选自 SEQID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag 序列选自SEQ IDN0.13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出具有rs5063、rs5065和/或rs5067的SNP位点的ADRBl基因 目标序列的扩增引物。优选地，所述扩增引物为针对rs5063SNP位点的SEQ ID NO.19和SEQ ID N0.20、针对 rs5065SNP 位点的 SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22、和 / 或针对 rs5067SNP位点的 SEQ ID N0.23 和 SEQ IDN0.24。 优选地，所述ASPE弓丨物对为针对rs5063SNP位点的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.7组成的序列以及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.8组成的序列、针对rs5065SNP位 点的由SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.9组成的序列以及由SEQ ID N0.4和SEQ ID NO. 10组 成的序列、禾日/或针对rs5067SNP位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID NO. 11组成的序列以 及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 12组成的序列。优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列 为5-10个T。本发明的另一目的是提供用于NPPA基因SNP检测的特异性引物。具体技术方案如下一种用于NPPA基因SNP检测的特异性引物，包括有针对rs5063SNP位点的 SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、针对 rs5065SNP 位点的 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID N0.10、 和 / 或针对 rs5067SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的液相芯片与测序法的结果吻合率高达100%。所制备的NPPA 基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列 之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与 具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别 的基因型。3.本发明的检测方法步骤简单，三种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成三 个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多 不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合 实际应用需要。5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺 陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目， 具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提 高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1 NPPA基因SNP检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对NPPA 基因的三种常见基因型 rs5063 (A > G)、rs5065 (Τ > C)和 rs5067 (A
>G)的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性 引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表INPPA基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种NPPA基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对NPPA基因的SNP位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每 种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成，所述特异性 引物是针对rs5063SNP位点的SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8、针对rs5065SNP位点的 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10、禾口 / 或针对 rs5067SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 SEQ ID N0.6 ；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序 列选自SEQID NO. 13 SEQ ID NO. 18中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中 所选的tag序列互补配对，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；(C)用于扩增出具有rs5063、rs5065和/或rs5067SNP位点的ADRBl基因目标序列 的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的NPPA基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述扩增引 物为针对 rs5063SNP 位点的 SEQ ID N0.19 和 SEQ ID N0.20、针对 rs5065SNP 位点的 SEQ ID N0.21 和 SEQ IDN0.22、禾Π / 或针对 rs5067SNP 位点的 SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24。
3.根据权利要求1所述的NPPA基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物 对为针对rs5063SNP位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7组成的序列以及由SEQ ID N0.2 和 SEQ IDN0.8 组成的序列、针对 rs5065SNP 位点的由 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.9 组成的序列以及由SEQID N0.4和SEQ ID NO. 10组成的序列、和/或针对rs5067SNP位 点的由SEQ ID N0.5和SEQ IDNO.ll组成的序列以及由SEQ ID N0.6和SEQ ID NO. 12组 成的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的NPPA基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述 间隔臂序列为5-10个T。
5.—种用于NPPA基因SNP检测的特异性引物，其特征是，包括有针对rs5063SNP 位点的 SEQID N0.7 和 SEQ ID N0.8、针对 rs5065SNP 位点的 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10、和 / 或针对 rs5067SNP 位点的 SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID N0.12。
全文摘要
本发明公开了一种NPPA基因SNP检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端针对SNP位点的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物是针对rs5063SNP位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、针对rs5065SNP位点的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、和/或针对rs5067SNP位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明所提供的液相芯片与测序法的结果吻合率高达100％。所制备的NPPA基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比。
文档编号C12Q1/68GK102010899SQ20101019684
公开日2011年4月13日 申请日期2010年6月8日 优先权日2010年6月8日
发明者余刚, 曾涛, 秦会娟, 许嘉森 申请人:广州益善生物技术有限公司